單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法及其專用單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法及其專用單克隆抗體，是以重組表達(dá)的p60為抗原，篩選特異性抗單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的單克隆抗體，用生物素標(biāo)記p60單抗，再利用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素為第二抗體，建立基于生物素化單抗的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的A-BELISA檢測(cè)和定量方法。本發(fā)明的有益效果為，本發(fā)明所涉及的A-BELISA方法，不僅克服了傳統(tǒng)通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定李氏桿菌種費(fèi)事費(fèi)力敏感性低的缺點(diǎn)，而且應(yīng)用生物素（B）-親和素（A）酶放大系統(tǒng)，使A-BELISA比已有的ELISA方法更敏感，檢測(cè)限更低，此外，還可以通過(guò)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)待檢抗原進(jìn)行定量分析，該方法敏感性高，更加易于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化。
【專利說(shuō)明】[0001] 單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法及其專用單克隆抗體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法及其專用單克隆抗體。

【背景技術(shù)】
[0003] 單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌， 是一種能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌，該菌屬于細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽(yáng)性桿 菌，人畜感染后，主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細(xì)胞增多等癥狀，死亡率達(dá)20? 30%，該菌在自然界廣泛存在，食品中存在的單核細(xì)胞增生性李斯特菌對(duì)人類安全構(gòu)成很大 威脅，是21世紀(jì)對(duì)人類健康具有重大影響的12種病原微生物之一。
[0004] 李氏桿菌屬包括單增李氏桿菌（Listeria monocytogenes)、伊氏李氏桿菌 (Z. 、無(wú)害李氏桿菌（Z. i/wocwa)、威斯梅爾氏李氏桿菌（Z. 、西里杰 氏李氏桿菌仏。除L. Μ對(duì)人畜致病性高外，其它的都致病力很小或無(wú)致病力， 而且在自然界中普遍存在。因此，如何區(qū)分食品污染的是致病性李氏桿菌還是其它常在李 氏桿菌，是食品工業(yè)或動(dòng)物李氏桿菌病免疫學(xué)診斷的首要課題。目前，傳統(tǒng)的L. Μ檢測(cè)方法 因細(xì)菌分離、增菌以及鑒定所需時(shí)間較長(zhǎng)，花費(fèi)人力物力較大，不適合快速檢測(cè)的需要，其 他檢測(cè)方法，如PCR法、基因探針等方法，需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，而且特異性差，因此很不 適合在現(xiàn)場(chǎng)對(duì)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)，如何提高L. Μ的檢出率的同時(shí)縮短檢測(cè)時(shí)間已經(jīng)成為各 國(guó)科技工作者急需解決的問(wèn)題。
[0005] 國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者對(duì)單增李斯特菌單克隆抗體的制備以及ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行了 很多研究，Boerlin等學(xué)者用重組的LL0和ini A作為EL ISA診斷抗原檢測(cè)牛的L Μ抗 體，結(jié)果敏感性特異性分別達(dá)82%和92%，說(shuō)明用基因工程生產(chǎn)的抗原建立的ELISA方法 完全可以用于LM的診斷和檢測(cè)。Vazquez- Boland J A等學(xué)者用純化的重組溶血素蛋白 包被聚苯乙烯板，利用間接ELISA的方法已經(jīng)成功的檢測(cè)出綿羊感染的單核增生性李斯特 桿菌，并且抗原的包被條件和其他反應(yīng)條件已經(jīng)被優(yōu)化。崔煥忠等人以致病性李斯特菌 ActA蛋白為對(duì)象，原核表達(dá)了 ActA蛋白，制備了抗ActA特異性單克隆抗體，并從中選取2 株單克隆抗體分別用于免疫膠體金標(biāo)記和膠體金試紙檢測(cè)線的包被，從而研制成了檢測(cè)LM 的膠體金試紙。