一種用于擴(kuò)增i型單純性皰疹病毒的lamp引物組及試劑盒與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于擴(kuò)增I型單純性皰疹病毒的LAMP引物組及試劑盒與應(yīng)用。該引物組包括如SEQ?ID?NO:1～6所示核苷酸序列的6條引物。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)HSV-I病毒的試劑盒，以及非診斷目的檢測(cè)HSV-I病毒的方法。經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的引物進(jìn)行HSV-I病毒檢測(cè)，準(zhǔn)確性可達(dá)100%。且利用臨床常見病毒作為對(duì)照檢測(cè)的過程中，無假陽性現(xiàn)象產(chǎn)生。并且，本發(fā)明提供的引物在HSV-I病毒檢測(cè)中，靈敏度可達(dá)101copies/μL。適用于門診和基層醫(yī)生對(duì)HSV-I病毒性角膜炎、HSV-I病毒性結(jié)膜炎、HSV-I病毒性視網(wǎng)膜炎等疾病的快速診斷。
【專利說明】—種用于擴(kuò)增I型單純性皰疹病毒的LAMP引物組及試劑盒與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于擴(kuò)增I型單純性皰疹病毒的LAMP引物組及試劑盒與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]單純皰疫病毒(herpes simplex virus, HSV)屬于皰疫病毒科α病毒亞科，自然界的唯一宿主為人，分為I型和II型。其中，I型單純皰疹病毒(HSV-1)常引起單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)、HSV_I病毒性結(jié)膜炎、HSV-1病毒性視網(wǎng)膜炎等疾病。其中，HSK是發(fā)病率第一位的病毒性角膜炎，常會(huì)引起角膜潰瘍，角膜穿孔，而致盲。正常成人HSV血清陽性率為90%，即大部分人的三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)都有HSV潛伏，當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，潛伏的HSV將引起復(fù)發(fā)性的HSV角膜炎。
[0003]目前，常用的HSV-1檢測(cè)方法有:病毒培養(yǎng)法、ELISA法、PCR法、熒光定量PCR法等。病毒培養(yǎng)法要求具備嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和設(shè)施，具有國(guó)家認(rèn)可的專業(yè)化病毒培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室才能開展，成本高；并且這種方法周期長(zhǎng)，通常一次培養(yǎng)需要1-3天，耗時(shí)費(fèi)力，易貽誤診斷治療的最佳時(shí)機(jī)。ELISA法雖然操作簡(jiǎn)單，較為便捷，但敏感性和特異性差，容易出現(xiàn)假陽性。PCR法或熒光定量PCR法具有較好的敏感性、特異性，是目前所有HSV-1檢測(cè)方法中最為精確的方法，但這兩種方法都需要昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備和試劑，操作步驟復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，對(duì)人員技術(shù)要求高，不能方便的在臨床開展。
[0004]可見，目前常用的幾種HSV-1檢測(cè)方法已經(jīng)不能滿足日常門診的快速診斷或基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用。而由于這些方法的局限，目前眼科臨床的現(xiàn)狀是大部分患者沒有經(jīng)過準(zhǔn)確的病原微生物檢測(cè)，只憑醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行診斷治療，導(dǎo)致抗生素使用較混亂、增加了醫(yī)療成本和醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)。因此，急需開 發(fā)一種敏感性高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便快捷、檢測(cè)準(zhǔn)確，成本較低的檢測(cè)單純皰疹I(lǐng)型病毒的方法。
[0005]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是2000年日本榮研化學(xué)株式會(huì)社開發(fā)的替代PCR核酸擴(kuò)增方法。該方法主要是利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的特定區(qū)域，在等溫條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)基因檢測(cè)手段(如PCR等)相比，LAMP反應(yīng)在恒溫水浴箱便可完成，儀器設(shè)備要求低，較傳統(tǒng)PCR和培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)單許多，不需要專業(yè)人員也可準(zhǔn)確完成，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。并且，LAMP還可以大大縮短操作時(shí)間，減少了樣品污染機(jī)會(huì)，適合應(yīng)用于HSV-1病毒的快速診斷。
[0006]但是，由于LAMP的靈敏度和特異性極度依賴于引物的特性，然而良好的LAMP引物不易獲得，因此，目前還未見基于LAMP技術(shù)對(duì)HSV-1病毒樣品直接檢測(cè)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種用于擴(kuò)增I型單純性皰疹病毒的LAMP引物組及試劑盒與應(yīng)用，本發(fā)明提供的引物靈敏度和特異性皆很高，將其制備成為試劑盒可實(shí)現(xiàn)對(duì)HSV-1病毒快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增HSV-1病毒的LAMP弓丨物組，包括如SEQ IDNO:1~6所示核苷酸序列的6條引物。
