一種以固定化脂肪酶為催化劑的耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種以固定化脂肪酶為催化劑，耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的方法。該方法為：用有機酸中和甲酯或乙酯共軛化料至pH7.5-9，與少量水形成均一乳化體系，以固定化脂肪酶為催化底物進行水解制備共軛亞油酸，所述共軛化料是含亞油酸80%以上的紅花籽油，經(jīng)堿催化異構(gòu)化而制備得到。乳化體系的應(yīng)用大大縮短了反應(yīng)時間，提高了甲酯/乙酯共軛化料的水解效率，減少了水的用量，利于工業(yè)化的應(yīng)用。本發(fā)明，在制備步驟中未引入其它乳化劑，不會帶來后續(xù)的分離純化的困難及乳化劑殘留對品質(zhì)產(chǎn)生影響，也不會因為分離純化而造成產(chǎn)品損失。同時催化過程中用到的固定化脂肪酶能夠重復(fù)循環(huán)利用100次，酶活降低≤5%，大大降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種以固定化脂肪酶為催化劑的耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種共軛亞油酸的制備方法，尤其涉及一種以固定化脂肪酶為催化劑的耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]共輒亞油酸(Conjugatedlinoleic acids,簡稱CLA)是亞油酸(Linoleic acids,簡稱LA)分子的幾種立體和位置異構(gòu)體的通稱，是一系列含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸。CLA的雙鍵在碳鏈上主要有四種位置的排列方式:8，10-、9，11-、10，12-和11，13_，且由于共軛雙鍵兩端的碳原子都具有順式(cis)和反式(trans)兩種幾何構(gòu)型，即每種位置異構(gòu)又具有cis-cis、cis-trans、trans-cis、trans-trans四種幾何異構(gòu)體，所以CLA異構(gòu)體的種類眾多。其中c9，tll-CLA和tlO，C12-CLA是含量最多且已經(jīng)被證實具有生理活性的兩種主要異構(gòu)體。天然的CLA主要存在于瘤胃動物如牛、羊的乳脂及肉制品中，每克乳脂中含量從2-25mg不等，并主要以c9，tll-CLA異構(gòu)體的形式存在。在天然的植物種子中，并不存在具有生理活性的c9，tll-CLA和tlO，C12-CLA這兩種異構(gòu)體。無論是從動物來源還是植物來源中，人們都無法從直接大量獲取CLA。
[0003]共軛亞油酸(CLA )具有明顯的抗癌作用，對胃癌、乳腺癌、腸癌、皮膚癌和前列腺癌有明顯的抑制作用。CLA具有抗動脈硬化、降低血脂及調(diào)節(jié)血壓的作用。CLA能有效地發(fā)揮“血管清道夫”的作用?？汕宄苤械睦?。有效調(diào)節(jié)血液粘稠度，達到舒張血管，改善微循環(huán)，平穩(wěn)血壓的作用。同時CLA具有抗氧化、抗疲勞作用、免疫調(diào)節(jié)及減肥增肌等生理活性被越來越多的國內(nèi)外科研和醫(yī)療機構(gòu)關(guān)注。由于CLA無毒，無用量上限，CLA產(chǎn)品的開發(fā)將在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]商業(yè)化的CLA產(chǎn)品混合物含有等量的c9，tll-CLA和tlO，cl2_CLA，還有微量的t9，til和tlO，tl2-CLAs。t9，til和tlO，tl2_CLAs具有致癌作用、增加患糖尿病及心腦血管方面疾病的風(fēng)險，所以控制此異構(gòu)體的含量是衡量CLA品質(zhì)的主要指標(An Philippaerts等，2011)。異構(gòu)體t9，til和tlO，tl2-CLAs含量的變化主要與反應(yīng)溫度有關(guān)，高溫會使得異構(gòu)體 t9, til 和 tlO, tl2_CLAs 含量大幅增加(Pierre Juaneda 等,2003)。