秦玉敏用純化的重組LL0蛋白免疫小鼠，獲得6株穩(wěn)定分泌抗LL0單克隆 抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以制備的腹水單抗為診斷抗體，用此診斷抗體分別與BHI培養(yǎng)基和 TSB-YE培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同時(shí)段的LM0上清發(fā)生反應(yīng)，建立了阻斷ELISA檢測(cè)LM0的方法。 但這些研究大都以ActA、LL0等為研究對(duì)象，有關(guān)p60的單克隆抗體及檢測(cè)試劑盒的研究目 前還很少。Yu等篩選出了抗p60的單克隆抗體，建立了檢測(cè)單增李氏桿菌的ELISA方法。 該方法雖然快速簡(jiǎn)單，但敏感性和特異性與間接ELISA相當(dāng)，也不能進(jìn)行定量分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種可快速檢測(cè)食品及動(dòng) 物體內(nèi)致病性單核細(xì)胞增多性李氏桿菌的檢測(cè)方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交 瘤細(xì)胞株6C2,其保藏編號(hào)為CGMCC No. 8768。
[0008] 小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞株6C2,已于2014年3月3日保藏于中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱CGMCC，地址，北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8768。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的，是提供了單核細(xì)胞增生性李氏桿菌p60單克隆抗體，是由 保藏編號(hào)為CGMCC No. 8768的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞株6C2產(chǎn)生的。
[0010] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法，是用純化的 重組單核細(xì)胞增生性李氏桿菌P60蛋白作為免疫原制備得到上述的雜交瘤細(xì)胞株6C2,篩 選出能特異性識(shí)別單核細(xì)胞增生性李氏桿菌P60的上述的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌p60單 克隆抗體，并進(jìn)行生物素化處理，以A-B ELISA方法建立定性檢測(cè)和定量分析單增李氏桿菌 P60的檢測(cè)方法。
[0011] 進(jìn)一步的，上述的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法，包括以下步驟： 1) ρ60蛋白的表達(dá)及純化： 提取單核細(xì)胞增生性李氏桿菌4b的基因組DNA，PCR擴(kuò)增p60基因，定向克隆入 pET-30a表達(dá)載體，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)； 2) 雜交瘤細(xì)胞株的建立： 用純化的P60蛋白作為免疫原反復(fù)免疫Balb/c小鼠，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫 小鼠脾細(xì)胞在500g/L PEG介導(dǎo)下進(jìn)行融合，獲得雜交瘤細(xì)胞株； 3) 抗p60單克隆抗體的篩選與鑒定： 將P60抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，得到4株抗單核細(xì)胞增生性 李氏桿菌P60蛋白的雜交瘤細(xì)胞株（6C2,2E4,3H5,5F8)。分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用單克 隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型及亞型，其中2E4、5F8和6C2 為IgGl亞型，3H5為IgG2a亞型。將雜交瘤接種小鼠腹腔收集腹水，測(cè)定2E4的腹水效價(jià) 為 1 :104,3H5 為 1:104，5F8 為 1 :103,6C2 為 1:106; 4) 單克隆抗體的生物素化： 將單抗用飽和硫酸銨沉淀，然后用蛋白G柱進(jìn)行純化，測(cè)定蛋白含量后用生物素進(jìn)行 標(biāo)記； 5) 單增李氏桿菌特異P60單抗的篩選： 用生物素化的P60單抗分別包被酶標(biāo)板，將李氏桿菌屬所有菌株過(guò)夜培養(yǎng)的上清加入 酶標(biāo)反應(yīng)孔，根據(jù)反應(yīng)測(cè)定的0D值大小，篩選獲得與單核細(xì)胞增生性李氏桿菌特異性反應(yīng) 強(qiáng)的單抗株6C2 ; 6) A-B ELISA檢測(cè)方法的建立： 用生物素化的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌特異性6C2單抗包被酶標(biāo)板，將李氏桿菌屬所 有菌株過(guò)夜培養(yǎng)菌液的上清作為檢測(cè)抗原加入酶標(biāo)板中，再加入生物素化的單抗和辣根過(guò) 氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，測(cè)定〇D630nm的值； 7) 待檢樣品的定量分析： 