一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明的引物對(duì)包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ?ID?NO：1上的一段序列，所述下游引物為SEQ?ID?NO：1的互補(bǔ)序列上的一段序列。使用本發(fā)明的特異性引物對(duì)能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地從臨床樣品中檢測解脲脲原體，這對(duì)于早期診斷、及時(shí)治療和有效控制生殖道解脲脲原體感染極有意義。
【專利說明】—種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及解脲脲原體的檢測，特別涉及一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)、試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】[0002]生殖道感染(Reproductive Tract Infection, RTI)是指各種病源微生物和寄生蟲感染于生殖道或是經(jīng)生殖道感染的一組感染性疾病的統(tǒng)稱，包括內(nèi)源性、外源性、醫(yī)源性及性傳播等感染，該病主要發(fā)生于生育期。生殖道感染疾病危害性涉及到諸多方面，表現(xiàn)在:(I)危害人類生殖健康，所導(dǎo)致的嚴(yán)重后果包括慢性盆腔炎疼痛、男女不孕癥、宮外孕、異位妊娠和感染HIV風(fēng)險(xiǎn)增加等。(2)RTI還會(huì)對(duì)新生兒的健康帶來影響，很多性傳播疾病(如梅毒、淋病、衣原體、乙肝、人類乳頭狀瘤病毒、單純皰疹病毒和艾滋病毒)可以通過婦女的懷孕期、分娩期和哺乳期傳給孩子，這被稱為“垂直傳播”，給嬰兒的健康造成嚴(yán)重后果。另外RTI也會(huì)引起自然流產(chǎn)、胎膜早破、早產(chǎn)和由此產(chǎn)生的低出生體重以及死胎。當(dāng)孕婦為淋病患者時(shí)，多達(dá)35%的妊娠結(jié)果為自然流產(chǎn)和早產(chǎn)，多達(dá)10%為圍產(chǎn)兒死亡。當(dāng)孕婦衣原體未經(jīng)治療，新生兒先天性感染幾率為30%，每年有數(shù)千名新生兒因此而失明。(3)生殖道感染疾病影響避孕節(jié)育的安全性。(4)生殖道感染還可增加宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)。(5)生殖道感染會(huì)增加多種疾病混合感染的危險(xiǎn)，例如淋病患者感染衣原體、支原體的概率為非感染者的3-5倍。RTI帶來這些嚴(yán)重的后果，對(duì)男性、女性個(gè)人和他們的家庭乃至整個(gè)社區(qū)造成健康問題。在我國有生殖感染癥狀的育齡婦女比例高達(dá)34.1%，已婚育齡婦女的既往生殖感染率高達(dá)73%，同時(shí)生殖感染疾病發(fā)病率目前也正以30%的速度逐年增長。
[0003]婦女RTI疾病嚴(yán)重影響人類生殖健康，隨著RTI發(fā)病率的上升，經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)率受到影響，很多家庭的生活質(zhì)量下降，RTI已經(jīng)成為當(dāng)今人類面臨的重大社會(huì)問題。
[0004]解脲脲原體(Ureaplasma urealyticum, UU)是主要的性傳播疾病之一,是條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力下降，菌群失調(diào)或長期濫用抗生素時(shí)能迅速繁殖，引起疾病。不斷深入的基礎(chǔ)和臨床研究表明，解脲脲原體感染可引起非特異性泌尿生殖道炎癥，可并發(fā)前列腺炎、附睪炎、輸卵管炎、宮頸炎、膀胱炎等，與早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、不孕有關(guān)，而且上行感染時(shí)，引起嬰兒肺部與呼吸道疾病、早產(chǎn)兒支氣管發(fā)育異常(BPD)和系統(tǒng)性感染。人被解脲脲原體感染后常缺乏特異性癥狀，極易形成隱匿性感染，使臨床診斷相當(dāng)困難。
[0005]UU 分為 2 個(gè)物種:Ureaplasma parvum (U.parvum)和 Ureaplasma urealyticum(U.urealyticum)。U.parvum 包含 4 種血清型(I, 3, 6, 14) ；U.urealyticum 包含 10 種血清型(2，4，5，7,8,9, 10, 11，12，13)，分為3個(gè)亞型，亞型I包含4種血清型(2，5，8和9)，亞型2包含4種血清型(4，10, 12和13)，亞型3包含2種血清型(7和11)。
[0006]臨床檢測中，大于85%的病患中被檢測出是U.parvum,而感染U.parvum病患中血清型3或14(3和14的蛋白序列只有一個(gè)氨基酸不一樣，故在臨床檢測上不區(qū)分)和血清型I是最常見的(血清型3或14和血清型I在沙眼生物型I中大概各占46%左右)；少于15%被檢測出是U.urealyticum,而感染U.urealyticum大部分是亞型2 (62%)和亞型I (34%),所以感染Ureaplasma的病患中基本是U.parvum。