[0005]共軛亞油酸的制備大部分是化學(xué)法，其制備過程是通過紅花油與甲醇或者乙醇酯交換得到亞油酸甲酯或者乙酯產(chǎn)品(CN200710010361.4)，然后通過堿性催化劑催化共軛化后得到甲酯或者乙酯共軛化料，之后進行皂化、酸化、水洗物料得到共軛亞油酸，進一步蒸餾得到最終產(chǎn)品。整個制備工序繁瑣，共軛化、酸化、水洗物料時都會引起t9，til和tlO，tl2-CLAs的增長，尤其是高溫不僅會引起t9，til和tlO，tl2_CLAs的增長，還會影響產(chǎn)品的色澤，這些都會直接影響產(chǎn)品品質(zhì)。
[0006]酶催化水解油脂制備自由酸法由于具有反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好等優(yōu)點，在油脂工業(yè)中的應(yīng)用日益受到人們的青睞。脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類特殊的酰基水解酶，多被用來催化一些酯類合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)。脂肪酶是作為重要的工業(yè)酶制劑品種之一，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)，具有其他酶蛋白無法比擬的優(yōu)點。而在實際應(yīng)用中游離脂肪酶受環(huán)境PH，有機溶劑，高溫的影響很容易喪失它的催化活性，而且難以回收再利用，固定化是一種提高酶穩(wěn)定性的有效方法，同時還有利于酶的循環(huán)使用和產(chǎn)物的分離純化。
[0007]酶促反應(yīng)需要一定的水存在，發(fā)明專利CN200710118466.1利用諾維信脂肪酶(Novozym435與Lipozyme RM)進行水解蓖麻油制備蓖麻酸,對比了不同油水的質(zhì)量比由
I: I增加至1:20水解效率由60%增加至96%，反應(yīng)時間為10-30h。利用有機試劑促進油水混合進而提高酶催化水解效率(Takashi等，2012)，選擇親水有機試劑叔醇可以大幅提高反應(yīng)效率，10天水解效率達到70%左右。但反應(yīng)時間仍然很長，水解效率不高，無法進行工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明專利CN200910098113.9利用固定化脂肪酶一選擇性透水膜生物反應(yīng)器，油膜走膜組件管程，水則以反方向走膜組件的殼程，水透過膜提供酶促反應(yīng)所需要的水分，同時固定化脂肪酶催化油脂水解。但因為采用了透水膜，成本被迫大幅提高，而且該膜循環(huán)利用度低，未見應(yīng)用實例。發(fā)明專利CN200910097896.9由靜電紡絲制備纖維素超細纖維膜，利用偶聯(lián)試劑將脂肪酶固定于纖維膜上，進行油脂水解。這種膜的固定化工藝可能同樣會存在成本高，固定化酶循環(huán)利用率低的問題。專利US20050170477A1利用脂肪酶水解共軛亞油酸短鏈酯，反應(yīng)過程中抽真空除去短鏈醇,反應(yīng)48h，水解效率達到98%以上，反應(yīng)時間比較長。專利CN200810110995.1利用脂肪酶在乳化劑存在下進行水解反應(yīng)，水解36h以上，水解率達到90%以上,但酶催化油脂水解時間比較長,后續(xù)分離比較麻煩。
[0008]通過以上專利及文章的對比分析可以看出，化學(xué)法制備共軛亞油酸工序繁瑣，產(chǎn)品品質(zhì)較低，而且對環(huán)境有不利影響。利用固定化脂肪酶水解油脂的反應(yīng)效率不高，主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化率與反應(yīng)時間上，普遍反應(yīng)時間比較長，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)。以上專利中利用的酶催化底物-共軛亞油酸甲酯，基本上是酸化水洗，蒸餾后的產(chǎn)品，此種處理工藝步驟復(fù)雜，蒸餾過程中易引起非 必需異構(gòu)體含量的增長，且成本較高。