一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固定化脂肪酶法制備共軛亞油酸甘油酯的方法。采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯/乙酯與甘油為原料，固定化脂肪酶為催化劑，前期共軛亞油酸酯與甘油交替進料，有效地增加甘油與固定化酶的接觸幾率，增加反應效率，后期共軛亞油酸酯與甘油混合進料的方法制備共軛亞油酸甘油酯，由于游離脂肪酸與甘油反應生成水分子，有利于酶活的發(fā)揮，加快了反應效率，同時反應過程中利用充入氮氣或抽真空的方式在線脫甲醇或乙醇，大大縮短反應時間，整個制備過程無需添加任何有機試劑，不會帶來任何有機溶劑的殘留。與已知的甘油酯的制備方法相比，本發(fā)明的方法更簡單、成本更低、得到的共軛亞油酸甘油酯產品品質更高，適合工業(yè)化生產。
【專利說明】一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用固定化脂肪酶制備共軛亞油酸甘油酯的方法。
【背景技術】
[0002]共輒亞油酸(Conjugatedlinoleic acids,簡稱CLA)是亞油酸(Linoleic acids,簡稱LA)分子的幾種立體和位置異構體的通稱，是一系列含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸。CLA的雙鍵在碳鏈上主要有四種位置的排列方式:8，10-、9，11-、10，12-和11，13_，且由于共軛雙鍵兩端的碳原子都具有順式(cis)和反式(trans)兩種幾何構型，即每種位置異構又具有cis-cis、cis-trans、trans-cis、trans-trans四種幾何異構體，所以CLA異構體的種類眾多。其中c9，111-CLA和tlO，C12-CLA是含量最多且已經被證實具有生理活性的兩種主要異構體。天然的CLA主要存在于瘤胃動物如牛、羊的乳脂及肉制品中，每克乳脂中含量從2~25mg不等，并主要以c9，tll_CLA異構體的形式存在。在天然的植物種子中，并不存在具有生理活性的c9，111-CLA和tlO，C12-CLA這兩種異構體。無論是從動物來源還是植物來源中，人們都無法從直接大量獲取CLA。
[0003]共軛亞油酸(CLA )具有明顯的抗癌作用，對胃癌、乳腺癌、腸癌、皮膚癌和前列腺癌有明顯的抑制作用。CLA具有抗動脈硬化、降低血脂及調節(jié)血壓的作用。CLA能有效地發(fā)揮“血管清道夫”的作用。可清除血管中的垃圾。有效調節(jié)血液粘稠度，達到舒張血管，改善微循環(huán)，平穩(wěn)血壓的作用。同時CLA具有抗氧化、抗疲勞作用、免疫調節(jié)及減肥增肌等生理活性被越來越多的國內外 科研和醫(yī)療機構關注。由于CLA無毒，無用量上限，CLA產品的開發(fā)將在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中得到廣泛的應用。
[0004]多不飽和脂肪酸作為保健食品已經產業(yè)化，但其產品形式主要為乙酯型和游離脂肪酸型，研究結果表明，多不飽和脂肪酸在人體中不僅消化和吸收比較困難，而且可能存在安全隱患；游離型多不飽和脂肪酸易于被人體消化和吸收，但易氧化產生對人體有害的過氧化物，直接食用難以被人們接受；甘油酯型是其天然存在形式，易于被人體消化和吸收，且不存在安全性問題，因此甘油酯型多不飽和脂肪酸是作為食用的最好產品形式，其中尤以三甘酯為最理想的形式。
[0005]目前，用于制備高CLA含量的甘油酯的方法主要有傳統(tǒng)化學法和生物酶法。傳統(tǒng)化學法存在反應溫度高，對設備腐蝕嚴重，產品色澤差等缺點；而酶催化法由于具有特異的選擇性，具有反應條件溫和及對環(huán)境友好等優(yōu)點，在油脂工業(yè)中的應用日益受到人們的青睞。
[0006]脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類特殊的?；饷?，多被用來催化一些酯類合成和轉化反應。脂肪酶是作為重要的工業(yè)酶制劑品種之一，廣泛應用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)，具有其他酶蛋白無法比擬的優(yōu)點?？梢岳弥久复呋セ?、酯交換反應將CLA結合到甘油骨架上，但是一般的游離脂肪酶在無溶劑體系中催化反應活性低并且難以回收，會造成產品分離困難以及成本的增加。目前用于此方面的固定化脂肪酶多為NOVOZym435，這是一種來源于南極假絲酵母的脂肪酶，但脂肪酶NOVOZym435的價格昂貴，這是制約其應用的最重要因素。
[0007]專利US20030175914利用固定化酶(Novozym435)催化共軛亞油酸乙酯與甘油或者甘油酯進行反應，在添加有機試劑(甲苯，二氧雜環(huán)環(huán)己烷)及真空度比較大的條件下，反應l_7h，生成的三甘酯含量為84-90%。此工藝存在的問題是有機溶劑毒性大、易殘留在產品中，同時有機溶劑揮發(fā)性較大造成生產成本較高。
