大腸桿菌o157:h7的pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種大腸桿菌O157:H7的PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。試劑盒是一種運(yùn)用特異性引物對(duì)檢測(cè)樣品中大腸桿菌O157:H7的快速技術(shù)，其步驟為：一，提取待檢樣品中的核苷酸；二，利用所述PCR試劑盒檢測(cè)樣品中的核苷酸，判斷樣品中是否含有大腸桿菌O157:H7。本發(fā)明的試劑盒針對(duì)性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便。其中引物對(duì)包括：由序列為5-atgaataagaatctcatc-3的上游引物SEQIDNO.1和序列為5-tttcttctcgcagtttcg-3的下游引物SEQIDNO.2組成的引物對(duì)。該套引物序列根據(jù)GenBank上大腸桿菌O157:H7獨(dú)有的保守序列設(shè)計(jì)，具有很高的特異性和敏感性。
【專利說(shuō)明】大腸桿菌0157:H7的PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒
[0001]一、【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明提供一種大腸桿菌0157:H7的PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0002]二、【背景技術(shù)】
大腸桿菌coli,疋co7i) 0157:H7是重要的食源性病原菌，能夠在全世界范圍內(nèi)引起動(dòng)物、家禽和人類爆發(fā)感染。中國(guó)已將大腸桿菌0157:H7列為21世紀(jì)可能對(duì)國(guó)人健康有重大影響的12種病原微生物之一，對(duì)人的致病力強(qiáng)，感染劑量低，感染載體含菌量達(dá)10個(gè)/g以上即可引起感染。病菌侵入人體后，可以引起出血性或非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合癥。大腸桿菌0157:H7不僅關(guān)乎食品安全，而且與醫(yī)療和公共衛(wèi)生問(wèn)題密切相關(guān)。為了及時(shí)有效的監(jiān)控未來(lái)可能的爆發(fā)感染，建立敏感、特異和可靠的技術(shù)用于快速而選擇性的檢測(cè)大腸桿菌0157:H7是極其必要的。
[0003]當(dāng)前，許多報(bào)道嘗試研制更適合的方法檢測(cè)大腸桿菌0157: H7。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定技術(shù)使用選擇性培養(yǎng)基或者顯色平板檢測(cè)大腸桿菌0157:H7，但是這種方法費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，準(zhǔn)確性差。PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用各檢測(cè)領(lǐng)域，發(fā)揮著不可忽視的作用。但是，運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)大腸桿菌0157:H7最大的障礙是如何選擇唯一特異的標(biāo)簽基因建立方法。許多學(xué)者選用志賀毒素基因和stxl'uidA、eae、fimA、rfbE和fliC鑒定大腸桿菌0157: H7，這些基因雖然在一定程度上提供了某些鑒定信息，但是大部分基因不是大腸桿菌0157:H7獨(dú)有的基因，不能直接判定為大腸桿菌0157:H7。因此，選用更加特異而穩(wěn)定的基因鑒定大腸桿菌0157:H7，建立快速檢測(cè)技術(shù)，更加有意義和必要性。
[0004]前期研究工作中，通過(guò)對(duì)已有大腸桿菌0157:H7全基因組序列生物信息學(xué)，比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的閱讀框唯一的 存在于大腸桿菌0157:H7基因組中。我們選用大腸桿菌0157: H7參考菌株EDL933、非大腸桿菌0157菌株和類似腸道菌株沙門氏菌、志賀氏菌等，建立PCR進(jìn)行檢測(cè)和區(qū)分這些病原菌，結(jié)果表明該新的閱讀框是大腸桿菌0157:H7特異而穩(wěn)定的標(biāo)簽性基因。這些研究結(jié)果促使我們進(jìn)一步研制用于檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的新型PCR試劑盒。
[0005]三、發(fā)現(xiàn)內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明目的在于提供一種特異性檢測(cè)大腸桿菌0157:H7引物序列和試劑盒。
[0006]技術(shù)方案本發(fā)明的具體實(shí)施方案如下:
1、引物設(shè)計(jì)=BLAST比對(duì)大腸桿菌0157: H7基因組序列，找到其特有基因，運(yùn)用DNAStar軟件設(shè)計(jì)引物對(duì)，由序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2組成。擴(kuò)增產(chǎn)物為354bp。
[0007]2、PCR擴(kuò)增，包括以下步驟:
(O大腸桿菌0157:H7細(xì)菌培養(yǎng)和模板制備:接種環(huán)蘸取-70°C保存菌種，劃線接種于山梨醇麥康凱平板，37°C培養(yǎng)20h，單個(gè)菌落接種5mL心腦浸出液培養(yǎng)基(杭州微生物試劑制品公司)中；如待檢樣品為液體，則直接取ImL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中再加入100 uL濃度為50mg/mL新生霉素(Ameresco進(jìn)口分裝)培養(yǎng)20h，次日，取細(xì)菌培養(yǎng)液lmL, 12000r離心10min, 100 μ L純凈水重懸菌泥，煮沸l(wèi)Omin, 12000r離心10min,上清即為待檢模板；(2)PCR擴(kuò)增:在0.2mL的PCR反應(yīng)管中分別加入10XPCR緩沖液2.5uL、2.5mM的dNTPs
2.0uL、25mM 的 MgC12 1.5 uL、20pmol/uL 堿基序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的引物PZF和pZR各0.2 uL、DNA聚合酶1、DNA模板2uL，補(bǔ)加超純水15.6 uL至總體積25uL。95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s，50°C-60°C梯度退火 30s，72°C 40s，29 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸5min，擴(kuò)增PCR產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，只有目的條帶的最高退火溫度，即最佳退火溫度為60°C。
[0008](3)敏感性試驗(yàn):首先選用大腸桿菌0157:H7細(xì)菌純培養(yǎng)物，而后選用模擬制備的大腸桿菌0157:H7污染樣品分析PCR的敏感性。
[0009](4)特異性試驗(yàn):選用極易與大腸桿菌0157:H7混淆的細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0010](5)試劑盒組裝:PCR預(yù)混液、DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和純凈水。
[0011]有益效果
(I)本發(fā)明基于前期研究的發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌0157:H7基因組中具有獨(dú)有的基因片段，區(qū)別于其他大腸桿菌。根據(jù)該段基因，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，特異性良好。
[0012](2 )由于本發(fā)明選定大腸桿菌0157: H7特有基因設(shè)計(jì)引物，所建立PCR方法對(duì)極易混淆的大腸桿菌血清型055和026均為陰性擴(kuò)增，具有非常良好的特異性。
[0013](3)本發(fā)明提供的引物，無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免引物自身的非特異性結(jié)合，造成假陰性擴(kuò)增。
[0014](4)本發(fā)明提供`的引物檢測(cè)敏感性高，對(duì)大腸桿菌0157:H7細(xì)菌培養(yǎng)物最低檢測(cè)限104CFU/mL，對(duì)模擬陽(yáng)性污水樣和肉樣，增菌后檢測(cè)限10CFU/mL(g)。
[0015]四、【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1:pZF和pZR引物對(duì)的PCR敏感性試驗(yàn)圖
1-6:大腸桿菌0157:H7污染牛肉樣品增菌后檢測(cè)，104CFU/g、103CFU/g、102CFU/g、10CFU/gUCFU/g和陰性對(duì)照。M:DL-2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；8_15:大腸桿菌0157:H7污染牛肉樣品直接檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照、108CFU/g、107CFU/g、106CFU/g、105CFU/g、104CFU/g、103CFU/g 和102CFU/g。
[0016]五、【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆；實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(New York:Cold Spring Harber LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或者按照制造廠商所建議的條件。
[0017]實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank上發(fā)表的大腸桿菌0157:H7 EDL933 (登錄號(hào):AE005174)獨(dú)有保守性基因序列設(shè)計(jì)引物，PZF和pZR引物序列是SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2。擴(kuò)增保守基因片段為 354bp，其序列是 SEQ ID N0.3。SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 如下:SEQ ID N0.1:5_ atgaataagaatctcatc—3SEQ ID N0.2:5- tttcttctcgcagtttcg-3
SEQ ID N0.3:atgaataagaatctcatcctcgcatttgcattattttccttacctgtatttgcagaagaagatctggggccaggcaaatatgtttgtgacattaggatttccagcctggataccgctactcaaattctgtcaaaatccgcaacagttctcgat
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acaatttcatcgttcaaatgccaaatggagatcaattgtactctccagatctggaaaatgttgatgatggtat
