水通道蛋白-4自身抗體的檢測(cè)方法及融合表達(dá)病毒載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種水通道蛋白-4自身抗體的檢測(cè)方法及融合表達(dá)病毒載體和應(yīng)用。所述病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了融合表達(dá)病毒載體在制備用于提高視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化的臨床診療水平方面的應(yīng)用。本發(fā)明采用靈敏度和特異性更高的熒光免疫細(xì)胞染色結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，用于臨床定性、定量檢測(cè)AQP-4抗體，使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定，且極大節(jié)約人力和時(shí)間成本。該項(xiàng)目的建立將極大提高視神經(jīng)脊髓炎疾病譜和多發(fā)性硬化的診療水平，提高患者的勞動(dòng)能力和生活質(zhì)量，將產(chǎn)生很大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說(shuō)明】水通道蛋白-4自身抗體的檢測(cè)方法及融合表達(dá)病毒載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)水通道蛋白-4自身抗體的方法及其融合表達(dá)病毒載體。水通道蛋白(aquaporin，AQP)_4抗體陽(yáng)性是視神經(jīng)脊髓炎診斷的重要支持條件，抗體滴度與患者病情的嚴(yán)重程度、預(yù)后、復(fù)發(fā)具有相關(guān)性。本發(fā)明屬于疾病分子鑒定和診斷領(lǐng)域，結(jié)合病毒載體構(gòu)建，轉(zhuǎn)染，熒光免疫染色及流式細(xì)胞分析技術(shù)，主要應(yīng)用于NMO和MS的臨床鑒別診斷，提高NMO和MS的診斷水平；能輔助作為用藥療效、病情監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的指標(biāo);AQP_4檢測(cè)平臺(tái)的建立能為進(jìn)一步研究AQP-4抗體的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】[0002]多發(fā)性硬化(MultipleSclerosis, MS)和視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitisoptica, NMO)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的脫髓鞘疾病，已成為中青年非外傷致殘首要疾病之一。兩種疾病均常累及視神經(jīng)和脊髓，因此臨床上較難區(qū)分，尤其是發(fā)病早期。目前研究認(rèn)為MS是由CD4輔助T細(xì)胞(包括Thl和Thl7亞群)介導(dǎo)的自身免疫疾病，故治療多以免疫調(diào)節(jié)為主，如β -干擾素等。而NMO以體液免疫為主,治療多以免疫抑制為主。因此，早期鑒別診斷對(duì)指導(dǎo)兩種疾病的治療和評(píng)估預(yù)后非常重要。2004年Lennon等通過(guò)間接免疫熒光染色方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)脊髓炎病人血清中存在著一種特異性自身抗體NMO-1gG，它在視神經(jīng)炎(Optic neuritis, ON)、長(zhǎng)節(jié)段橫貫性脊髓炎(Longitudinally extensivetranverse myelitis, LETM)患者血清中的陽(yáng)性率也較高,2006年Wingerchuk DM修訂了NMO診斷標(biāo)準(zhǔn)，將NMO-1gG抗體陽(yáng)性做為診斷的重要支持條件，該診斷標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)調(diào)了水通道蛋白-4抗體在NMO診斷中的重要價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，Wingerchuk DM又于2007年提出了視神經(jīng)脊髓炎疾病譜，認(rèn)為0N、LETM (包括伴有自身免疫病和/或有顱內(nèi)病灶)為視神經(jīng)脊髓炎的限定型，連同視神經(jīng)脊髓型多發(fā)性硬化(OSMS)—同被歸為NMO的疾病譜。后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)，AQP4抗體滴度與患者病情的嚴(yán)重程度、預(yù)后、復(fù)發(fā)具有相關(guān)性，臨床上用免疫球蛋白和血漿置換治療NMO療效較好。NMO患者尸檢的病理顯示病灶中血管周圍有大量的免疫球蛋白和補(bǔ)體沉積、星型膠質(zhì)細(xì)胞破壞和再生，其分布與AQP-4表達(dá)的分布相一致。通過(guò)AQP-4抗體陽(yáng)性血清與轉(zhuǎn)染AQP-4cDNA的HEK293細(xì)胞孵育，并用抗人IgG示蹤已結(jié)合的抗體，發(fā)現(xiàn)NMO中的AQP-4抗體為IgGl，而IgGl具有激活補(bǔ)體功能。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)AQP-4抗體與表達(dá)AQP-4分子的HEK細(xì)胞結(jié)合后能激活補(bǔ)體。2009年Bennett等研究發(fā)現(xiàn)，在已經(jīng)誘導(dǎo)出EAE的大鼠鞘內(nèi)注射人工合成的AQP-4抗體能夠?qū)е虏≡顑?nèi)星型膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，與NMO病灶病理改變相似。這提示AQP4抗體可能不僅僅是NMO的標(biāo)志物，有可能是致病性抗體。