將表達(dá)純化的重組p60作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液（2000pg/ml )，倍比稀釋后加入反應(yīng)孔中，再加 入生物素化6C2單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，測(cè)定每孔的0D630nm值，根據(jù)測(cè) 定結(jié)果繪制不同濃度重組P60與其吸光值（0D)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用待檢樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行如上操作，根據(jù)所測(cè)0D值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待檢樣品的濃度。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明在篩選單增特異性P60單克隆抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物素（B)-親和素（A)信號(hào) 放大系統(tǒng)，大大提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。再結(jié)合建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢樣 品中靶抗原的定量分析。本發(fā)明所涉及的A-B ELISA方法，不僅克服了傳統(tǒng)通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)、 鑒定李氏桿菌種費(fèi)事費(fèi)力敏感性低的缺點(diǎn)，而且應(yīng)用生物素（B)-親和素（A)酶放大系統(tǒng)， 使A-B ELISA比已有的ELISA方法更敏感，檢測(cè)限更低，此外，還可以通過(guò)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 對(duì)待檢抗原進(jìn)行定量分析，該方法敏感性高，更加易于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為SDS-PAGE分析重組P60蛋白的純化效果。
[0014] 其中，泳道Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量，泳道1 :誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，泳道2 :純化后的重組蛋 白。
[0015] 圖2為抗Ρ60單克隆抗體的亞型鑒定結(jié)果。
[0016] 圖3為單克隆抗體腹水SDS-PAGE電泳（圖3-Α)和純化分析（圖3-Β)。
[0017] 圖3-Α中，泳道Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；泳道1為2Ε4腹水；泳道2為純化后的2Ε4 蛋白；泳道3為3Η5腹水；泳道4為純化后3Η5蛋白；泳道5為5F8腹水；泳道6為純化后 5F8蛋白；泳道7為6C3腹水；泳道8為純化后6C3蛋白。
[0018] 圖3-Β中，泳道Μ :蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量（從上到下蛋白分子量分別為170ku，130ku， 72ku，55ku，43ku，17ku，10ku);泳道1為純化后的2E4蛋白；泳道2為純化后5F8蛋白；泳 道3為純化后6C2蛋白。
[0019] 圖4為四株單抗與李氏桿菌屬不同菌株培養(yǎng)上清的夾心ELISA反應(yīng)結(jié)果。
[0020] 其中，各標(biāo)注分別為：?jiǎn)魏思?xì)胞增多性李氏桿菌ΓΖ. L. M， 4B，4D是其2個(gè)不同的血清型)、綿羊李氏桿菌(Z. LIV和LBA)、無(wú)害李氏桿菌 CL. i/wocwa, LIN)、威斯梅爾氏李氏桿菌(Z. LW)、西里杰氏李氏桿菌(人 sedigeri，LS )，空白樣品（B1 ank, K )。
[0021] 圖5為A-B ELISA定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022] 其中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，縱坐標(biāo)為所測(cè)的0D630nm。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是以篩選的單增李氏桿菌p60特異單抗為基礎(chǔ)，并進(jìn)行生 物素化處理，大大提高了檢測(cè)的特異性和敏感性。國(guó)外也有用篩選的P60單抗進(jìn)行夾心 ELISA檢測(cè)的報(bào)道，但與本發(fā)明有明顯區(qū)別。本發(fā)明所涉及的檢測(cè)技術(shù)，一是所用單抗株與 國(guó)外相關(guān)技術(shù)不同，二是利用了生物素-鏈霉素酶放大系統(tǒng)。因此，理論上應(yīng)明顯優(yōu)于國(guó)外 同類檢測(cè)技術(shù)。