aaagcaacaataggtggagtgacatttattcgtcgtccaacttttaacgatcgcttcatcgtggaagatggaa
atacagg
attcttctataagatgcgaaactgcgagaagaaa
實(shí)施例2
試劑盒的敏感性試驗(yàn)，將上述引物檢測(cè)模擬制備0157:H7陽(yáng)性樣品。
[0018]下面所有模擬制備0157:H7陽(yáng)性樣品都是經(jīng)過(guò)免疫磁珠富集(Dynabeads anti~E.coli 0157免疫磁珠，購(gòu)自Invitrogen公司)，顯色培養(yǎng)基細(xì)菌分離(方法參照:牛源0157:H7的分離及毒力因子分析，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32(8): 1148-1153。)證實(shí)為0157:H7陰性才可以選用。
[0019]2.1污水樣品制備:從養(yǎng)殖場(chǎng)采集污水，IOmL/管，依次加入大腸桿菌0157:H7培養(yǎng)物，細(xì)菌終濃度分別為 IO6 CFU/mLUO5 CFU/mLUO4 CFU/mLUO3 CFU/mLUO2 CFU/mLUOCFU/mL 和 lCFU/mL。
[0020]2.2牛肉樣品制備:超市購(gòu)買牛肉泥200g，每IOg加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，再加入大腸桿菌0157:H7培養(yǎng)物，細(xì)菌終濃度分別為IO8 CFU/gUO7 CFU/gUO6 CFU/gUO5CFU/g、IO4 CFU/g、IO3 CFU/g、IO2 CFU/g、10 CFU/g和 lCFU/g。
[0021]2.3待檢模板的制備:
將上述制備的陽(yáng)性牛肉泥樣品，分別取ImL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基(杭州微生物試劑制品公司)中，培養(yǎng)基中再加入100 uL濃度為50mg/mL新生霉素(Ameresco進(jìn)口分裝),37°C繼續(xù)培養(yǎng)18h,吸取ImL培養(yǎng)物,500 r離心15min,棄沉淀,吸取上清至新離心管，12000r離心10min，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10min，4°C 12000轉(zhuǎn)離心10min，吸取上清，即檢測(cè)用模板DNA。
[0022]取上述制備的陽(yáng)性污水樣品，分別取ImL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基(杭州微生物試劑制品公司)中，培養(yǎng)基中再加入100 uL濃度為50mg/mL新生霉素(Ameresco進(jìn)口分裝),37°C繼續(xù)培養(yǎng)18h,吸取ImL培養(yǎng)物,500 r離心15min,棄沉淀,吸取上清至新離心管，12000r離心10min，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴lOmin，4°C 12000r離心IOmin,吸取上清，即檢測(cè)用模板DNA。
[0023]2.4PCR擴(kuò)增條件:在0.2mL的PCR反應(yīng)管中分別加入21 uL PCR預(yù)混液，DNA聚合酶 luL、DNA 模板 3 uL ο
[0024]2.5將PCR管至于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C 30s，60°C 30s, 72°C 408，29個(gè)循環(huán)，721:再延伸51^11。將PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳。
[0025]2.6結(jié) 判定:擴(kuò)增產(chǎn)物如果有354bp的條帶，即表示有大腸桿菌0157:H7的存在；擴(kuò)增產(chǎn)物如果沒(méi)有354bp的條帶，即表示無(wú)大腸桿菌0157:H7的存在。PCR直接檢測(cè)大腸桿菌0157:H7純培養(yǎng)物模板，最低檢測(cè)限為104CFU/mL。PCR分別檢測(cè)模擬陽(yáng)性污水樣的各個(gè)稀釋度I CFU/mL -106CFU/mL，最低檢測(cè)限104CFU/mL，增菌后最低檢測(cè)限10CFU/mL ；PCR分別檢測(cè)模擬陽(yáng)性肉樣的各個(gè)稀釋度I CFU/g _108CFU/g，最低檢測(cè)限105CFU/g，增菌后最低檢測(cè)限10CFU/g。圖1。
[0026]實(shí)施例3
試劑盒的特異性試驗(yàn)，包括以下步驟:
按照實(shí)施例2中試劑盒PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)大腸桿菌0157:H7 EDL933、大腸桿菌026、大腸桿菌055和非大腸桿菌病原(鏈球菌、沙門氏桿菌、巴氏桿菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌2a)(李麗，等。EHEC 0157H7 二重PCR的建立及應(yīng)用。華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26 (6):61。)結(jié)果均未擴(kuò)增出任何條帶，只有大腸桿菌0157:H7 EDL933擴(kuò)增出354bp的條帶。
[0027]實(shí)施例4 上述引物序列和試劑盒檢測(cè)臨床樣品，包括以下步驟:
4.1樣品收集:采集奶牛糞便20份，肉牛糞便20份，25-30g/份；集貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買不同攤位牛肉，各250g，共6個(gè)樣品；蔬菜和水果批發(fā)市場(chǎng)，購(gòu)買菠菜、豆芽、韭菜、荸薺和生菜，各250g，共30份。所有采集和購(gòu)買樣品儲(chǔ)存在樣品收集袋(南京助研公司)中，密封冷藏保存。