[0008]專利CN200710030862.9利用固定化酶(Novozym435)在正己烷存在下，催化甘油與ω-3多不飽和脂肪酸游離脂肪酸酯化反應制備三甘酯，反應24h，甘油三酯含量為甘油酯量的31%，此工藝反應時間比較長，產率比較低。此工藝存在的問題是整個工藝過程耗時較長，易造成產物氧化，降低產品品質，增加成本。
[0009]專利CN200810196271.3是通過化學法與酶法結合的方法進行制備甘油酯，首先利用化學法水解魚油，然后利用固定化酶(Novozym435)在正己燒存在下,催化甘油與水解產物多不飽和脂肪酸進行酯化反應制備甘油酯，利用分子篩除去反應中生成的水，反應48h，甘油三酯含量為90%以上。此工藝存在的問題是有機溶劑毒性大、易殘留在產品中，同時有機溶劑揮發(fā)性較大造成生產成本較高。
[0010]專利CN200810162265.6采用多不飽和脂肪酸游離脂肪酸與甘油進行脂肪酶(Novozym435)催化反應制備n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)甘油酯,添加1,4-二氧六環(huán)。反應2-4h，酯化率達到50%，甘油三酯含量占10-20%。用到的添加劑會在最終產品中殘留，同時工藝中用到分子篩，不易重復利用，增加了反應成本。此外，該工藝存在的問題是有機溶劑毒性大、易殘留在產品中，同時有機溶劑揮發(fā)性較大造成生產成本較高。
[0011]專利CN200820168426.8設計了一套新型的制備甘油酯產品的裝置，酶層析柱與分子篩柱為一組反應器， 進行酶催化，可以實現(xiàn)幾組反應器串聯(lián)的連續(xù)化反應設備。同時利用有機溶劑(1，4-二氧六環(huán))對物料進行混勻。但沒有具體的實驗數據支撐。此工藝存在的問題是有機溶劑毒性大、易殘留在產品中，同時有機溶劑揮發(fā)性較大，造成生產成本較高。
[0012]通過以上專利對比分析可以看出，由于脂肪酸和甘油難于形成均一反應體系，往往需要選用適宜的有機溶劑體系的同時加強攪拌。但能擴大到商業(yè)規(guī)模的很少，原因是有機溶劑的毒性、揮發(fā)性和昂貴的價格。無溶劑體系酶促反應不僅解決了有機溶劑的毒性或表面活性劑問題，而且減少了純化過程的許多步驟，大大降低了對環(huán)境的污染，有很好的應用前景。同時無溶劑體系為反應提供了與傳統(tǒng)溶劑不同的新的分子環(huán)境，有可能使反應的選擇性或轉化率得到提高。在脂肪酶催化的酯交換反應和酯合成反應中，常使用無溶劑體系。但是，無溶劑體系也存在較大的問題。例如專利CN201010147162利用多不飽和脂肪酸乙酯與甘油進行酶催化反應，真空脫除乙醇促使反應進行，不添加任何有機溶劑，反應300h，甘油三酯含量為甘油酯的80%以上。但是可以看出，無溶劑體系反應時間比較長，不利于工業(yè)化生產。
[0013]產品化的共軛亞油酸甘油酯的制備大部分是化學法，起始原料為共軛亞油酸乙酯及甲酯，制備共軛亞油酸乙酯及甲酯是通過紅花油與甲醇酯酯交換得到亞油酸甲酯產品，然后通過堿性催化劑催化共軛化后，得到共軛亞油酸乙酯及甲酯，物料中含有部分皂化的游離脂肪酸，需要進行去酸值得到酸值< I的物料才能進行酯交換反應，工序繁瑣，影響產品品質。
【發(fā)明內容】

[0014]本發(fā)明提供一種利用固定化脂肪酶催化共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯與甘油反應制備共軛亞油酸甘油酯型產品的方法，目的是提供一種反應時間比較短，利于工業(yè)化生產的無溶劑體系的生物酶法制備共軛亞油酸甘油酯型產品的方法。本發(fā)明的方法是以具有酸值的共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯和甘油為起始料，固定化脂肪酶為催化劑，采用在制備工藝的前期甘油與共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯交替進料，后期甘油與共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯混合進料的工藝。與已知的酶法制備甘油酯的工藝相比，此工藝更簡單、成本更低、得到的共軛亞油酸甘油酯產品品質更高，適合工業(yè)化生產。
[0015]本發(fā)明是以如下的技術方案來實現(xiàn)的。
[0016]一種制備共軛亞油酸甘油酯的方法，包括以下步驟:
[0017](I)物料罐中加入含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯原料與甘油，靜置分層，預熱至65-85 0C ；
[0018](2)將在物料罐上層的共軛亞油酸酯與在物料罐下層的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應柱中，分別勻速循環(huán)；
[0019](3)將步驟(2)的物料罐中物料，混合均勻，勻速泵入步驟(2)的酶反應柱中，酶催化反應20-30h，收集反應產物；
