檢測(cè)登革病毒及其分型的引物、探針及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)登革病毒及其分型的引物、探針及方法，屬于生物檢測(cè)、生物化學(xué)領(lǐng)域，采用的技術(shù)方案是，提供一種檢測(cè)登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型病毒及其分型的方法并提供該方法所用的引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物SEQIDNo：1-4、擴(kuò)增登革病毒目的片段的引物SEQIDNo：5-12及檢測(cè)登革病毒的探針SEQIDNo：13-16。本發(fā)明的有益效果是：（1）針對(duì)不同血清型登革病毒分別設(shè)計(jì)特異性引物、探針序列，擴(kuò)增效率及靈敏度、及準(zhǔn)確性高；（2）多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合液相芯片，具有通量大，特異性及靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，能夠?qū)Φ歉锊《具M(jìn)行快速分型檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)登革病毒及其分型的引物、探針及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)、生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)登革病毒及其四種血清分型的方法，提供特異性引物和探針。
【背景技術(shù)】
[0002]登革熱是登革病毒感染引起，由蚊媒傳播的急性傳染病，是世界上分布最廣、發(fā)病最多的蟲媒病毒病。臨床表現(xiàn)為高熱、頭痛、肌肉、骨關(guān)節(jié)劇烈酸痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大、白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少等，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)的，以與中國(guó)接壤的東南亞國(guó)家最為嚴(yán)重。隨著境外旅游、商務(wù)的發(fā)展，人口流動(dòng)性增加，缺乏有效疫苗及治療措施，登革熱已經(jīng)成為世界性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題。因此需要快速、靈敏的方法用于在感染過(guò)程中的早期對(duì)登革熱感染進(jìn)行檢測(cè)以進(jìn)行更好的進(jìn)行病人管理。[0003]在對(duì)登革病毒檢測(cè)方面，目前主要有病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等方法。但這些方法或多或少存在一些缺陷:病毒分離不僅對(duì)樣本有嚴(yán)格的要求，在技術(shù)上要求高，且獲得病原學(xué)診斷結(jié)果至少需要I周，無(wú)法實(shí)現(xiàn)早期診斷病例的目的。而用血清免疫學(xué)方法檢測(cè)病毒的特異性抗體時(shí)，不僅需分別在患者感染的急性期及恢復(fù)期采集雙份血清，并且還存在與其他黃病毒之間存在交叉反應(yīng)。在核酸檢測(cè)方法方面，RT-PCR方法及熒光PCR方法等的靈敏度高，特異性好，適合于快速檢測(cè)鑒定，但大多方法基于單一血清型，在對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)法對(duì)樣本同時(shí)進(jìn)行四種血清型檢測(cè)，但仍然存在通量低的缺點(diǎn)。
[0004]對(duì)于分子實(shí)驗(yàn)室中大量樣本的常規(guī)檢測(cè)，研究者正致力于開發(fā)和建設(shè)以多重快速檢測(cè)為目標(biāo)的檢測(cè)平臺(tái)，典型的高通量多重分析技術(shù)包括生物芯片、毛細(xì)電泳和質(zhì)譜等，由于其能在同一反應(yīng)容器中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)核酸序列，因此在節(jié)約時(shí)間、勞動(dòng)和成本方面更具有優(yōu)勢(shì)，是高通量、特異、可靠、快速和經(jīng)濟(jì)的核酸檢測(cè)方法。
[0005]基于微球的液相芯片技術(shù)，提供了一個(gè)新的應(yīng)用面廣泛的高通量核酸檢測(cè)平臺(tái)。它包含有直徑5.6μπι的聚苯乙烯微球，其內(nèi)部染有兩種可以進(jìn)行光譜區(qū)分的熒光染料。精確控制兩種熒光染料的量，可獲得具有特異熒光編碼的100種不同微球組。每種微球表面都可以修飾上不同的反應(yīng)物。因?yàn)榭梢愿鶕?jù)微球的特異熒光編碼來(lái)區(qū)分不同的微球組，所以可以將它們混合在一起，在同一個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)檢測(cè)高達(dá)100種不同的分析物。在報(bào)告分子上還耦合有第三種熒光用于定量分析發(fā)生于微球表面的生物分子間的相互作用。微球在高速液流中經(jīng)由液相芯片分析儀的兩個(gè)獨(dú)立激光進(jìn)行分別檢測(cè)。一個(gè)635nm、10mW的紅色二極管激光激發(fā)微球上的兩種熒光，另一個(gè)532nm、13mW的釔鋁石榴石(YAG)激光激發(fā)結(jié)合在微球表面的報(bào)告分子的熒光(R-藻紅蛋白，Alexa532，或Cy3)。高速數(shù)字信號(hào)處理器根據(jù)熒光編碼地址對(duì)微球進(jìn)行分類并定量微球表面的反應(yīng)。每秒檢測(cè)數(shù)千個(gè)微球的能力使該分析系統(tǒng)可以在數(shù)秒內(nèi)對(duì)同一反應(yīng)容器中的每個(gè)樣品同時(shí)分析和報(bào)告高達(dá)100個(gè)不同的反應(yīng)。與其它檢測(cè)方法相比，基于液相芯片技術(shù)的檢測(cè)平臺(tái)具有需標(biāo)本量少、高通量檢測(cè)；高速度、低成本；靈敏度高、有重復(fù)性好、線性范圍廣、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]綜上所述，采用多重PCR技術(shù)聯(lián)合液相芯片技術(shù)，對(duì)登革病毒進(jìn)行分型檢測(cè)，不失為一種直觀、準(zhǔn)確、快速、適合早期診斷的檢測(cè)手段。然而，現(xiàn)有的登革熱病毒體外檢測(cè)試劑盒或提供的引物、探針，或特異性和靈敏性較低，或存在假陽(yáng)性結(jié)果，或檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)條件設(shè)置復(fù)雜，因此，設(shè)計(jì)檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度及特異性高的方法及特異性及靈敏度高、且有利于實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置的引物、探針，對(duì)提高檢測(cè)登革病毒及其分型的方法的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和實(shí)用性有重要意義，成為目前一直需要改進(jìn)的問(wèn)題之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供檢測(cè)登革病毒及其分型的引物、探針及方法，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)合核酸雜交技術(shù)，進(jìn)一步利用多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)結(jié)合液相芯片技術(shù)對(duì)登革病毒及其分型進(jìn)行特異性檢測(cè)。