[0028]4.2待檢模板的制備:從樣品收集袋中取出糞便或者食物10克，加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37°C震蕩2h后，取ImL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基(杭州微生物試劑制品公司)中，培養(yǎng)基中再加入100 uL濃度為50mg/mL新生霉素(Ameresco進(jìn)口分裝)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)18h,吸取ImL培養(yǎng)物,500 r離心15min,棄沉淀，吸取上清至新離心管，12000r離心lOmin，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10min，4°C 12000r離心10minJl取上清，即檢測(cè)用模板DNA。
[0029]4.3PCR擴(kuò)增條件:在0.2mL的PCR反應(yīng)管中分別加入22uL PCR預(yù)混液，DNA聚合酶 luL、DNA 模板 2uL。
[0030]4.4將PCR管至于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C 30s，60°C 30s, 72°C 40s，29 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸 5min。
[0031]4.5將PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳。
[0032]4.6結(jié)果判定:擴(kuò)增產(chǎn)物如果有354bp的條帶，即表示有大腸桿菌0157:H7的存在；擴(kuò)增產(chǎn)物如果沒(méi)有354bp的條帶，即表示無(wú)大腸桿菌0157:H7的存在。
[0033]結(jié)果表明，上述所有樣品共計(jì)76份，大腸桿菌0157:H7陽(yáng)性12份，其中糞便陽(yáng)性9份，荸薺陽(yáng)性1份，菠菜陽(yáng)性2份。
【權(quán)利要求】
1.一種大腸桿菌0157:H7的PCR檢測(cè)引物，其特征在于:由序列SEQ ID N0.1和SEQID N0.2組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為354bp:
SEQ ID N0.1:5- atgaataagaatctcatc—3
SEQ ID N0.2:5- tttcttctcgcagtttcg-3。
2.含有權(quán)利要求1所述引物的檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的試劑盒，其特征是，試劑盒包括PCR預(yù)混液和DNA聚合酶，所述PCR預(yù)混液包括: 每 22uL 的反應(yīng)體系包括 IOXPCR 緩沖液 2.5uL、2.5mM 的 dNTPs 2.0uL、25mM 的 MgCl21.5 uL、20pmol/uL堿基序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物各0.2 uL、超純水15.6uL ； 每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)總體積25 uL，含有22uLPCR預(yù)混液，DNA聚合酶I uL、待檢DNA模板2uL。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，用于檢測(cè)大腸桿菌0157:H7的PCR方法，包括以下步驟: (O待檢模板的制備:取糞便或者食物10克，加入到90mL磷酸鹽緩沖液中，37°C震蕩2h后，取ImL加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中；如果待檢樣品為液體，則直接取ImL液體樣品加入到9mL心腦浸出液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中再加入100 uL濃度為50mg/mL新生霉素，37°C繼續(xù)培養(yǎng)18h,吸取ImL培養(yǎng)物,500 r離心15min,棄沉淀,吸取上清至新離心管，12000r離心10min，棄上清，取沉淀重懸于1/10體積雙蒸水中，沸水浴10min，4°C 12000轉(zhuǎn)離心10min，吸取上清，即檢測(cè)用模板DNA ； (2)PCR擴(kuò)增條件:在0.2mL的PCR反應(yīng)管中分別加入22uLPCR預(yù)混液，DNA聚合酶IuL、DNA 模板 2uL ； (3)將PCR管至于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min，94°C30s, 60°C30s, 72°C 40s, 29 個(gè)循環(huán)，72°C再延伸 5min ； (4)將PCR產(chǎn)物于質(zhì)量比為1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳； (5)結(jié)果判定:擴(kuò)增產(chǎn)物如果有354bp的條帶，即表示有大腸桿菌0157:H7的存在；擴(kuò)增產(chǎn)物如果沒(méi)有354bp的條帶，即表示無(wú)大腸桿菌0157:H7的存在。
【文檔編號(hào)】C12Q1/10GK103866031SQ201410130211
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】張雪寒, 何孔旺, 李盟, 汪偉, 倪艷秀, 溫立斌, 李彬 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院