[0020]其中，所述共軛亞油酸酯原料中所述的共軛亞油酸酯為共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯；在步驟(3)所述的酶催化反應過程中物料罐物料連續(xù)通入氮氣或者抽真空，脫除甲醇或乙醇。
[0021]本發(fā)明所述固定化脂肪酶是 申請人:申請的專利CN103224926A中所述的方法制備。具體為，所述的固定化脂肪酶來源于南極假絲酵母(C.Antarctica)、產堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)、曼赫根毛霉(R.miehei)。制備固定化脂肪酶時,將含脂肪酶、水溶性蛋白以及糖類化合物的液體介質吸附于載體，載體可以為高分子有機合成材料，主要有Amberlite XAD761、Amberlite XAD7HP、Amberlite XAD16、Amberlite XAD1600、ES-1 環(huán)氧樹脂。然后通過交聯(lián)劑將脂肪酶連接至載體上，不易脫落。交聯(lián)劑可以是聚乙烯亞胺，碳化二亞胺、聚丙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、戊二醛、丁二醛、對苯二醛中的一種。再加入適當濃度的包埋劑，包埋劑可以選擇阿拉伯膠、海藻酸鈣、聚乙二醇、聚乙烯醇、酪蛋白酸鈉和明膠中的一種，使吸附的脂肪酶更緊密的結合于載體上，使其不易泄露，增加酶活性，提高重復使用次數。
[0022]本發(fā)明的技術方案中，所述的固定化脂肪酶的含水量控制在1_10%。
[0023]本發(fā)明的技術方案中，所述的固定化脂肪酶可以循環(huán)利用100次以上，每次更換新的物料，只需用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯浸潤即可。
[0024]本發(fā)明的技術方案中，所述的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯所含游離脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、共軛亞油酸的混合物，游離脂肪酸的質量百分含量優(yōu)選為0-15%，更優(yōu)選為5-15%，最優(yōu)選為5-10%。所述的共軛亞油酸(CLA)，由四種異構體組成，其中順9，反11 (“c9，til”) -CLA和反10，順12 (“tlO，cl2”) -CLA含量為80%及以上，其它的異構體反9，反11 (“t9，til”)-CLA與反10，反12 (“tlO，tl2”)_CLA的含量≤1%。
[0025]本發(fā)明采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料進行制備甘油酯反應。技術人員在實踐中，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，含有少量游離脂肪酸的共軛亞油酸酯比不含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯反應效率更高，分析認為，含有游離脂肪酸的共軛亞油酸酯在反應中能夠產生部分水分子，對固定化脂肪酶起到潤滑作用，有利于酶活的發(fā)揮，加快了反應效率。這一應用克服了通常認為的必須采用不含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯制備共軛亞油酸甘油酯的技術偏見。同時，這一應用與通常的技術相比，既省去了反應前使用硫酸氫鈉等二次酯化去酸值的過程，也省去了其后水洗去除中和產物以及雜質的步驟，大大減少了反應時間，簡化了反應步驟，減少了反應最終產物雜質含量，在本領域中尚未見采用含有部分游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或乙酯為原料，制備共軛亞油酸甘油酯。
[0026]本發(fā)明的技術方案中，步驟(1)中所述的共軛亞油酸酯與甘油的摩爾比為3-5:1。
[0027]本發(fā)明的技術方案中，步驟(3)所述的酶催化反應溫度優(yōu)選為35_60°C，即在整個反應過程中酶反應柱溫度要控制在35_60°C。
[0028]本發(fā)明的技術方案中，所述的固定化脂肪酶的使用量為共軛亞油酸酯質量的5-10%ο
[0029]上述制備方法的步驟(2)為反應第一階段，在優(yōu)選的技術方案中，反應起始5-10h進行交替進料，即①將共軛亞油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；②將甘油泵入酶反應柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)反復步驟①~②5-10h ;其中步驟①和②中，物料循環(huán)速率為0.5-3ml/min，最優(yōu)的流速控制在1-2.5ml/min。在【具體實施方式】中，也可以首先用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯對固定化酶進行浸潤10_20min，然后對共軛亞油酸甲酯或者乙酯與甘油進行交替進料，進料順序任意。反應起始階段，體系中 沒有單甘脂，物料的混合效果不好，形成的是水包油的體系，固定化酶接觸共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯的幾率遠遠大于甘油，導致反應效率比較慢，采用共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯與甘油交替進料，可以有效地增加甘油與固定化酶的接觸機率，增加反應效率。反應體系中產生一定量的單甘脂后，反應體系中物料在單甘脂乳化作用下，形成均一體系，反應效率提高。
