一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物，該探針組合物中包含有用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒，所述FISH試劑盒中包含如權(quán)利要求1-5中所述的FISH探針組合物。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案，直接采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)唾液中多種與食管癌相關(guān)miRNA基因進(jìn)行檢測(cè)，既可直接對(duì)樣品進(jìn)行原位定量，又可實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)早期食管癌的診斷與篩查。
【專利說(shuō)明】—種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)m i RNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物、試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，其大小長(zhǎng)約20~25個(gè)核苷酸。miRNA基因在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄后形成初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pr1-RNAs)。Pr1-RNA經(jīng)過(guò)一系列加工處理后成為19_25bp左右的成熟miRNA。成熟的miRNA在細(xì)胞中可以與蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA inducedsilencing complex, RISC)。RISC與祀mRNA基因不完全配對(duì)時(shí),可以阻斷miRNA的翻譯過(guò)程，降低表達(dá)；RISC與靶mRNA完全配對(duì)時(shí)，則可以導(dǎo)致mRNA的降解。miRNA通過(guò)阻斷或者降解的mRNA表達(dá)來(lái)控制靶基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控基因的分化、凋亡等一系列的過(guò)程【Hobert 0.Gene regulation by transcription factors and microRNAs[J].Science, 2008，319(5871): 1785-1786】。
[0003]腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因密不可分，環(huán)境因素以及遺傳等的因素都可以導(dǎo)致或者引起DNA的變化，從而激活原癌基因或引起腫瘤抑制基因的滅活，引起基因表達(dá)水平的異常，使靶細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)50%的miRNA基因位于原癌基因或抑癌基因的染色體脆性位點(diǎn)(fragile sites)或相關(guān)遺傳區(qū)域【Calin等，Human microRNA genes arefrequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(9):2999-3004.】。miRNA 基因往往在腫瘤中發(fā)生異常表達(dá)，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能夠作為致癌因子或抑癌因子參與腫瘤的各個(gè)過(guò)程，對(duì)比腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞間來(lái)源的miRNA發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)譜具有明顯差異【Castilla等，Micro-RNA signature of the epithelial-mesenchymal transition in endometrialcarcinosarcoma [J].J Pathol, 20`11, 223(1):72-80.】。研究表明 miRNA 在細(xì)胞凋亡、增殖、分化、血管生成及腫瘤形成等方面均具有重要的調(diào)節(jié)作用，參與人體大約30%的基因調(diào)節(jié)，與心血管疾病、腫瘤、免疫紊亂及代謝紊亂等多種發(fā)病有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)若干miRNA的負(fù)調(diào)控作用與白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌和結(jié)腸癌等高度相關(guān)。因此，miRNA在腫瘤診斷以及判斷預(yù)后等方面具有重要的參考價(jià)值。
[0004]食管癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，是世界上發(fā)病率第八死亡率第六的癌癥，我國(guó)是食管癌的高發(fā)地區(qū)，每年因食管癌死亡人數(shù)約為15萬(wàn)人，其死亡率占我國(guó)惡性腫瘤死亡率的第四位，近年來(lái)發(fā)病及死亡雖有下降趨勢(shì)，但目前仍然處于較高水平。如今新輔助化療的運(yùn)用，抗腫瘤生物靶向藥物的出現(xiàn)，基因制劑的研制，食管內(nèi)鏡等微創(chuàng)外科的開(kāi)展都為食道癌患者帶來(lái)了福音。但是食道癌的發(fā)病率和死亡率仍較高。目前食道癌的存活率仍較低，僅有3%~5%的患者能夠存活5年。由于早期癥狀不明顯，大部分臨床食管癌患者已到中晚期，且半數(shù)以已上發(fā)生腫瘤遷移。因此，提高食道癌的早期診斷水平和治療是至關(guān)重要的。