以上專利基本并未闡述固定化脂肪酶循環(huán)利用率的問題，這是直接制約大工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵點，同時也并未闡明制備得到的廣品品質(zhì)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種以固定化脂肪酶為催化劑，催化甲酯或者乙酯共軛化料耦聯(lián)制備共軛亞油酸的方法，本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)合了化學(xué)法和酶法優(yōu)點而摒棄各自缺點的制備共軛亞油酸的方法，即提供一種制備時間較短，不添加乳化劑，對環(huán)境友好，產(chǎn)品有效含量高的制備共軛亞油酸的方法。 申請人:在使用甲酯/乙酯共軛化料制備共軛亞油酸過程中，出乎意料地發(fā)現(xiàn)如果采用未完全酸化中和的甲酯/乙酯共軛化料，其中少量殘留的皂會起到乳化劑的作用，從而使得甲酯/乙酯共軛化料能夠很好地與水結(jié)合，也能很好地與固定化脂肪酶反應(yīng)。受此啟發(fā)，經(jīng)過不斷摸索，技術(shù)人員總結(jié)出了最優(yōu)的一種以固定化脂肪酶為催化劑，耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的技術(shù)方案。
[0010]本發(fā)明的方法是利用有機酸中和甲酯或者乙酯共軛化料至pH7.5-9，加入少量水，利用料液中殘留的少量的皂做為乳化劑制備乳化體系，使用自制的固定化脂肪酶為催化劑制備共軛亞油酸。與已知的化學(xué)法制備共軛亞油酸工藝相比，本發(fā)明避免了皂化、酸化、水洗、蒸餾等繁瑣步驟，不使用乳化劑，降低了不需要的t9，til和tlO，tl2-CLAs的含量，提高了產(chǎn)品品質(zhì)。與已知的酶法制備共軛亞油酸的工藝相比，反應(yīng)時間大大縮短，工藝更簡單、成本更低、得到的共軛亞油酸品品質(zhì)更高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0011]本發(fā)明的目的是采用如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。
[0012]一種制備共軛亞油酸的方法，是將共軛化料經(jīng)酶催化水解反應(yīng)制備得到共軛亞油酸，包括如下步驟:
[0013](I)將共軛化料用有機酸調(diào)節(jié)pH至7.5-9，得酸化共軛化料，酸化共軛化料與水按質(zhì)量比1:0.5-2混合均勻，配制成反應(yīng)液，預(yù)熱至40-60°C ；
[0014](2)通過恒流泵勻速將預(yù)熱的反應(yīng)液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，酶催化水解反應(yīng)1.5-4h，收集反應(yīng)產(chǎn)物；
[0015](3)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)油水分離、脫溶及分子蒸餾得到共軛亞油酸產(chǎn)品；
[0016]其中:在步驟(2)所述的酶催化反應(yīng)過程中反應(yīng)液通過充入氮氣或者抽真空的方式進行不間斷地脫除甲醇或乙醇；所述的共軛化料是將含亞油酸80%以上的紅花籽油，經(jīng)堿催化異構(gòu)化制備得到的甲酯共軛化料或乙酯共軛化料。
[0017]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的固定化脂肪酶是我公司申請的專利CN103224926A中所述的方法制備得到。本發(fā)明中，所述的固定化脂肪酶的含水量優(yōu)選控制在60-70%。
[0018]本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的共軛化料是采用含亞油酸80%以上的紅花籽油為原料，經(jīng)堿催化異構(gòu)化制備得到的甲酯共軛化料或乙酯共軛化料。所述由紅花油籽油制備甲酯共軛化料或乙酯共軛化料的方法采用本領(lǐng)域常用的堿催化異構(gòu)化方法，具體為:
[0019]①將紅花籽油與CV2短鏈醇按照摩爾比為1:3.5，加入紅花籽油質(zhì)量的2-3%的氫氧化鈉一起投入到反應(yīng)釜，氮氣置換后在60-90°C條件下攪拌反應(yīng)3-5h ;所述Cu短鏈醇為甲醇或乙醇；