[0030]上述制備方法的步驟(3)為反應第二階段，在優(yōu)選的技術方案中，在步驟(2)中，物料通過恒流泵循環(huán)于物料罐與酶反應柱后，被收集在物料罐中的物料攪拌混合均勻，攪拌速率為100-200rpm/min,通過恒流泵勻速,速度控制在0.5-3ml/min,最優(yōu)的流速控制在1-2.5ml/min，將物料液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應柱中酶催化合成甘油酯反應。
[0031]在優(yōu)選的技術方案中，所述酶催化反應的溫度為35_60°C，優(yōu)選為40_60°C，更優(yōu)選為 45-55 °C。
[0032]本發(fā)明的共軛亞油酸甘油酯的制備方法，在酶催化反應過程中產生的反應副產物為甲醇或乙醇，本發(fā)明采用在整個酶催化反應過程中不斷通入氮氣或者抽真空的方式除去甲醇或乙醇，其中氮氣流量控制在0.1-1.0L/min,抽真空的負壓控制在0.3-1.0Mpa,以保證在最少的能源與物料消耗的前提下，去除反應副產物。另一方面，甲醇、乙醇的沸點分別為64.6578.4°C，本發(fā)明將反應物料的混合溫度控制在65_85°C可以更好的去除甲醇或乙醇，加快反應速度，提高反應效率。
[0033]本發(fā)明的方法制備得到的共軛亞油酸甘油酯，色澤淺淡，除c9，tllCLA和tlO，cl2CLA活性異構體以外的其它共軛亞油酸異構體不增長，產品中共軛亞油酸甘油單酯質量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質量百分含量為75-90%。[0034]本發(fā)明中，共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯的共軛亞油酸甘油酯酯化率均達70-90%ο
[0035]本發(fā)明的總反應時間為25_40h，縮短到以往技術300h的反應時間的8_13%，大大縮短了反應時間，有利于工業(yè)化生產。
[0036]本發(fā)明的制備共軛亞油酸甘油酯的方法，也適用于其它多不飽和脂肪酸甘油酯的制備。
[0037]本發(fā)明的有益效果:
[0038](I)本發(fā)明的制備方法，直接利用固定化脂肪酶催化共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料與甘油反應制備共軛亞油酸甘油酯。工藝中以含有游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯為原料省去了共軛亞油酸甲酯或者共軛亞油酸乙酯的去酸值的前處理工藝，同時整個工藝中不添加任何有機試劑，省去了其后水洗去除中和產物以及雜質的步驟，也省去了后續(xù)分離純化的繁瑣工序，大大減少了反應時間，簡化了反應步驟，減少了反應最終產物雜質含量，提高了產品的品質，降低了生產成本。
[0039](2)本發(fā)明中使用的固定化脂肪酶成本低廉,約是脂肪酶Novozym435價格的1/3,重復利用率高，后續(xù)處理簡單，大大節(jié)省了成本，利于工業(yè)化生產。
[0040](3)本發(fā)明利用升高物料溫度，同時沖入低流量的氮氣除去生成的甲醇或者乙醇，此工藝脫除副產物的條件簡單，易于實驗，成本低，易于工業(yè)化。
[0041](4)本發(fā)明制 備得到的共軛亞油酸甘油酯色澤淺淡，除c9，tll-CLA和tlO，cl2-CLA活性異構體以外的其它共軛亞油酸異構體不增長，產品中，共軛亞油酸甘油單酯的質量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質量百分含量為75-90%。
【具體實施方式】
[0042]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學試劑公司購買。
[0043]本發(fā)明所述固定化脂肪酶是我公司申請的專利CN103224926A中所述的方法制備。
[0044]在下述實施例中使用的固定化脂肪酶是專利CN103224926A中公開的實施例4中制備的固定化脂肪酶。