[0005]miRNA與食管癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系非常密切，通過(guò)檢測(cè)食管癌組織miRNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其在正常組織與腫瘤組織中的表達(dá)水平具有明顯的差異【Hanahan等，Thehallmarks of cancer[J].cell, 2000，100(I):57-70.】。Guo 等【Guo 等，DistinctivemicroRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cellcarcinoma [J].Cancer research, 2008, 68 (I): 26-33.】最早米用基因芯片的方法檢測(cè)了食管癌組織中的miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中有46種miRNA的表達(dá)明顯區(qū)別于癌旁正常組織，并找到了 7種miRNA可以區(qū)分惡性病變和正常食管癌組織。Ye等【Ye等，Genetic variations in microRNA-related genes are novel susceptibility loci foresophageal cancer risk [J].Cancer Prevention Research, 2008，I (6): 460-469.】通過(guò)對(duì)346例食管癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，7個(gè)miRNA相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性和食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，其中位于pre-miR423區(qū)的單核苷酸多態(tài)性rs6505162位點(diǎn)可能與降低食管癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，表明miRNA基因組水平的改變和食管癌的發(fā)生有關(guān)，這些miRNA可作為食管癌診斷的分子標(biāo)志物。Kan 等【Kan 等,The miR-106b-25Polycistron, Activated by GenomicAmplification, Functions as an Oncogene by Suppressing p21and Bim[J].Gastroenterology, 2009, 136(5): 1689-1700.】用微陣列芯片法研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織mir-106b_25有異常表達(dá)，并用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)證實(shí)其存在。Komatsu等【Komatsu等，Circulating microRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cellcarcinoma [J].British journal of cancer, 2011，105 (I): 104-111.】對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌患者血漿中循miRNAs進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA-21表達(dá)水平明顯高于正常人，提出高水平表達(dá)的RNA-21容易侵襲血管，產(chǎn)生血行轉(zhuǎn)移，并與腫瘤的發(fā)有著密切的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)miRNAs可能成為檢測(cè)和診斷食道癌新的腫瘤基因標(biāo)志物。通過(guò)研究這些不正常的miRNA，將有助于進(jìn)一步闡明食管癌的發(fā)病機(jī)制，并將有助于食管癌癌變組織的檢測(cè)、診斷、治療以及預(yù)后的判斷。
[0006]多種miRNAs已被發(fā)現(xiàn)在食管癌患者的組織和血漿內(nèi)表達(dá)失調(diào)，并對(duì)食管癌具有檢測(cè)診斷作用【Komatsu 等，Circulating microRNAs in plasma ofpatients with oesophageal squamous cell carcinoma[J].British journal ofcancer, 2011, 105 (I): 104-111.】。由于唾液腺血運(yùn)豐富，被認(rèn)為是血循環(huán)的末端產(chǎn)物，幾乎所有的在血液中存在的分子物質(zhì)也見(jiàn)于唾液中，如蛋白、RNA、DNA、病毒顆粒等【Lee等，Saliva:an emerging biofluid for early detection of diseases[J].American journalof dentistry, 2009, 22(4):241.】。近年來(lái)也有研究報(bào)道組織、血漿和唾液三者具有相似的miRNA表達(dá)譜，即若干個(gè)同種miRNA在患者的癌組織、血液和唾液中的表達(dá)同時(shí)發(fā)生了顯著的變化[Wiklund等，MicroRNA alterations and associated aberrant DNA methylationpatterns across multiple sample types in oral squamous cell carcinoma[J].PLoSOne，2011，6 (I I): e27840.】。我們的前期研究【吳偉東等，唾液中miRNA-144可作為早期診斷食道癌的基因標(biāo)志物[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013(12).】表明食道癌患者唾液中miRNA-144存在高表達(dá)，可作為早期診斷食道癌的基因標(biāo)志物，因此開(kāi)展唾液中miRNA_144基因及其他在食道癌中表達(dá)差異顯 著的miRNA的FISH (熒光原位雜交技術(shù)，fluorescentin situ hybridization)檢測(cè)將有助于食道癌的早期篩查與診斷。[0007]國(guó)內(nèi)外對(duì)食管癌組織miRNA分析的方法很多，如基因芯片篩選食管癌miRNA，RT-PCR定量分析等?；蛐酒梢灾苯訙y(cè)定一份標(biāo)本的多種miRNA，但是此方法背景和雜信號(hào)干擾大，重復(fù)性差，不能區(qū)分差異小的miRNA，因此被用于食管癌miRNA的篩選。RT-PCR技術(shù)通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目標(biāo)miRNA轉(zhuǎn)錄基因的擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)推算目標(biāo)基因的量，靈敏度高，精確度高，但是多了轉(zhuǎn)錄步驟，程序略復(fù)雜。此外，由于實(shí)驗(yàn)條件的差異，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)效果，例如:
(I)標(biāo)本離體時(shí)間、保存條件不同，影響組織樣本中可能的RNA的降解；(2)總RNA提取方法不同、試劑不同，影響核酸回收率，并最終影響定量；(3)因儀器、試劑不同，cDNA合成效率不同。由于以上實(shí)驗(yàn)條件沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)使結(jié)果的重復(fù)性較差，有的甚至出現(xiàn)截然相反的結(jié)論，嚴(yán)重阻礙著食管癌組織miRNA檢測(cè)的發(fā)展和應(yīng)用。再者，食管癌組織miRNA檢測(cè)需要采集較多的新鮮組織(20~80mg)，不宜作為術(shù)前篩查，也阻礙著食管癌組織miRNA檢測(cè)。
[0008]綜上所述，本領(lǐng)域中尚無(wú)采用FISH技術(shù)檢測(cè)唾液中食道癌的基因標(biāo)志物miRNA基因，因此可開(kāi)發(fā)該技術(shù)應(yīng)用于食道癌早期篩查工作中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，一方面，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物。
[0010]本發(fā)明的用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物，其特征在于，該探針組合物中包含有用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針。
[0011]優(yōu)選地，所述與食管癌相關(guān)miRNA基因至少包含以下基因中的一種:
[0012]hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
[0013]其中，所述hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因?yàn)樯险{(diào)基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因?yàn)橄抡{(diào)基因。
[0014]優(yōu)選地，所述FISH探針為以下核酸探針中的至少一種:
[0015](I)針對(duì)hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的核酸探針:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ；
[0016](2)針對(duì)hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的核酸探針:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ；
[0017](3)針對(duì)hsa-miR_196b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示的核酸探針:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ；
[0018](4)針對(duì)hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的核酸探針:5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，；
[0019](5)針對(duì)hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示的核酸探針:5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，；
[0020](6 )針對(duì)hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示的核酸探針:5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，；
[0021](7)針對(duì)hsa-miR_135b基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示的核酸探針:5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，；
[0022](8)針對(duì)hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.8所示的核酸探針:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ；
[0023](9)針對(duì)hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的核酸探針:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ；[0024](10)針對(duì)hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示的核酸探針:5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，；
[0025](11)針對(duì)hsa-miR-129基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.11所示的核酸探針:5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，；
[0026](12)針對(duì)hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.12所示的核酸探針:5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；
[0027](13)針對(duì)hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.13所示的核酸探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ；