[0007]目前UU的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要有涂片法、分離培養(yǎng)法、多重PCR法、酶免疫法。涂片法檢出率低；分離培養(yǎng)法(液-固兩步培養(yǎng)法)對(duì)培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)結(jié)果受諸多因素影響，陽性率偏低；多重、非對(duì)稱PCR和熒光偏振檢測技術(shù)，簡單快速，經(jīng)濟(jì)，提高了確定性和時(shí)效，但需要特殊的設(shè)備和技術(shù)，而定量PCR需標(biāo)記探針，成本增加；目前的酶免疫法檢測也出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。有報(bào)道建立了免疫熒光檢測法來檢測UU，但還未在臨床上大量試驗(yàn)和推廣。傳統(tǒng)的檢測方法重復(fù)工作多，繁瑣、時(shí)效低、費(fèi)用高，且主觀目測判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性和印象率偏高。
[0008]據(jù)報(bào)道在性傳播疾病中，UU的感染率和危害性已經(jīng)超過了淋球菌。UU利用本身表面抗原蛋白的易變性，逃避人體的免疫監(jiān)控而長期潛伏在人體，進(jìn)入子宮內(nèi)膜，引起充血、水腫，進(jìn)而導(dǎo)致不孕等疾病。UU可單獨(dú)感染引起引起非淋菌性尿道炎，也可與淋球菌合并感染。目前，遂著社會(huì)發(fā)展、人們生活環(huán)境和傳統(tǒng)文化觀念的改變等因素，性病病原體感染率增加，UU感染率有逐年增高的趨勢。早期治療是預(yù)防脲原體所致疾病的關(guān)鍵，因此開發(fā)新的簡便、快速檢測方法，對(duì)早期診斷、治療和控制至關(guān)重要。
[0009]自上世紀(jì)80年代起，分子生物學(xué)研究的不斷深入，PCR技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域，該技術(shù)靈敏度好、特異性高，操作簡單、快速，很大程度上縮短了診斷時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人通過PCR方法確定了一段解脲脲原體的保守序列，通過檢測該段保守序列能夠檢測解脲脲原體的感染，所述保守序列具有SEQ ID N0:1所示的序列。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)，包括所述引物對(duì)的PCR檢測試劑盒及其應(yīng)用。使用本發(fā)明提供的解脲脲原體的特異性引物對(duì)能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地從臨床樣品中檢測解脲脲原體，這對(duì)于早期診斷、及時(shí)治療和有效控制生殖道解脲脲原體感染極有意義。
[0011]在第一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQ ID NO:1上的一段序列，所述下游引物為SEQ ID N0:1的互補(bǔ)序列上的一段序列。
[0012]本發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO:1是一段在解脲脲原體基因組上具有高度保守性的序列，而且相比于解脲脲原體基因組上的其它序列片段，該序列片段更容易擴(kuò)增，針對(duì)該序列片段通過設(shè)計(jì)引物對(duì)取自人體(如女性生殖器)的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增能夠判定解脲脲原體的感染情況。發(fā)明人針對(duì)該序列片段設(shè)計(jì)了多對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能得到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。而針對(duì)解脲脲原體基因組上的其它幾個(gè)序列片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，沒有得到預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物。說明本發(fā)明的SEQ ID NO:1是易于擴(kuò)增的序列片段，能夠用于確定解脲脲原體的感染。
[0013]作為本發(fā)明的優(yōu)選 技術(shù)方案，所述上游引物和下游引物的序列長度均為12-30個(gè)堿基，例如12個(gè)堿基、15個(gè)堿基、16個(gè)堿基、18個(gè)堿基、20個(gè)堿基、22個(gè)堿基、25個(gè)堿基、27個(gè)喊基或29個(gè)喊基等。
[0014]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述上游引物的5’端起始于SEQ ID NO:1的第一個(gè)堿基；所述下游引物的5’端第一個(gè)堿基與SEQ ID NO:1的最后一個(gè)堿基互補(bǔ)。其中，SEQID NO:1的第一個(gè)堿基即5’端的首個(gè)堿基，最后一個(gè)堿基即3’端的首個(gè)堿基。這樣的一對(duì)引物能夠擴(kuò)增出SEQ ID N0:1的全長序列，長度為151bp。