[0020]②反應(yīng)產(chǎn)物酸化至pH為7攪拌，靜置，分離出油相產(chǎn)物，得到紅花籽油脂肪酸甲酯或者紅花籽油脂肪酸乙酯產(chǎn)物；
[0021]③將步驟②的產(chǎn)物降膜脫汽后得到的物料與甲酯或乙酯質(zhì)量的2-3%的甲醇鉀投入反應(yīng)釜中，氮氣置換后在110-150°C條件下攪拌反應(yīng)l_5h，得到最終產(chǎn)物，即甲酯共軛化料或者乙酯共軛化料。
[0022]本發(fā)明中，用上述方法由紅花籽油中制備得到的甲酯共軛化料或乙酯共軛化料是一種混合物，甲酯共軛化料中含有80%的共軛亞油酸甲酯；所述的乙酯共軛化料中含有80%的共軛亞油酸乙酯；其它成分為棕櫚酸、硬脂酸、油酸或者亞油酸的甲酯或乙酯。
[0023]本發(fā)明中，所述的有機酸優(yōu)選采用檸檬酸，酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸等弱酸。
[0024]本發(fā)明中，所述的氮氣流量優(yōu)選為0.1-1.01/min,抽真空的負壓優(yōu)選為
0.3-1.0mMpa0
[0025]本發(fā)明中，所述的步驟(2)的酶催化反應(yīng)溫度為40-60°C。
[0026]本發(fā)明利用中和后少量的皂為乳化劑將甲酯或乙酯的共軛化料與水乳化在一起，形成均一體系，并且弱有機酸的應(yīng)用有利于酶活的發(fā)揮，使得酶反應(yīng)時間大大縮短，提高了固定化酶重復(fù)利用率達到100次以上，降低了成本，利于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0027]采用本發(fā)明的方法，共軛化料(甲酯共軛化料或乙酯共軛化料)的水解率高達90-99% ;制備得到的產(chǎn)品中共軛亞油酸的含量在78-85%，其中反9，反11-共軛亞油酸與反10，反12-共軛亞油酸的含量< 1%，產(chǎn)品品質(zhì)較好。
[0028]本發(fā)明的有益效果:
[0029]①本發(fā)明提供了一種與通常方法構(gòu)思不同的技術(shù)方案，利用有機酸中和甲酯或乙酯共軛化料至PH7.5-9，加入少量水，利用料液中殘留的少量的皂做為乳化劑制備乳化體系，自制固定化脂肪酶為催化劑制備共軛亞油酸。與已知的酶法制備共軛亞油酸的工藝相t匕，反應(yīng)時間大大縮短，此工藝大大簡化了酶催化物料的前期處理過程，節(jié)省了成本及水的大量消耗，減低能耗，提高反應(yīng)效率。由于固定化酶的重復(fù)利用率大幅提高使得制備成本大大降低、得到的共軛亞油酸產(chǎn)品品質(zhì)更高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，乳化體系的應(yīng)用，大大縮短了反應(yīng)時間，提高了共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率，得到的共軛亞油酸的酸值在196mgK0H/g以上，其中大量存在(70-85%)共軛亞油酸的異構(gòu)體順9，反11 (“c9，til”)和反10，順12(“tlO，cl2”)，其它的異構(gòu)體反9，反11 (“t9，til”)與反10，反12 (“tlO，tl2”)的含量(1%。
[0030]②在酶催化反應(yīng)過程中，采用填充床的方式，充氮氣脫甲醇/乙醇的方法進行打破平衡進行催化反應(yīng)，提高了反應(yīng)效率，得到的產(chǎn)物易于分離。
[0031]③本發(fā)明中，共軛亞油酸甲酯/乙酯共軛化料，經(jīng)有機酸等弱酸酸化，酸化后呈弱堿性，pH7.5-9，克服了通常認為的共軛亞油酸甲酯/乙酯制備共軛亞油酸時，必須將甲酯/乙酯共軛亞油酸料完全中和的技術(shù)偏見。同時采用有機酸進行酸化，克服了通常認為的共軛亞油酸甲酯/乙酯制備共軛亞油酸時，酸化中和后必須經(jīng)水洗、水解等步驟的技術(shù)偏見，而且降低了成本，減少了產(chǎn)品中的酸性雜質(zhì)含量，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，產(chǎn)生了顯著的技術(shù)進步。進一步，弱有機酸的應(yīng)用，有利于酶活的發(fā)揮，使得酶反應(yīng)時間大大縮短，提高了固定化酶重復(fù)利用率達到100次以上，降低了成本，利于工業(yè)化大生產(chǎn)，產(chǎn)生了顯著的技術(shù)進步。