[0028](14)針對(duì)hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.14所示的核酸探針:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，；
[0029](15)針對(duì)hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示的核酸探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
[0030]作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述FISH探針為核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探針的組合。
[0031]另一方面，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒，所述FISH試劑盒中包含上述方案中所公開(kāi)的FISH探針組合物。
[0032]優(yōu)選地，本發(fā)明的FISH試劑盒中所用的FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過(guò)將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5ng/μ 1，所述2 X SSC緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
[0033]優(yōu)選地，本發(fā)明的FISH試劑盒中還包括4’，6_ 二脒基_2_苯基吲哚復(fù)染液。
[0034]再則，本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題還在于提供了一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0035](I)將待檢測(cè)唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對(duì)玻片上的唾液樣品進(jìn)行預(yù)處理；
[0036](2)分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個(gè)探針加2個(gè)復(fù)孔，使探針待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交；
[0037](3)雜交后，對(duì)玻片進(jìn)行洗滌；
[0038](4)使用復(fù)染液對(duì)玻片上的雜交區(qū)域進(jìn)行復(fù)染；
[0039](5)使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區(qū)域。
[0040]優(yōu)選地，該FISH試劑盒的使用方法的相應(yīng)步驟中包含如下(I) - (4)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)的具體操作方式:
[0041](I)步驟(1)中將待檢測(cè)唾液樣品固定和預(yù)處理具體為:
[0042]①將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min ；
[0043]②去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液，混勻，后放入37°C水浴30min ；
[0044]③加入2ml固定液預(yù)固定,混合均勻后1500rpm離心8min ;該固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液
[0045]④去上清,加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min,去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0046]⑤取出預(yù)固定好的唾液標(biāo)本，1500rpm離心8min,去上清,加適量固定液；
[0047]⑥吹打混勻后吸取少量細(xì)胞固定液滴片于防脫落載玻片上，自然晾干，56°C烤片30min,防止掉片，滴片前一定要將細(xì)胞吹打散開(kāi)，滴片時(shí)保證細(xì)胞均勻散開(kāi)，防止細(xì)胞太密集，也要保證有足夠計(jì)數(shù)的細(xì)胞；
[0048]⑦將上步所得玻片置于37°C預(yù)熱的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗滌玻片，增加細(xì)胞核的通透性；
[0049]⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min ;
[0050]⑨玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0051]⑩將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進(jìn)行梯度脫水，自然晾干玻片；
[0052](2)步驟(2)將待探針與玻片上的待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交具體為:①分別取15種探針試劑I μ 1，2 X SSC緩沖液9 μ 1，混合得到15種不同的探針混合液將上述15種探針混合液分別滴加于樣品處，每個(gè)探針加樣2個(gè)復(fù)孔，蓋上蓋玻片，于雜交儀上73°C變性5min，37°C雜交過(guò)夜；
[0053](3)步驟(3)玻片洗滌具體為:①去掉封片膠和蓋玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min;②將玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2XSSC中，晃動(dòng)l_3S，5min后取出；
③70%、95%乙醇中脫水各2min，甩干，自然干燥；
[0054](4)步驟(3)復(fù)染具體為:向雜交區(qū)加入15 μ 1DAPI，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置10-20min。
[0055]相比于現(xiàn)有檢測(cè)方法，本發(fā)明的技術(shù)方案至少具有以下優(yōu)勢(shì):