[0015]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述上游引物和下游引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為100-151bp,例如 102bp、105bp、108bp、120bp、127bp、132bp、135bp、138bp、142bp、149bp 或151bp，優(yōu)選105-151bp，更優(yōu)選110_151bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小具體是由引物對(duì)在SEQ IDNO:1序列上的位置決定的。
[0016]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQ ID NO:USEQ ID NO:
8、SEQ ID N0:13 或 SEQ ID NO: 18，大小分別為 151bp、139bp、127bp 和 llObp。
[0017]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述上游引物選自SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 ;所述下游引物選自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:170可以從上游引物的具體例中選擇一個(gè)引物與從下游引物的具體例中選擇的一個(gè)引物配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[0018]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述引物對(duì)選自下列任一項(xiàng):
[0019](a)所述上游引物為SEQ ID NO:2，所述下游引物為SEQ ID NO:3 ；
[0020](b)所述上游引物為SEQ ID NO:4，所述下游引物為SEQ ID NO:5 ；
[0021](c)所述上游引物為SEQ ID NO:6，所述下游引物為SEQ ID NO:7 ；
[0022](d)所述上游引物為SEQ ID NO:9，所述下游引物為SEQ ID NO:10 ；
[0023](e)所述上游引物為SEQ ID NO:11，所述下游引物為SEQ ID NO:12 ；
[0024](f)所述上游引物為SEQ ID NO:14，所述下游引物為SEQ ID NO:15 ；
[0025](g)所述上游引物為SEQ ID NO:16，所述下游引物為SEQ ID NO:17。
[0026]本發(fā)明人使用(a)~(g)中的7對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到151bp、151bp、139bp、139bp、127bp、127bp和IlObp的擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期相符，因此可使用這7對(duì)引物作為檢測解脲脲原體感染的引物對(duì)。
[0027]在第二方面，本發(fā)明提供一種解脲脲原體的PCR檢測試劑盒，包括第一方面所述的引物對(duì)。
[0028]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述PCR檢測試劑盒還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
[0029]在第三方面，本發(fā)明提供一種第一方面所述的引物對(duì)在作為解脲脲原體的PCR檢測試劑盒的特異性引物或作為解脲脲原體的基因芯片探針序列中的應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)了一段解脲脲原體的保守序列SEQ IDNO:1，該段保守序列易于擴(kuò)增，具有高度的解脲脲原體特異性，本發(fā)明針對(duì)該序列設(shè)計(jì)了引物對(duì)，使用本發(fā)明提供的引物對(duì)擴(kuò)增臨床樣品，能夠快速、靈敏、準(zhǔn)確地從臨床樣品中檢測解脲脲原體，對(duì)于早期診斷、及時(shí)治療和有效控制生殖道解脲脲原體感染極有意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的引物對(duì)擴(kuò)增臨床標(biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果圖，其中泳道Mr為DNA Marker,泳道I和2為從臨床陽性樣品(解脲脲原體感染)DNA中擴(kuò)增的產(chǎn)物，泳道3為陰性對(duì)照。[0032]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果圖，其中，測序圖譜上第169位A到319位T之間的序列為PCR產(chǎn)物的序列，與預(yù)計(jì)序列一致。
[0033]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1陽性擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中Blast比對(duì)結(jié)
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【具體實(shí)施方式】