[0024] 實(shí)施例1 : 1、免疫抗原的制備： 將攜帶PET-P60質(zhì)粒的BL21重組菌株37°C培養(yǎng)過(guò)夜，將菌液按1. 0%接種入含卡那霉 素（5(^g/mL)的2XYT培養(yǎng)基中，37°C劇烈振搖3?4 h，加 IPTG (終濃度為1 mmoL/L)誘 導(dǎo)4?5 h。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心收集菌體，反復(fù)凍融及超聲波處理后收集上清，用鎳瓊 脂糖凝膠FF純化回收目的蛋白，用SDS-PAGE分析重組P60蛋白的純化效果（如圖1所示）， 用 Thermo Scientific Nano Drop 2000 測(cè)定蛋白濃度。
[0025] 2、Balb/c小鼠的免疫與細(xì)胞融合： 首次免疫用純化P60蛋白100 μ g加等量福氏完全佐劑，混勻成乳劑，皮下注射6?8 周齡雌性BALB/c小鼠，此后改用福氏不完全佐劑乳化抗原，隔20d免疫注射1次，共免疫3 次。于融合前3d，經(jīng)小鼠腳掌肌肉加強(qiáng)免疫后，斷尾采血，用間接ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體 效價(jià)。選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫小鼠脾細(xì) 胞（1:10)在500 g/L PEG介導(dǎo)下進(jìn)行融合。加入含有次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核 苷（HAT)的RPMI 1640選擇性培養(yǎng)液，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)2周后換次黃嘌呤2胸腺 嘧啶核苷(HT)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
[0026] 3、雜交瘤細(xì)胞的克隆與亞型鑒定： 將檢測(cè)出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底 1/4?1/3時(shí)，再用同樣方法進(jìn)行檢測(cè)，選擇陽(yáng)性值高的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行再克隆，直至陽(yáng) 性率達(dá)到100 %。用P60抗原包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，4 °C包被過(guò)夜。按100 μ 1/孔加 入雜交瘤培養(yǎng)上清液，37°C反應(yīng)1 h，洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG抗 體，每孔100yL，37 °C反應(yīng)lh，洗滌3次，再加入底物（0PD)顯色，每孔100yL，并用2mol/ L H2S04終止，每孔50 μ L，在酶標(biāo)儀上測(cè)定0D630值。陰性對(duì)照孔為1 :200的正常Balb/c 小鼠血清，陽(yáng)性對(duì)照孔為1 :200的免疫小鼠血清。
[0027] 經(jīng)細(xì)胞融合與克隆篩選，共獲得4株p60單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別為2E4、 5F8、3H5和6C2。單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定表明（如圖2所示），2E4、5F8和6C2 為IgGl亞型，3H5為IgG2a亞型。
[0028] 4、單克隆抗體腹水的制備與效價(jià)測(cè)定： Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟（高壓滅菌)，7?10 d后腹腔注入IX 106? 5X106個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7?10 d可見小鼠腹部明顯膨大，進(jìn)行無(wú)菌操作采集腹水。 用吸管收取腹水，l〇〇〇r/min離心10 min，棄去最上層的脂肪層，收集中間層液體，即為單 克隆抗體腹水。用重組P60抗原包被96孔酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，將粗純的腹水10倍系列稀釋 (1 :10?1 :109)，采用間接ELISA測(cè)定2E4的腹水效價(jià)為1 :104,3H5為1 :104,5F8為1 :103， 6C2 為 1 :106。
[0029] 采用飽和硫酸銨沉淀法結(jié)合HiTrap Protein G HP Columns純化腹水，進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，Thermo Scientific Nano Drop 2000 測(cè)定純化后腹水的濃度。
[0030] 5、四株單克隆抗體的抗原表位分析： 用P60抗原包被酶標(biāo)板，將腹水按不同比例稀釋，用間接ELISA以進(jìn)行腹水親和力的測(cè) 定。四株單抗識(shí)別抗原表位的分析結(jié)果如表1所示。根據(jù)表1數(shù)據(jù)計(jì)算表明，2E4與3H5識(shí) 別相同的抗原表位，2E4與5F8識(shí)別相同的抗原表位；2E4與6C2識(shí)別相同的抗原表位；3H5 與5F8識(shí)別相同的抗原表位；3H5與6C2識(shí)別相同的抗原表位；5F8與6C2識(shí)別相同的抗原 表位。