[0008]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供用于引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物，所述引物至少包括如下一條:
用于引導(dǎo)登革I型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV1-RTP，其序列為SEQ ID No:l所示； 用于引導(dǎo)登革II型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV2-RTP，其序列為SEQ ID No:2所示； 用于引導(dǎo)登革III型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV3-RTP，其序列為SEQ ID No:3所示； 用于引導(dǎo)登革IV型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV4-RTP，其序列為SEQ ID No:4所示。
[0009]第二，本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增登革病毒目的片段的引物，所述引物至少包括如下一對(duì):
用于擴(kuò)增登革I型病毒目的片段的引物對(duì)DVl-F和DV1-R，其序列分別為SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ；
用于擴(kuò)增登革II型病毒目的片段的引物對(duì)DV2-F和DV2-R，其序列分別為SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ；
用于擴(kuò)增登革III型病毒目的片段的引物對(duì)DV3-F和DV3-R，其序列分別為SEQ ID No:
9和 SEQ ID No:10 ；
用于擴(kuò)增登革IV型病毒目的片段的引物對(duì)DV4-F和DV4-R，其序列分別為SEQ ID No:11 和 SEQ ID No:12 ；
第三，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)登革病毒分型的探針，所述探針包括如下1:至$中的至少一種:
Φ用于檢測(cè)登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:13所示；:S用于檢測(cè)登革II型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14所示；
%用于檢測(cè)登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:15所示；
Φ用于檢測(cè)登革IV型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 16所示。
[0010]最后，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，所述方法包括如下步驟:
1)合成上述用于擴(kuò)增登革病毒目的片段的引物和用于檢測(cè)登革病毒的探針，并對(duì)探針?lè)謩e標(biāo)記；
2)提取待測(cè)樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA模板；
3)以步驟I)所述引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產(chǎn)物；
5)檢測(cè)雜交信號(hào)并分析結(jié)果。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟I)合成引物后，對(duì)每對(duì)引物中的下游引物在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；所述對(duì)探針的標(biāo)記為對(duì)所有探針在5’端進(jìn)行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，并與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)有不同探針的微球混合，制成探針微球組；所述步驟4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后，對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行抗鏈霉素藻紅蛋白(英文全稱Streptavidin-R-phycoerythrin,縮寫SA-PE)標(biāo)記，得微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物；所述步驟5)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用液相芯片系統(tǒng)。
[0012]更優(yōu)選的，所述步驟I)探針微球組中偶聯(lián)有不同探針的微球個(gè)數(shù)相等。
[0013]所述步驟5)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用Bio-Plex? 200檢測(cè)系統(tǒng)。
[0014]另外，步驟2)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA時(shí)優(yōu)選采用SEQ ID NO:1-4所示的用于引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物。
[0015]所述步驟3) PCR擴(kuò)增采用不對(duì)稱擴(kuò)增，PCR體系中下游引物濃度為上游引物濃度的3-6倍。