[0034]下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0035]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0036]實(shí)施例中，pMD18-T載體、PCR buffer、MgCl2, dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 DNALigation Kit 購自 Takara (大連)，DNeasy Plant Mini Kit 購自 Qiagen 公司。試劑盒保存于-20°C，盡量避免反復(fù)凍融。
[0037]實(shí)施例1:
[0038]本實(shí)施例以ACTAMCTAGTTTCTGTACACGATCC(SEQ ID NO:2)和 ACTAGCGMATTMTTGCCCCTG(SEQ ID NO:3)作為弓丨物對(duì)擴(kuò)增臨床樣本。
[0039](I) PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0040]準(zhǔn)備好3支PCR 反應(yīng)管，分別向其中加入臨床陽性樣品DNA和陰性對(duì)照樣品，隨后分別加入0.1yL Taq 酶、0.8μ L dNTPs (2.5mM)U μ L PCR buffer (10*PCR buffer),
0.6μ L MgCl2(25yM)、0.1 μ L上游引物(100 μ M)和 0.1 μ L下游引物(100 μ Μ)，用 ddH20補(bǔ)充至總體積10 μ L。將已經(jīng)加好樣的PCR管放置PCR儀上，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)(見表1)，進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1，樣品大小結(jié)果與預(yù)計(jì)大小相符，陰性結(jié)果正常。
[0041]表1PCR反應(yīng)參數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測解脲脲原體的引物對(duì)，包括上游引物和下游引物，所述上游引物為SEQID NO:1上的一段序列，所述下游引物為SEQ ID NO:1的互補(bǔ)序列上的一段序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于，所述上游引物和下游引物的序列長度均為12-30個(gè)堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)，其特征在于，所述上游引物的5’端起始于SEQID NO:1的第一個(gè)堿基；所述下游引物的5’端第一個(gè)堿基與SEQ ID NO:1的最后一個(gè)堿基互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)，其特征在于，所述上游引物和下游引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為100-151bp，優(yōu)選105-151bp，更優(yōu)選110-151bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物為SEQID NO:U SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO:180
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的引物對(duì)，其特征在于，所述上游引物選自SEQIDNO:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO:14 或 SEQ IDNO:16 ;所述下游引物選自 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO:17。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)選自下列任一項(xiàng): Ca)所述上游引物為SEQ ID NO:2，所述下游引物為SEQ ID NO:3 ； (b)所述上游引物為SEQID NO:4，所述下游引物為SEQ ID NO:5 ； (c)所述上游引物為SEQID NO:6，所述下游引物為SEQ ID NO:7 ； Cd)所述上游引物為SEQ ID NO:9，所述下游引物為SEQ ID NO:10 ； Ce)所述上游引物為SEQ ID NO:11，所述下游引物為SEQ ID NO:12 ； Cf)所述上游引物為SEQ ID NO:14，所述下游引物為SEQ ID NO:15 ； (g)所述上游引物為SEQ ID NO:16，所述下游引物為SEQ ID NO:17。
8.一種解脲脲原體的PCR檢測試劑盒，包括權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的引物對(duì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs和Taq DNA聚合酶。
10.一種權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的引物對(duì)在作為解脲脲原體的PCR檢測試劑盒的特異性引物或作為解脲脲原體的基因芯片探針序列中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103882133SQ201410125738
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】黃鐘, 李小青 申請(qǐng)人:深圳意達(dá)凱生物科技有限公司