[0032]④如①所述，本發(fā)明采用由有機酸先酸化的共軛化料中加入水混合均勻，利用料液中殘留的少量的皂做 為乳化劑制備乳化體系，在進一步的酶反應(yīng)中不加入乳化劑，而現(xiàn)有技術(shù)中酶法制備共軛亞油酸時需要必須加入乳化劑，本發(fā)明的方法省去了乳化劑的使用，省去了后續(xù)的破乳等步驟，從而大大降低了因破乳帶來的產(chǎn)品損失，減少了雜質(zhì)的引入，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了生產(chǎn)時間和產(chǎn)品成本，產(chǎn)生了顯著的技術(shù)進步。
[0033]⑤本發(fā)明的制備方法，綜合了化學(xué)法和酶法制備共軛亞油酸的優(yōu)點:使用弱酸酸化后殘留的少量皂作為乳化劑，使甲酯/乙酯共軛亞油酸料很好地與水結(jié)合，從而很好地與固定化脂肪酶反應(yīng)，發(fā)揮了化學(xué)法反應(yīng)時間短的優(yōu)點；同時，使用了固定化脂肪酶制備共軛亞油酸，發(fā)揮了酶法不添加有機溶劑，對環(huán)境友好等優(yōu)點。本發(fā)明的方法克服了化學(xué)法和酶法制備共軛亞油酸的缺點，在降低不需要的t9，tll和tlO，tl2-CLAs含量的同時，減少了反應(yīng)時間，提高了產(chǎn)品品質(zhì)，克服了通常認為的要么產(chǎn)品中含t9，til和tlO，tl2-CLAs，要么長時間反應(yīng)才能制備共軛亞油酸的技術(shù)偏見。
[0034]⑥本發(fā)明的方法，系統(tǒng)地整合了制備共軛亞油酸甲酯/乙酯和制備共軛亞油酸的工藝，在應(yīng)用中可以從制備共軛亞油酸甲酯/乙酯的過程中，迅速轉(zhuǎn)換為生產(chǎn)共軛亞油酸，提高了企業(yè)生產(chǎn)靈活性，能使企業(yè)迅速響應(yīng)市場需求，具有顯著的技術(shù)效果和商業(yè)成功的潛力。
【具體實施方式】[0035]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用試劑等均可從化學(xué)試劑公司購買。
[0036]在下述實施例中使用的固定化脂肪酶是專利CN103224926A中公開的實施例4中制備的固定化脂肪酶。
[0037]酶反應(yīng)柱的準備:下述實施例中使用的酶反應(yīng)柱為帶加熱套的玻璃層析柱，反應(yīng)柱的規(guī)格為:長度20cm，直徑1.6cm。反應(yīng)柱與恒流泵相連接。反應(yīng)液在反應(yīng)過程中勻速流經(jīng)恒流泵然后進入反應(yīng)柱中。
[0038]裝柱方法:將固定化脂肪酶以干法裝住的方式進行填充，裝柱時先利用固定化脂肪酶自然沉降入柱中，然后用轉(zhuǎn)換頭將其壓實。
[0039]下述實施例中使用的甲酯共軛化料由如下方法制備得到:
[0040]①將含有亞油酸80%的紅花籽油、甲醇和氫氧化鈉投入到反應(yīng)釜，紅花籽油與甲醇的摩爾比為1:3.5，氫氧化鈉(堿催化劑)的加入量為紅花籽油質(zhì)量的2.5%，氮氣置換后在80°C條件下攪拌反應(yīng)4h;
[0041]②反應(yīng)產(chǎn)物酸化至pH為7左右，攪拌，靜置，分離出油相產(chǎn)物，得到紅花籽油脂肪酸甲酯； [0042]③將步驟②的產(chǎn)物降膜脫汽后得到的物料與紅花籽油質(zhì)量2.5%的甲醇鉀投入反應(yīng)釜中，氮氣置換后在130°C條件下攪拌反應(yīng)3h，得到最終產(chǎn)物，即甲酯共軛化料，所述甲酯共軛化料中共軛亞油酸含量為80wt%。
[0043]產(chǎn)品脂肪酸組成的測定參照AOCs、GB/17376和GB/T17377中所記載的方法。
[0044]產(chǎn)品酸值的測定參照GB/T5530中所記載的方法。
[0045]CLA甲酯水解率計算公式為:酸值/2%
[0046]實施例1
[0047](I)取100g的甲酯共軛化料在50度下加入適量的50%的硫酸/水中和至pH=8后繼續(xù)酸化lh，得酸化甲酯共軛化料，所述甲酯共軛化料中共軛亞油酸甲酯含量為80wt% ；
[0048](2)將5g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在45°C ；