[0016]上述方法中，I)首先根據(jù)檢測(cè)目的合成SEQ ID NO:5_12所示引物中的一對(duì)或多對(duì)及SEQ ID NO:13-16所示探針中的一個(gè)或多個(gè)，即如要檢測(cè)登革I型病毒，則合成用于擴(kuò)增登革I型病毒目的片段的引物對(duì)DVl-F和DV1-R，其序列為SEQ ID No:5和SEQ ID No:6，同時(shí)對(duì)應(yīng)合成用于檢測(cè)登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 13所示；如要檢測(cè)登革II型及登革III型病毒，則合成用于擴(kuò)增登革II型及登革III型病毒目的片段的引物對(duì)DV2-F和 DV2-R、DV3-F 和 DV3-R，其序列分別為 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8、SEQ ID No:9 和 SEQID No: 10，同時(shí)對(duì)應(yīng)合成用于檢測(cè)登革II型及登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14和SEQ ID NO: 15所示，其他合成方式類似上述，合成完畢后對(duì)不同種類探針進(jìn)行標(biāo)記以便于區(qū)分和檢測(cè)；2)提取待測(cè)樣品RNA采用本領(lǐng)域常用技術(shù)手段，加入引物使所提取的RNA序列反轉(zhuǎn)錄形成cDNA模板。其中，反轉(zhuǎn)錄弓丨物優(yōu)選的采用本發(fā)明提供的引物，其序列為SEQ IDNO:1-4所示，可特異性引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物從而進(jìn)行多重反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；3)對(duì)應(yīng)選取上述用于PCR擴(kuò)增的引物以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針在設(shè)定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)；5)根據(jù)探針標(biāo)記檢測(cè)雜交結(jié)果并分析。
[0017]基于上述方法，本發(fā)明優(yōu)選多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增結(jié)合液相芯片技術(shù)以檢測(cè)登革病毒及其分型。以檢測(cè)登革病毒的四個(gè)分型為例，具體步驟如下:1)合成SEQ ID No:1-4所示的用于引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物、SEQ ID No:5-12所示擴(kuò)增登革病毒目的片段的引物、及SEQ ID No:13-16所示用于檢測(cè)登革病毒分型的探針，其中，用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的所有下游引物序列在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記以利于后期信號(hào)標(biāo)記，所有探針在5’端均進(jìn)行胺基化修飾且連接C12鄰接臂序列，然后與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，將偶聯(lián)有不同探針的微球等個(gè)數(shù)混合制成探針微球組；2)提取待測(cè)樣本RNA，以SEQ ID No:1_4所示引物進(jìn)行多重反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得cDNA模板；3)以步驟I)中用于PCR擴(kuò)增的引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行多重不對(duì)稱PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；優(yōu)選的，擴(kuò)增體系中所加入下游引物的濃度為上游引物濃度的3-6倍，以增加目的片段的產(chǎn)量；4)將步驟3)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針微球組在設(shè)定條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，得雜交產(chǎn)物，進(jìn)一步對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行抗鏈霉素藻紅蛋白(英文全稱Streptavidin-R-phycoerythrin,縮寫SA-PE)標(biāo)記,形成微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物；上述所稱的雜交是指PCR產(chǎn)物變性后與偶聯(lián)有不同探針的微球組充分混合，并在一定的溫度條件下進(jìn)行核酸單鏈間互補(bǔ)配對(duì)雜交的過(guò)程；5)取微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE復(fù)合物以液相芯片系統(tǒng)優(yōu)選Bio-Plex? 200檢測(cè)其雜交信號(hào)，并根據(jù)本發(fā)明所提供標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果分析及判定。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:(I)針對(duì)四種血清型登革病毒，對(duì)RNA特異基因進(jìn)行特異性反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，增加了病毒檢測(cè)的特異性，減少了后期PCR擴(kuò)增中非特異序列對(duì)擴(kuò)增的影響，提1?擴(kuò)增效率，具有較1?的靈敏度；(2)用于PCR擴(kuò)增的特異基因序列的引物，都有很1?的靈敏度，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(3)針對(duì)不同血清型別登革病毒的特異性探針序列，堿基成分合理，具有比較均一的Tm值，探針與PCR產(chǎn)物的雜交溫度條件基本一致，有利于同一溫度下雜交的同步性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；(4)本發(fā)明的方法利用多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合液相芯片，具有通量大，特異性及靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，并且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，能夠?qū)Φ歉锊《具M(jìn)行快速分型檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用的材料、試劑、及所合成的引物和探針序列等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]實(shí)施例1:引物、探針序列的設(shè)計(jì)及合成