[0009]本發(fā)明提供的LAMP引物組針對(duì)HSV-1病毒的特異保守區(qū)域(靶基因)，由6條引物組成，包括序列如SEQ ID N0:1~2所示的內(nèi)引物(FIP/BIP)、序列如SEQ ID N0:3~4所示的外引物(F3/B3)和序列如SEQ ID NO:5~6所示的環(huán)引物(LPF/LPB)。其中，F(xiàn)IP/BIP分別為上下游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和FlC區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)lC區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。F3/B3分別為上下游外部引物，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。LPF/LPB分別為上下游環(huán)引物，與擴(kuò)增過程中形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合的區(qū)域在F2和Fl之間。這樣的設(shè)計(jì)可以保證引物具有更高的特異性，從而避免在檢測(cè)過程中出現(xiàn)假陽性。
[0010]本發(fā)明提供的引物組可用于判斷待測(cè)樣品是否受到HSV-1病毒的污染。
[0011]本發(fā)明提供的引物組在制備檢測(cè)眼部樣品、皮膚、口腔黏膜、分泌物、排泄物或餐具中HSV-1病毒的試劑中的應(yīng)用。
[0012]作為優(yōu)選，眼部樣品為眼瞼組織、角膜組織、淚液、房水或玻璃體。
[0013]本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)HSV-1病毒的試劑盒，包括本發(fā)明提供的用于擴(kuò)增HSV-1病毒的LAMP引物組。
[0014]作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的用于檢測(cè)HSV-1病毒的試劑盒還包括:LAMP反應(yīng)液、LAMP密封液和LAMP顯色液。
[0015]優(yōu)選的，LAMP反應(yīng)液中包括:Bst聚合酶，LAMP反應(yīng)緩沖液，超純水。
`[0016]更優(yōu)選的，LAMP反應(yīng)緩沖液中包括:硫酸鎂、甜菜堿、dNTP、Tris_HCl、超純水。
[0017]優(yōu)選的，LAMP密封液為甘油。
[0018]優(yōu)選的，LAMP顯色液中包括SYBR green I或鈣黃綠素。
[0019]本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的HSV-1病毒檢測(cè)方法，包括以下步驟:
[0020]步驟1:取待測(cè)樣品與滅菌生理鹽水混合，獲得樣品混懸液；取如權(quán)利要求1的引物組與水混合，制得引物組工作液；
[0021 ] 步驟2:取樣品混懸液、引物組工作液與LAMP反應(yīng)液、超純水、LAMP密封液混合，制得擴(kuò)增反應(yīng)液；
[0022]步驟3:取擴(kuò)增反應(yīng)液，65°C反應(yīng)30min，顯色，根據(jù)顯色結(jié)果判斷樣品是否含有HSV-1病毒。
[0023]作為優(yōu)選，顯色采用LAMP顯色液，其中包含SYBR green I或鈣黃綠素，顯色結(jié)果呈現(xiàn)綠色則待測(cè)樣品中含有HSV-1病毒，不呈現(xiàn)綠色則待測(cè)樣品中不含有HSV-1病毒。
[0024]不呈現(xiàn)綠色的情況包括:顯色結(jié)果為橙色、其它顏色或無色。
[0025]作為優(yōu)選，待測(cè)樣品為眼部組織、皮膚、分泌物、排泄物或餐具。
[0026]作為優(yōu)選，擴(kuò)增反應(yīng)液中，引物組工作液、LAMP反應(yīng)液、樣品混懸液、超純水和LAMP密封液的體積比為1:13.5:2: (7.5~8.5):20。
[0027]作為優(yōu)選，引物組工作液中，
[0028]如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的濃度為25~50 μ mol/L ；
[0029]如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的引物的濃度為25~50 μ mol/L ；[0030]如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的引物的濃度為15~30 μ mol/L ；
[0031]如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的引物的濃度為15~30 μ mol/L ；
[0032]如SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物的濃度為5~10 μ mol/L ；
[0033]如SEQ ID N0:6所示核苷酸序列的引物的濃度為5~10 μ mol/L。
[0034]優(yōu)選的，引物組工作液中，
[0035]如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的濃度為40 μ mol/L ；
[0036]如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的引物的濃度為40 μ mol/L ；
[0037]如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的引物的濃度為20 μ mol/L ；
[0038]如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的引物的濃度為20 μ mol/L ；
[0039]如SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物的濃度為5 μ mol/L ；
[0040]如SEQ ID N0:6所示核苷酸序列的引物的濃度為5 μ mol/L。
[0041]作為優(yōu)選，LAMP顯色液與擴(kuò)增反應(yīng)液的體積比為1:45。