[0049](3)將步驟(1)的得到的酸化甲酯共軛化料與水按質(zhì)量比1:0.5配成反應(yīng)液，反應(yīng)液攪拌均勻，得到乳化體系，并預(yù)熱至40°C，通過恒流泵泵入步驟(2)準備的酶反應(yīng)柱中，攪拌速度為100rpm/min流速為0.5ml/min，連續(xù)反應(yīng)4h，得到反應(yīng)產(chǎn)物，在80°C的條件下，繼續(xù)利用50%的硫酸/水溶液酸化至pH7.0左右，然后離心得到油相，即為最終產(chǎn)物，測定共軛亞油酸的酸值、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果見表1。
[0050]實施例2
[0051](I)向100g的甲酯共軛化料中加入50%的檸檬酸水溶液，中和至pH=8后繼續(xù)酸化lh，得酸化甲酯共軛化料，所述甲酯共軛化料中共軛亞油酸甲酯含量為80wt% ；
[0052](2)將5g固定化脂肪酶填充在酶反應(yīng)柱中，酶反應(yīng)柱的溫度保持在40°C ；
[0053](3)將步驟(1)的得到的酸化甲酯共軛化料與水按質(zhì)量比1:0.5配成反應(yīng)液，反應(yīng)液攪拌均勻，并預(yù)熱至40°C，通過恒流泵泵入步驟(2)準備的酶反應(yīng)柱中，攪拌速度為100rpm/min流速為0.5ml/min，連續(xù)反應(yīng)4h，得到反應(yīng)產(chǎn)物在80°C的條件下，繼續(xù)利用50%的檸檬酸/水溶液酸化至PH7.0左右，然后離心得到油相，即為最終產(chǎn)物，測定共軛亞油酸的酸值、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果見表1。
[0054]實施例3
[0055]按照實施2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料，其中用于酸化的有機酸為50%的枸杞酸水溶液，所述甲酯共軛化料中共軛亞油酸甲酯含量為80wt%。
[0056]按照實施例2的方法準備填充固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱。
[0057]將準備好的酸化甲酯共軛化料與水按質(zhì)量比1:0.5配成反應(yīng)液，反應(yīng)液攪拌均勻，并預(yù)熱至40°C,通過恒流泵泵入酶反應(yīng)柱中，攪拌速度為100rpm/min流速為0.5ml/min,連續(xù)反應(yīng)4h，得到的反應(yīng)產(chǎn)物在80°C的條件下，繼續(xù)利用50%的枸杞酸水溶液酸化至PH7.0左右，然后離心得到油相，即為最終產(chǎn)物，測定共軛亞油酸的酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果見表1。
[0058]實施例4
[0059]按照實施2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料，其中在酸化中加入1.5g檸檬酸。
[0060]其余步驟同實施例2，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0061]實施例5
[0062]按照實施2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料，其中在酸化中加入0.5g檸檬`酸。
[0063]其余步驟同實施例2，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0064]實施例6
[0065]酸化的甲酯共軛化料的制備同實施例2，其中在制備步驟中檸檬酸的加入量為
0.5g。
[0066]其余步驟同實施例3，其中酶反應(yīng)柱溫度保持在50°C，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0067]實施例7
[0068]按照實施例2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料。
[0069]其余步驟同實施例3，其中酶反應(yīng)柱溫度保持在55°C，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0070]實施例8