從Genebank中搜索登革病毒祀基因nonstructural protein NS5的序列，運(yùn)用相關(guān)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行同源性分析和序列比對(duì)分析，篩出高度保守區(qū)域，針對(duì)保守序列釆用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5進(jìn)行引物及探針的設(shè)計(jì)；引物及探針設(shè)計(jì)完畢后使用NCBI BLAST進(jìn)行特異性的檢驗(yàn)，并使用Primer premier 5檢測(cè)是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體形成，結(jié)果表明設(shè)計(jì)探針滿足特異性要求，且不會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者二聚體。所設(shè)計(jì)的引物、探針序列見表1。
[0021 ] 表1檢測(cè)登革病毒及其分型的引物、探針 _
【權(quán)利要求】
1.用于引導(dǎo)登革病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一條: 用于引導(dǎo)登革I型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV1-RTP，其序列為SEQ ID No:1所示； 用于引導(dǎo)登革II型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV2-RTP，其序列為SEQ ID No:2所示； 用于引導(dǎo)登革III型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV3-RTP，其序列為SEQ ID No:3所示； 用于引導(dǎo)登革IV型病毒基因反轉(zhuǎn)錄的引物DV4-RTP，其序列為SEQ ID No:4所示。
2.用于擴(kuò)增登革病毒目的片段的引物，其特征在于所述引物至少包括如下一對(duì): 用于擴(kuò)增登革I型病毒目的片段的引物對(duì)DVl-F和DV1-R，其序列分別為SEQ ID No:5 和 SEQ ID No:6 ； 用于擴(kuò)增登革II型病毒目的片段的引物對(duì)DV2-F和DV2-R，其序列分別為SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ； 用于擴(kuò)增登革III型病毒目的片段的引物對(duì)DV3-F和DV3-R，其序列分別為SEQ ID No:9 和 SEQ ID No:10 ； 用于擴(kuò)增登革IV型病毒目的片段的引物對(duì)DV4-F和DV4-R，其序列分別為SEQ ID No:11和 SEQ ID No:12o
3.用于檢測(cè)登革病毒分型的探針，其特征在于所述探針包括如下Φ至i中的至少一種: I用于檢測(cè)登革I型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:13所示； %用于檢測(cè)登革II型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO:14所示； I用于檢測(cè)登革III型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 15所示； I用于檢測(cè)登革IV型病毒的探針，其序列為SEQ ID NO: 16所示。
4.一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟: 1)合成權(quán)利要求2所述引物及權(quán)利要求3所述探針，并對(duì)探針?lè)謩e標(biāo)記； 2)提取待測(cè)樣品RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA模板； 3)以步驟I)所述引物對(duì)cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 4)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟I)中合成的探針雜交，得雜交產(chǎn)物； 5)檢測(cè)雜交信號(hào)并分析結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于: 所述步驟1)合成引物后，對(duì)每對(duì)引物中的下游引物在5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；所述對(duì)探針的標(biāo)記為對(duì)所有探針在5’端進(jìn)行胺基化修飾，連接C12鄰接臂序列，并與相應(yīng)熒光編碼的微球偶聯(lián)，然后將偶聯(lián)有不同探針的微球混合，制成探針微球組； 所述步驟4) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交后，對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行SA-PE標(biāo)記，得微球-探針-PCR產(chǎn)物-生物素-SA-PE的復(fù)合物； 所述步驟5)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用液相芯片系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于:所述步驟I)探針微球組中偶聯(lián)不同探針的微球個(gè)數(shù)相等。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于:所述步驟5)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)采用Bio-Plex? 200檢測(cè)系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于:步驟2)反轉(zhuǎn)錄形成cDNA時(shí)采用權(quán)利要求1所述的引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于:所述步驟3) PCR擴(kuò)增采用不對(duì)稱擴(kuò)增，PCR體系中下游引物濃度為上游引物濃度的3-6倍。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)登革病毒及其分型的方法，其特征在于:所述步驟4)雜交反應(yīng)的條件為96°C變性5 分鐘，55°C雜交30分鐘。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103898240SQ201410131592
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月3日
【發(fā)明者】韓偉, 史玲莉, 閆冀煥, 李云, 滑娜, 沈軍, 吳志茹, 蘭景, 李薇, 付曉昀 申請(qǐng)人:河北國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心