[0031] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 單核細(xì)胞增生性李氏桿菌P60蛋白雜交瘤細(xì)胞株6C2,其保藏編號(hào)為CGMCC No.8768。
2. 單核細(xì)胞增生性李氏桿菌p60單克隆抗體，其特征在于，是由保藏編號(hào)為CGMCC No. 8768的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌p60蛋白雜交瘤細(xì)胞株6C2產(chǎn)生的。
3. 單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法，其特征在于，是用純化的重組單核細(xì)胞增生 性李氏桿菌P60蛋白作為免疫原制備得到權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株6C2,篩選出能 特異性識(shí)別單核細(xì)胞增生性李氏桿菌P60的如權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌 P60單克隆抗體，并進(jìn)行生物素化處理，以A-B ELISA方法建立定性檢測(cè)和定量分析單增李 氏桿菌p60的檢測(cè)方法。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以 下步驟： 1) ρ60蛋白的表達(dá)及純化： 提取單核細(xì)胞增生性李氏桿菌4b的基因組DNA，PCR擴(kuò)增p60基因，定向克隆入 pET-30a表達(dá)載體，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)； 2) 雜交瘤細(xì)胞株的建立： 用純化的P60蛋白作為免疫原反復(fù)免疫Balb/c小鼠，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與免疫 小鼠脾細(xì)胞在500g/L PEG介導(dǎo)下進(jìn)行融合，獲得雜交瘤細(xì)胞株； 3) 抗p60單克隆抗體的篩選與鑒定： 將P60抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆，得到4株抗單核細(xì)胞增生性 李氏桿菌P60蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別為6C2, 2E4, 3H5, 5F8,取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用單 克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的免疫球蛋白類型及亞型，其中2E4、5F8和6C2 為IgGl亞型，3H5為IgG2a亞型，將雜交瘤接種小鼠腹腔收集腹水，測(cè)定2E4的腹水效價(jià)為 1 :104,3H5 為 1:104，5F8 為 1 :103,6C2 為 1:106; 4) 單克隆抗體的生物素化： 將單抗用飽和硫酸銨沉淀，然后用蛋白G柱進(jìn)行純化，測(cè)定蛋白含量后用生物素進(jìn)行 標(biāo)記； 5) 單增李氏桿菌特異P60單抗的篩選： 用生物素化的P60單抗分別包被酶標(biāo)板，將李氏桿菌屬所有菌株過(guò)夜培養(yǎng)的上清加入 酶標(biāo)反應(yīng)孔，根據(jù)反應(yīng)測(cè)定的0D值大小，篩選獲得與單核細(xì)胞增生性李氏桿菌特異性反應(yīng) 強(qiáng)的單抗株6C2 ; 6. A-B ELISA檢測(cè)方法的建立： 用生物素化的單核細(xì)胞增生性李氏桿菌特異性6C2單抗包被酶標(biāo)板，將李氏桿菌屬所 有菌株過(guò)夜培養(yǎng)菌液的上清作為檢測(cè)抗原加入酶標(biāo)板中，再加入生物素化的單抗和辣根過(guò) 氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，測(cè)定〇D630nm的值； 7) 待檢樣品的定量分析： 將表達(dá)純化的重組P60作為2000pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，倍比稀釋后加入反應(yīng)孔中，再加 入生物素化6C2單抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，測(cè)定每孔的0D630nm值，根據(jù)測(cè) 定結(jié)果繪制不同濃度重組P60與其吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待檢樣品代替標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行如 上操作，根據(jù)所測(cè)0D值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待檢樣品的濃度。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104099299SQ201410130271
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】駱學(xué)農(nóng), 才學(xué)鵬, 王佩雅, 朱學(xué)亮, 王芳, 張少華 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所