[0045]酶反應柱的準備:下述實施例中使用的酶反應柱為帶加熱套的玻璃層析柱，反應柱的規(guī)格為:長度20cm，直徑1.6cm。酶反應柱與恒流泵相連接。反應液在反應過程中勻速流經恒流泵然后進入酶反應柱中，反應液在物料罐和酶反應柱中勻速循環(huán)。在下述實施例中，進行物料罐上層的共軛亞油酸循環(huán)時，由上層低端出料循環(huán)回到共軛亞油酸層，避免與下層的甘油混合。同樣，進行物料罐上層的甘油循環(huán)時，由下層的低端出料循環(huán)回到下層的甘油層，避免與下層的甘油混合。
[0046]裝柱方法:將固定化脂肪酶以干法裝住的方式進行填充，裝柱時先利用固定化脂肪酶自然沉降入柱中，然后用轉換頭將其壓實。
[0047]原料:含游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯原料由下述方法制備:[0048]①將紅花籽油、甲醇和氫氧化鈉投入到反應釜中，紅花籽油與甲醇的投料摩爾比為1:3.5，氫氧化鈉的加入量為紅花籽油質量的20-30%，氮氣置換后在200°C條件下攪拌反應7h ；
[0049]②反應產物酸化至pH為2，攪拌，靜置，分離出油相產物，水洗至近中性，減壓脫水，得到共軛亞油酸初產物；
[0050]③將共軛亞油酸初產物與甲醇或乙醇以摩爾比1:6混合，加入共軛亞油酸質量的7%的硫酸氫鈉或硫酸氫鉀，80°C條件下反應7h ;生成酸值≤30mg KOH/g的共軛亞油酸甲酯或乙酷；
[0051]④將步驟③的產物加入其質量1%的活性白土及其質量1%的活性炭，在75°C攪拌
1.5h后過濾；
[0052]⑤步驟④所得濾液于175 °C，真空度20Pa條件下進行分子蒸餾分離純化得含有0-30%游離酸共軛亞油酸甲酯產品。
[0053]在上述步驟①-⑤中，當步驟③的反應時間為7h時，得到含有1%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產品。
[0054]在上述步驟①-⑤中，當步驟③的反應時間為4h時，得到含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產品。
[0055]在上述步驟① -⑤中，當步驟③的反應時間為2.5h時，得到含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產品。
[0056]在上述步驟①-⑤中，當步驟③的反應時間為Ih時，得到含有15%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯產品。
[0057]本發(fā)明采用高效液相色譜測定共軛亞油酸產品中所含的組分及其含量，測定條件為:色譜柱為018柱(4.611111^25011111^5 4 111)，流動相為丙酮與乙腈混合物(丙酮:乙腈=70:30 (v/v)),流速為 lml/min,檢測波長為 210nm。
[0058]實施例1
[0059](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在45°C ；
[0060](2)將含有1%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3:1投入至物料罐里，預熱至6511C ；
[0061](3)將步驟(2)中的物料攪拌混合均勻，進行攪拌速度為100rpm/min,混合均勻的料液通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，在45°C、連續(xù)反應35h，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的共軛亞油酸甲酯，得到最終產物。
[0062]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0063]實施例2
[0064](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在45°C ；
[0065](2)將含有0%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3:1投入至物料罐里，靜置，反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至65°C ；
[0066]( 3 )將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應8h,停止循環(huán)；[0067](4)將步驟(3)中物料罐中的反應液攪拌混合均勻，攪拌速度為100rpm/min，混合均勻的料液通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，在45°C、連續(xù)反應20h，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的共軛亞油酸甲酯，得到最終產物。
[0068]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0069]實施例3
[0070]( 1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在50°C ；