[0056]現(xiàn)有技術(shù)中，常采用PCR或Q-PCR對(duì)血液樣品中mir_144等基因進(jìn)行檢測(cè)，在該過(guò)程中涉及到核酸抽提、逆轉(zhuǎn)錄及PCR等繁瑣步驟，且采集血液會(huì)對(duì)病患造成創(chuàng)傷性；本試劑盒直接采用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)唾液中多種與食管癌相關(guān)miRNA基因進(jìn)行檢測(cè)，既可直接對(duì)樣品進(jìn)行原位定量，又可達(dá)到無(wú)創(chuàng)早期食管癌的診斷與篩查。由于食道癌患者唾液中多種miRNA存在高表達(dá)，可作為早期診斷食道癌的基因標(biāo)志物，因此采用本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)唾液對(duì)與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)的檢測(cè)可達(dá)到易采集、無(wú)創(chuàng)傷性、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。另外，采用本發(fā)明的方案能夠同時(shí)對(duì)多種(最多15種)與食管癌相關(guān)miRNA基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，技術(shù)實(shí)踐中，如何使多種探針的組合物在熒光原位雜交反應(yīng)中表現(xiàn)出良好的有效性和特異性是一項(xiàng)好大的選擇過(guò)程，而本發(fā)明的探針組合物中包含的多種探針能夠高效、特異性明顯地與各自針對(duì)的目的基因進(jìn)行特異性雜交，并高效、快捷地通過(guò)顯示出正確的檢測(cè)結(jié)果，大大提高檢測(cè)效率，為相應(yīng)的與食管癌相關(guān)miRNA基因的表達(dá)情況的檢測(cè)以及食管癌的檢測(cè)提供了一種有效途徑?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0057]圖1是本發(fā)明實(shí)施例3中FISH檢測(cè)食道癌患者唾液樣品中與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。其中，A為hsa-miR-144基因表達(dá)陽(yáng)性、B為hsa-miR-1180基因表達(dá)陽(yáng)性、C為hsa-miR-196b基因表達(dá)陽(yáng)性、D為hsa-miR-149基因表達(dá)陽(yáng)性、E為hsa-miR-1825基因表達(dá)陽(yáng)性、F為hsa-miR-760基因表達(dá)陽(yáng)性、G為hsa_miR-135b基因表達(dá)陽(yáng)性、H為hsa-miR-139基因表達(dá)陽(yáng)性、I為hsa-miR-1539基因表達(dá)陽(yáng)性、J為hsa-miR-1281基因表達(dá)陽(yáng)性、K為hsa-miR-129基因表達(dá)陽(yáng)性、L為hsa-miR-1267基因表達(dá)陽(yáng)性、M為hsa-miR-362基因表達(dá)陽(yáng)性、N為hsa-miR-766基因表達(dá)陽(yáng)性、O為hsa-miR-933基因表達(dá)陽(yáng)性。其中 hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因?yàn)樯险{(diào)基因。hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因?yàn)橄抡{(diào)基因。
[0058]圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中FISH檢測(cè)正常組唾液樣品中與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0059]圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中陰性樣品中與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0060]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0061]實(shí)施例1:探針 的設(shè)計(jì)與合成。
[0062]通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase (http://www.mirbase.0rg/)對(duì)15種與食管癌相關(guān)miRNA基因進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)18-25bp的熒光素標(biāo)記探針待檢測(cè)基因及其探針序列如下所示:
[0063](I)針對(duì) hsa-miR-144 基因的探針:5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3 (SEQ IDN0.1)；
[0064](2)針對(duì) hsa-miR-1180 基因的探針:5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3 (SEQ IDN0.2)；
[0065](3)針對(duì) hsa-miR-196b 基因的探針:5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ (SEQ IDN0.3)；
[0066](4)針對(duì) hsa-miR-149 基因的探針:5’ -GGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3’ (SEQ IDN0.4)；
[0067](5)針對(duì) hsa-miR-1825 基因的探針:5’-GGAGAGGAGGGCACTGGA-3’ (SEQ ID N0.5)；
[0068](6)針對(duì)hsa-miR-760基因的探針:5’-TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3’(SEQ ID N0.6)；
[0069](7)針對(duì) hsa-miR-135b 基因的探針:5’-TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3’ (SEQ IDN0.7)；