[0042]本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增HSV-1病毒的LAMP引物組，包括如SEQ ID NO:1~6所示核苷酸序列的6條引物。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)HSV-1病毒的試劑盒，以及檢測(cè)HSV-1病毒的方法。本發(fā)明基于LAMP技術(shù)，針對(duì)HSV-1病毒的特異保守區(qū)域設(shè)計(jì)6條引物。因此，本發(fā)明提供的引物組敏感性高、特異性強(qiáng)，由其制成的試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)到待測(cè)樣品中含有的單純性皰疹病毒。并且，由于本發(fā)明提供的引物組具有極高的特異性，因此，在LAMP擴(kuò)增中，無需提取樣品的DNA而直接進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)的時(shí)間，且簡(jiǎn)化了操作。經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的引物進(jìn)行HSV-1病毒檢測(cè)，準(zhǔn)確性可達(dá)100%。且利用臨床常見病毒作為對(duì)照檢測(cè)的過程中，無假陽性現(xiàn)象產(chǎn)生。并且，本發(fā)明提供的引物在HSV-1病毒的檢測(cè)中，靈敏度可達(dá)IO1c0Pies/μ L，與目前靈敏性最高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的敏感性相當(dāng)。而由于本發(fā)明提供的方法或試劑盒無需昂貴的儀器、也無需復(fù)雜的操作就可完成對(duì)HSV-1病毒的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，因此，適用于門診和基層醫(yī)生對(duì)HSV-1病毒性角膜炎、HSV-1病毒性結(jié)膜炎、HSV-1病毒性視網(wǎng)膜炎等疾病的快速診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1示待測(cè)樣品I~3和陰性對(duì)照I~3的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，其中，泳道I~3示陰性對(duì)照I~3的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果，泳道4~6示待測(cè)樣品I~3的電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0044]本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增I型單純性皰疹病毒的LAMP引物組及試劑盒與應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0045]本發(fā)明所用試劑皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。
[0046]其中:LAMP反應(yīng)液、LAMP密封液、LAMP顯色液購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司。
[0047]熒光PCR法HSV-1核酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自泰普生物科學(xué)有限公司。[0048]其它溶劑和試劑皆為普通市售品。
[0049]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明:
[0050]實(shí)施例1:本發(fā)明提供的LAMP引物組的準(zhǔn)確性
[0051]利用本發(fā)明提供的LAMP引物組檢測(cè)HSV-1病毒，實(shí)驗(yàn)設(shè)待測(cè)樣品組合陰性對(duì)照。LAMP引物組包含如SEQ ID NO:1~6所示序列的引物。實(shí)驗(yàn)分組如表1所示:
[0052]表1實(shí)驗(yàn)分組與所用樣品
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種用于擴(kuò)增HSV-1病毒的LAMP引物組，其特征在于，包括如SEQID NO:1~6所示核苷酸序列的6條引物。
2.如權(quán)利要求1所述的引物組在制備檢測(cè)眼部樣品、皮膚、分泌物、口腔黏膜、排泄物或餐具中HSV-1病毒的試劑中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述眼部樣品為眼瞼組織、角膜組織、淚液、房水或玻璃體。
4.一種用于檢測(cè)HSV-1病毒的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的LAMP引物組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括:LAMP反應(yīng)液、LAMP密封液和LAMP顯色液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述LAMP反應(yīng)液中，包括:Bst聚合酶，LAMP反應(yīng)緩沖液，超純水。
7.一種非診斷目的的HSV-1病毒檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟1:取待測(cè)樣品與滅菌生理鹽水混合，獲得樣品混懸液；取如權(quán)利要求1所述的引物組與水混合，制得引物組工作液； 步驟2:取所述樣品混懸液、所述引物組工作液與LAMP反應(yīng)液、超純水、LAMP密封液混合，制得擴(kuò)增反應(yīng)液； 步驟3:取所述擴(kuò)增反應(yīng)液，65°C反應(yīng)30min，顯色，根據(jù)顯色結(jié)果判斷樣品是否含有HSV-1病毒。`
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述擴(kuò)增反應(yīng)液中，所述引物組工作液、所述LAMP反應(yīng)液、所述樣品混懸液、所述超純水和所述LAMP密封液的體積比為1:13.5:2: (7.5 ~8.5):20。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述引物組工作液中， 如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的引物的濃度為25~50 μ mo I/L ； 如SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列的引物的濃度為25~50 μ mol/L ; 如SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列的引物的濃度為15~30 μ mol/L ； 如SEQ ID N0:4所示核苷酸序列的引物的濃度為15~30 μ mol/L ； 如SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的引物的濃度為5~10 μ mol/L ； 如SEQ ID N0:6所示核苷酸序列的引物的濃度為5~10 μ mol/L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103866049SQ201410131118
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月2日
【發(fā)明者】王卓實(shí), 董昊, 徐玲 申請(qǐng)人:何偉