[0071]按照實施例2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料。
[0072]其余步驟同實施例3，其中酶反應(yīng)柱溫度保持在60°C，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0073]實施例9
[0074]按照實施例2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料。
[0075]其余步驟同實施例5，其中酸化甲酯共軛化料與水的質(zhì)量比為1:1，酶催化反應(yīng)時間為2.5h，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0076]實施例10[0077]按照實施例2的步驟(1)的方法得酸化甲酯共軛化料。
[0078]其余步驟同實施例5，其中酸化甲酯共軛化料與水的質(zhì)量比為1: 2，酶催化反應(yīng)時間為1.5h，得到最終產(chǎn)品共軛亞油酸并測定其酸值和組成、計算共軛亞油酸甲酯的水解率，結(jié)果如表1。
[0079]表1.[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種以固定化脂肪酶為催化劑的耦聯(lián)法制備共軛亞油酸的方法，是將共軛化料經(jīng)酶催化水解反應(yīng)制備得到共軛亞油酸，包括如下步驟: (1)將共軛化料用有機酸調(diào)節(jié)PH至7.5-9，得酸化共軛化料，酸化共軛化料與水按質(zhì)量比1:0.5-2混合均勻，配制成反應(yīng)液，預(yù)熱至40-60°C ； (2)通過恒流泵勻速將預(yù)熱的反應(yīng)液泵入填充有固定化脂肪酶的酶反應(yīng)柱中，酶催化水解反應(yīng)1.5-4h，收集反應(yīng)產(chǎn)物； (3)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)油水分離得到共軛亞油酸產(chǎn)品； 其中，在步驟(2)所述的酶催化反應(yīng)過程中反應(yīng)液通過充入氮氣或者抽真空的方式進行不間斷地脫除甲醇或乙醇；所述的共軛化料是將含亞油酸80%以上的紅花籽油，經(jīng)堿催化異構(gòu)化制備得到的甲酯共軛化料或乙酯共軛化料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備共軛亞油酸的方法，其特征在于所述的甲酯共軛化料中含有80wt%的共軛亞油酸甲酯；所述的乙酯共軛化料中含有80wt%的共軛亞油酸乙酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備共軛亞油酸的方法，其特征在于所述的有機酸為檸檬酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、枸椽酸、抗壞血酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備共軛亞油酸的方法，其特征在于所述的氮氣流量為0.1-1.0L/min，抽真 空的負壓為 0.3-1.0Mpa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備共軛亞油酸的方法，其特征在于所述的步驟(2)的酶催化反應(yīng)溫度為40-60°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備共軛亞油酸的方法，其特征在于所述的共軛化料的水解率為 90-99%。
7.如權(quán)利要求1-6所述的任一項所述的方法制備的共軛亞油酸產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的共軛亞油酸產(chǎn)品，其特征在于所述共軛亞油酸產(chǎn)品中共軛亞油酸的含量為78~85%，其中反9，反11-共軛亞油酸與反10，反12-共軛亞油酸的含量(1%。
【文檔編號】C12P7/64GK103849660SQ201410123854
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】楊大蘋, 吳文忠, 洪永德, 徐維鋒, 付亮亮 申請人:大連醫(yī)諾生物有限公司