[0070](8)針對(duì) hsa-miR-139 基因的探針:5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ (SEQ IDN0.8)；
[0071](9)針對(duì) hsa-miR-1539 基因的探針:5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ (SEQ IDN0.9)；
[0072](10)針對(duì)hsa-miR-1281 基因的探針:5’-GGGAGAGGAGGAGGCGA-3’(SEQ ID N0.10)；
[0073](11)針對(duì) hsa-miR-129 基因的探針:5 ’ -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3 ’ (SEQ IDN0.11)；
[0074](12)針對(duì) hsa-miR-1267 基因的探針:5’ -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3’ ；(SEQ IDN0.12)；
[0075](13)針對(duì) hsa-miR-362 基因的探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ (SEQ IDN0.13)；
[0076](14)針對(duì) hsa-miR-766 基因的探針:5’ -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3’ (SEQ IDN0.14)；
[0077](15)針對(duì) hsa-miR-933 基因的探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’ (SEQ IDN0.15)。
[0078]需要說(shuō)明的是hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因?yàn)樯险{(diào)基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因?yàn)橄抡{(diào)基因。
[0079]用上述設(shè)計(jì)好的探針序列合成熒光素標(biāo)記探針，本實(shí)施中通過(guò) 申請(qǐng)人:自行合成而得到該批熒光探針(生產(chǎn)批次`為B10SEEN20131217PR0BE)，當(dāng)然熒光探針也可以在設(shè)計(jì)好相應(yīng)序列后委托其他商業(yè)生物公司合成。
[0080]實(shí)施例2:反應(yīng)試劑的制備。
[0081]FISH試劑盒中所用的FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過(guò)將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5ng/ μ 1，所述2 X SSC緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
[0082]另外，F(xiàn)ISH試劑盒中還包括5mg/ml的4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染液300 μ I。
[0083]實(shí)施例3 =FISH檢測(cè)食道癌患者唾液樣品中與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)陽(yáng)性的實(shí)驗(yàn)。
[0084]按照如下步驟進(jìn)行試驗(yàn):
[0085]包括如下步驟:
[0086]1、將待檢測(cè)唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對(duì)玻片上的唾液樣品進(jìn)行預(yù)處理。具體操作如下:
[0087]1.1、將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min。
[0088]1.2、去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液。混勻，后放入37°C水浴30min。(作用:利用滲透壓差使細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核吸水膨脹。利于探針的雜交。)
[0089]1.3、加入2ml固定液預(yù)固定，(甲醇:冰乙酸=3:1)，混合均勻后1500rpm離心Smin0 (固定液中主要利用冰乙酸和甲醇的小分子性，有極強(qiáng)的細(xì)胞穿透能力，在瞬間殺死細(xì)胞，使細(xì)胞固定在低滲后的膨脹狀態(tài)，保證細(xì)胞中需要檢測(cè)的物質(zhì)不被破壞。)
[0090]1.4、去上清,加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min。去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0091]1.5、取出預(yù)固定好的唾液標(biāo)本，1500rpm離心8min。去上清,加適量固定液(IOml的唾液樣本，根據(jù)細(xì)胞的多少，一般留IML左右的固定液)。
[0092]1.6、吹打混勻后吸取少量細(xì)胞固定液滴片(滴片前一定要將細(xì)胞吹打散開(kāi)，滴片時(shí)保證細(xì)胞均勻散開(kāi)，不要太密集，也要保證有足夠計(jì)數(shù)的細(xì)胞)于3張12圓孔防脫落載玻片上。自然晾干，56°C烤片30min。(防止掉片)
[0093]1.7、將上步所得玻片置于37°〇預(yù)熱的2\55(:溶液中浸泡101^11。(洗滌玻片，增加細(xì)胞核的通透性。
[0094]1.8、蛋白酶1(于551:消化5-101^11。(每片組織是10 μ I左右)
[0095]1.9、玻片于2 X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0096]1.10、將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進(jìn)行梯度脫水，自然晾干玻片。
[0097]2、分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個(gè)探針加2個(gè)復(fù)孔，使探針待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交。具體操作如下:
[0098]2.1、2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ；
[0099]2.2、梯度脫水:將玻片一次置于70%、95%乙醇中各2min，自然晾干玻片。
[0100]2.3、分別將15種探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個(gè)樣品孔加10 μ I探針，每個(gè)探針加2個(gè)復(fù)孔，使探針待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交，加蓋蓋玻片，封片。
[0101]2.4、雜交儀上73°C變性5min，37°C雜交過(guò)夜。
`[0102]3、雜交后，對(duì)玻片進(jìn)行洗滌。具體操作如下:
[0103]3.1、去掉封片膠和蓋玻片，于46°C(46-48°C)水浴2XSSC溶液中2次，每次5min;
[0104]3.2、將玻片置于 46°C 0.1%ΝΡ_40/2X SSC 中，晃動(dòng) l_3S，5min 后取出;
[0105]3.3、70%、95%乙醇中脫水各2min，甩干，自然干燥。
[0106]4、使用復(fù)染液對(duì)玻片上的雜交區(qū)域進(jìn)行復(fù)染。向雜交區(qū)加入151110么?1，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置10-20min。
[0107]5、使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區(qū)域，試驗(yàn)結(jié)果如圖1-3所示。
[0108]結(jié)果分析:結(jié)果分析:從圖1和圖2可見(jiàn)，在圖1A-圖10的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與食管癌相關(guān)miRNA基因主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。相對(duì)于正常組別而言，與食管癌相關(guān)miRNA基因在食道癌患者唾液樣品中高表達(dá)，而陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，未檢測(cè)出綠色熒光。說(shuō)明本發(fā)明的上調(diào)基因探針可用于檢測(cè)唾液樣品中與食管癌相關(guān)miRNA基因的表達(dá)情況。同時(shí)用經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得的在食管癌中下調(diào)的microRNA基因探針對(duì)樣品進(jìn)行熒光原位雜交分析，結(jié)果與預(yù)測(cè)的相符合，這些基因在食管癌樣品中表達(dá)量低。因此采用上調(diào)基因探針與下調(diào)基因探針相結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行原位雜交分析更為準(zhǔn)確、可靠；同時(shí)使用與食管癌相關(guān)miRNA基因熒光探針進(jìn)行唾液樣品的FISH實(shí)驗(yàn)可達(dá)到食道癌的篩查與初診效果。另外，通過(guò)測(cè)序和業(yè)界其他常用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因表達(dá)情況的方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為準(zhǔn)確，足見(jiàn)本發(fā)明試劑盒在檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因以及食道癌的篩查中的準(zhǔn)確性。
[0109]最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針組合物，其特征在于，該探針組合物中包含有用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述與食管癌相關(guān)miRNA基因至少包含以下基因中的一種: hsa-miR-144 基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因、hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766 基因、hsa-miR-933 基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述hsa-miR-144基因、hsa-miR-1180 基因、hsa_miR-196b 基因、hsa-miR-149 基因、hsa-miR-1825 基因、hsa-miR-760 基因、hsa_miR-135b 基因、hsa-miR-139 基因、hsa-miR-1539 基因?yàn)樯险{(diào)基因，所述 hsa-miR-1281 基因、hsa-miR-129 基因、hsa-miR-1267 基因、hsa-miR-362 基因、hsa-miR-766基因、hsa-miR-933基因?yàn)橄抡{(diào)基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述FISH探針為以下核酸探針中的至少一種: (1)針對(duì)hsa-miR-144基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的核酸探針:，5’ -CTTACAGTATATGATGATATCC-3’ ； (2)針對(duì)hsa-miR-1180基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示的核酸探針:，5’ -TATTCCCGGCCGGGTGGGTCC-3’ ； (3)針對(duì)hsa-miR-196b基因的核苷酸序列如SEQID N0.3所示的核酸探針:，5’ -CCCAACAACAGGAAACTACCTA-3’ ； (4)針對(duì)hsa-miR-149基因的核苷酸序列如SEQID N0.4所示的核酸探針:，5， -GGGAGTGAAGACACGGAGCCAGA-3，； (5)針對(duì)hsa-miR-1825基因的核苷酸序列如SEQID N0.5所示的核酸探針:，5， -GGAGAGGAGGGCACTGGA-3，； (6)針對(duì)hsa-miR-760基因的核苷酸序列如SEQID N0.6所示的核酸探針:，5， -TCCCCACAGACCCAGAGCCG-3，； (7)針對(duì)hsa-miR-135b基因的核苷酸序列如SEQID