[0071](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3.5:1投入至物料罐里，靜置，反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至65°C ；
[0072](3 )將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應8h，停止循環(huán)；
[0073](4 )將步驟(3 )中物料罐中的反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在50°C、酶催化反應20h，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯得到最終產物。
[0074]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0075]實施例4
[0076](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在55°C ；
[0077](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比3.5:1投入至物料罐里，靜置，反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至65°C ；
[0078](3)將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應8h，停止循環(huán)；
[0079](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在55°C、酶催化反應20h，其中在酶催化反應的過程中同時通入氮氣，氮氣流量為0.51/min。反應完畢后，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯，得到最終產物。
[0080]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0081]實施例5
[0082](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在60°C ；
[0083](2)將含有5%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至80°C ；
[0084]( 3 )將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應8h，停止循環(huán)；
[0085](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在60°C、酶催化反應20h，其中在酶催化反應的過程中同時通入氮氣，氮氣流量為0.11/min。反應完畢后，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯，得到最終產物。
[0086]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0087]實施例6
[0088](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在60°C ；
[0089](2)將含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至75°C ；
[0090]( 3 )將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應8h，停止循環(huán)；
[0091 ] (4 )將步驟(3 )的物料罐中反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在60°C、酶催化反應20h，其中在酶催化反應的過程中同時通入氮氣，氮氣流量為0.51/min，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯，得到最終產物；
[0092]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0093]實施例7
[0094](I)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在50°C ；
[0095](2)將含有15%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至75°C ；
[0096]( 3 )將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應9h，停止循環(huán)；