N0.7所示的核酸探針:，5， -TCACATAGGAATGAAAAGCCATA-3，； (8)針對(duì)hsa-miR-139基因的核苷酸序列如SEQID N0.8所示的核酸探針:，5’ -ACTCCAACAGGGCCGCGTCTCCA-3’ ； (9)針對(duì)hsa-miR-1539基因的核苷酸序列如SEQID N0.9所示的核酸探針:，5’ -GGCATCTGGGACGCGCAGGA-3’ ； (10)針對(duì)hsa-miR-1281基因的核苷酸序列如SEQID N0.10所示的核酸探針:，5， -GGGAGAGGAGGAGGCGA-3，； (11)針對(duì)hsa-miR-129基因 的核苷酸序列如SEQID N0.11所示的核酸探針:，5， -GCAAGCCCAGACCGCAAAAAG-3，； (12)針對(duì)hsa-miR-1267基因的核苷酸序列如SEQID N0.12所示的核酸探針:，5， -TGGGGATTACACTTCAACAGG-3，；(13)針對(duì)hsa-miR-362基因的核苷酸序列如SEQID N0.13所示的核酸探針:5’ -TGAATCCTTGAATAGGTGTGTT-3’ ； (14)針對(duì)hsa-miR-766基因的核苷酸序列如SEQID N0.14所示的核酸探針:5， -AAGACCAGCACCAATTCCTCCT-3，； (15)針對(duì)hsa-miR-933基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示的核酸探針:5’ -GGGAGAGGTCTCCCTGCGCACA-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的FISH探針組合物，其特征在于，所述FISH探針為核苷酸序列如SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.1所示的核酸探針的組合。
6.一種用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒，其特征在于，所述FISH試劑盒中包含如權(quán)利要求1-5中所述的FISH探針組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的FISH試劑盒，其特征在于，所述FISH探針組合物制成溶液，該溶液是通過(guò)將FISH探針溶解在2x SSC緩沖液中得到，探針濃度為5叩/^1，所述2父55〇緩沖液是以氯化鈉8.8g，檸檬酸鈉4.4g，去離子水400ml配制而成。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的FISH試劑盒，其特征在于，還包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染液。
9.一種如權(quán)利要求6-8所述的用于檢測(cè)與食管癌相關(guān)miRNA基因的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將待檢測(cè)唾液樣品固定在防脫落載玻片上，對(duì)玻片上的唾液樣品進(jìn)行預(yù)處理； (2)分別將FISH探針滴加于載玻片圓孔中的樣品處，每個(gè)探針加2個(gè)復(fù)孔，使探針待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交； (3)雜交后，對(duì)玻片進(jìn)行洗滌； (4)使用復(fù)染液對(duì)玻片上的雜交區(qū)域進(jìn)行復(fù)染； (5)使用熒光顯微鏡觀察玻片的雜交區(qū)域。
10.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求9所述的FISH試劑盒的使用方法，其特征在于，該FISH試劑盒的使用方法的相應(yīng)步驟中包含如下(I) - (4)項(xiàng)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)的具體操作方式: (I)步驟(1)中將待檢測(cè)唾液樣品固定和預(yù)處理具體為: ①將新鮮收集到的唾液1500rpm離心8min； ②去上清，加入5ml0.075M kcl低滲液，混勻，后放入37°C水浴30min ； ③加入2ml固定液預(yù)固定,混合均勻后1500rpm離心8min;該固定液甲醇:冰乙酸=3:1混合溶液 ④去上清，加入5ml固定液固定,混合均勻后1500rpm離心8min,去上清,加入5ml固定液，混勻后于_20°C保存?zhèn)溆茫? ⑤取出預(yù)固定好的唾液標(biāo)本，1500rpm離心8min,去上清,加適量固定液； ⑥吹打混勻后吸取少量細(xì)胞固定液滴片于防脫落載玻片上，自然晾干，56°C烤片30min，防止掉片，滴片前一定要將細(xì)胞吹打散開(kāi)，滴片時(shí)保證細(xì)胞均勻散開(kāi)，防止細(xì)胞太密集，也要保證有足夠計(jì)數(shù)的細(xì)胞； ⑦將上步所得玻片置于37°C預(yù)熱的2XSSC溶液中浸泡lOmin，洗滌玻片，增加細(xì)胞核的通透性； ⑧蛋白酶K于55°C消化5-10min；⑨玻片于2X SSC溶液中漂洗2次，每次5min ； ⑩將玻片一次置于70%、95%乙醇溶液中各2min，進(jìn)行梯度脫水，自然晾干玻片； (2)步驟(2)將待探針與玻片上的待測(cè)樣品進(jìn)行變性雜交具體為:①分別取15種探針試劑Iy 1，2XSSC緩沖液9μ 1，混合得到15種不同的探針混合液將上述15種探針混合液分別滴加于樣品處，每個(gè)探針加樣2個(gè)復(fù)孔，蓋上蓋玻片，于雜交儀上73°C變性5min，`37 °C雜交過(guò)夜； (3)步驟(3)玻片洗滌具體為:①去掉封片膠和蓋玻片，于46-48°C水浴2X SSC溶液中2次，每次5min ;②將玻片置于46°C 0.1%ΝΡ_40/2 X SSC中，晃動(dòng)1_3S，5min后取出；@70%、`95%乙醇中脫水各2min,甩干，自然干燥； (4)步驟(3)復(fù)染具體為:向雜交區(qū)加入15μ IDAPI，蓋上大蓋玻片，蓋上蓋玻片，暗處放置 10-20min。`
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103866040SQ201410136226
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】吳偉東, 王曉香, 周劍, 董先輝, 劉雪媚 申請(qǐng)人:廣州伯信生物科技有限公司