[0097](4 )將步驟(3 )的物料罐中的反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3 )的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在50°C、酶催化反應20h，其中在酶催化反應的過程中同時通入氮氣，氮氣流量為0.31/min,反應完畢后，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯，得到最終產物。
[0098]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0099]實施例8
[0100](1)將2.4g固定化脂肪酶填充在酶反應柱中，酶反應柱的溫度保持在55°C ；
[0101](2)將含有10%游離脂肪酸的共軛亞油酸甲酯與甘油按摩爾比4:1投入至物料罐里，靜置反應液分兩層，其中上層為共軛亞油酸甲酯，下層為甘油，反應液預熱至85°C ；
[0102](3)將連接恒流泵的進樣管通入在反應液上層的共軛亞油酸甲酯料底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次后，將進料管通入到在反應液下層的甘油層底端，通過恒流泵泵入酶反應柱中，流速為0.5ml/min，循環(huán)兩次，以此反復交替進料反應10h，停止循環(huán)；
[0103](4)將步驟(3)的物料罐中的反應液攪拌均勻，通過恒流泵泵入步驟(3)的酶反應柱中，反應液攪拌速度為100rpm/min，流速為0.5ml/min，在55°C、酶催化反應16h，反應過程中抽真空，真空負壓為0.6Mpa，反應完畢后，收集反應產物，在175°C下，20Pa進行分子蒸餾除掉過量的甲酯得到最終產物。
[0104]最終產物經高效液相色譜測定其組成及含量，結果如表1所示。
[0105]在實施例8的反應條件下，固定化酶能夠被循環(huán)利用50次，酶活損失< 10%。
[0106]在實施例6的反應條件下，固定化酶能夠被循環(huán)利用40次，酶活損失< 10%。
[0107]表1.反應產物組成及其在反應產物中的含量
【權利要求】
1.一種酶法制備共軛亞油酸甘油酯的方法，包括以下步驟: (1)物料罐中加入含游離脂肪酸的共軛亞油酸酯原料與甘油，靜置分層，預熱至65-85 0C ； (2)將在物料罐上層的共軛亞油酸酯原料與在物料罐下層的甘油交替泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應柱中，分別勻速循環(huán)； (3)將步驟(2)的物料罐中物料，混合均勻，勻速泵入步驟(2)的酶反應柱中，酶催化反應20-30h，收集反應產物； 其中，所述共軛亞油酸酯原料中所述的共軛亞油酸酯為共軛亞油酸甲酯或共軛亞油酸乙酯；在步驟(3)所述的酶催化反應過程中充入氮氣或者抽真空，脫除甲醇或乙醇。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的游離脂肪酸在共軛亞油酸酯原料中的質量百分含量為0_15%。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的共軛亞油酸酯與甘油的摩爾比為3-5:1。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化脂肪酶的使用量為共軛亞油酸酯質量的5-10%。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)包括如下過程:①將共軛亞油酸酯泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；②將甘油泵入酶反應柱中，勻速循環(huán)1-3次，停止循環(huán)；③反復步驟①~②5-10h ;其中步驟①和②中，物料循環(huán)速率均為0.5-3ml/min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氮氣流量為0.l-1.0L/min，抽真空的負壓為0.3-1.0Mpa0
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的酶催化反應溫度為35-60。。。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的反應產物中共軛亞油酸甘油單酯的質量百分含量為0-1%，共軛亞油酸甘油二酯的質量百分含量為1_20%，共軛亞油酸甘油三酯的質量百分含量為75-90%。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，共軛亞油酸酯的共軛亞油酸甘油酯酯化率為 70-90%。
【文檔編號】C12P7/64GK103849659SQ201410123647
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權日:2014年3月28日
【發(fā)明者】吳文忠, 楊大蘋, 伏萃翠, 徐維鋒, 姜書華, 洪永德 申請人:大連醫(yī)諾生物有限公司