[0003]目前國(guó)際上檢測(cè)AQP-4抗體的技術(shù)主要有間接免疫熒光法(IndirectImmunofluorescence, HF)、突光免疫沉淀法(Fluoroimmunoprecipitation Assay,FIPA)、放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、突光免疫細(xì)胞染色法(Cell-Based Assay, CBA)(文獻(xiàn)支持 Clin Immunol.2011 Mar; 138(3):239-46,Neurology.2012 Feb 28;78 (9):665-71 ；)及酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特異性最為理想。然而，CBA法平均檢測(cè)周期超過(guò)兩天，熒光效率不穩(wěn)定，而且需要人為觀察，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且可能會(huì)增加檢測(cè)中的人為誤差；FIPA法涉及到同位素的應(yīng)用，環(huán)境危害性大大增加。此外，針對(duì)AQP-4自身抗體的檢測(cè)國(guó)內(nèi)目前只少數(shù)研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常規(guī)應(yīng)用于臨床，因此何種方法作為“金標(biāo)準(zhǔn)”被推薦應(yīng)用于臨床AQP-4抗體的檢測(cè)尚待闡明。
[0004]傳統(tǒng)檢測(cè)AQP-4的方法如間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法等敏感性和特異性均不高，放射免疫沉淀法涉及放射源污染問(wèn)題。因此，我們應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP-4的細(xì)胞系，采用靈敏度和特異性更高的熒光免疫細(xì)胞染色法(CBA)結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，用于臨床定性、定量檢測(cè)AQP-4抗體。
[0005]傳統(tǒng)CBA方法應(yīng)用的質(zhì)粒為EGFP標(biāo)記的人AQP4 cDNA質(zhì)粒及對(duì)照EGFP cDNA質(zhì)粒，應(yīng)用聚乙烯亞胺(PEI)或脂質(zhì)體方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。耗時(shí)長(zhǎng)，人力物力損耗大，且熒光效率不穩(wěn)定。因此需要更為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染方法以獲得更敏感穩(wěn)定的結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明通過(guò)提供一種流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)水通道蛋白-4自身抗體的方法，及其融合表達(dá)病毒載體。采用靈敏度和特異性更高的熒光免疫細(xì)胞染色結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，用于臨床定性、定量檢測(cè)AQP-4抗體，使檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定，且極大節(jié)約人力和時(shí)間成本。AQP4抗體檢測(cè)技術(shù)的平臺(tái)的建立，有利于提高視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化的臨床診療水平。應(yīng)用于NMO和MS的臨床鑒別診斷，提高NMO和MS的診斷水平；能輔助作為用藥療效、病情監(jiān)測(cè)、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的 指標(biāo);AQP-4檢測(cè)平臺(tái)的建立能為進(jìn)一步研究AQP-4抗體的致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。
[0007]因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種水通道蛋白-4自身抗體融合表達(dá)病毒載體，其特征在于所述表達(dá)病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP，具有SEQ ID N0.2所示序列。
[0008]構(gòu)建好的病毒載體的完整序列: acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttaca
aggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtggga
【權(quán)利要求】
1.一種水通道蛋白-4自身抗體融合表達(dá)病毒載體,其特征在于所述表達(dá)病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP 具有 SEQ ID N0.2 所示序列。
2.—種產(chǎn)生水通道蛋白-4自身抗體融合表達(dá)病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: I)載體構(gòu)建:構(gòu)建強(qiáng)組成型啟動(dòng)子CMV介導(dǎo)的融合表達(dá)人AQP-4基因及熒光標(biāo)記基因EGFP的慢病毒載體； 無(wú)終止密碼子的人AQP-4基因與EGFP基因用5個(gè)氨基酸組成的柔性序列(GGGGS)相連接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整個(gè)融合蛋白的N端，以保證AQP-4蛋白的天然狀態(tài)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞位置和兩個(gè)蛋白相對(duì)獨(dú)立的功能；pEGFP-ΝΙ載體上擴(kuò)增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和 EGFPR: 5’- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’， 擴(kuò)增片段切膠回 收后連入T載體，經(jīng)測(cè)序比對(duì)序列正確后將其用BamHI和SalI雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切后的pCDH-CMV-MCS-EFl-CopGFP載體片段相連接，用EGFP置換掉原載體中的EFl-copGFP序列； 以人視神經(jīng)cDNA為模板，擴(kuò)增AQP-4 (Ml)序列，所用引物為:
AQP4F: 5’ -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3’ 和 AQP4R: 5’ -CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’，擴(kuò)增片段切膠回收后連入T載體，經(jīng)測(cè)序比對(duì)序列正確后將其用XbaI和BglII雙酶切后與經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后的步驟I獲得質(zhì)粒載體相連接，得到慢病毒質(zhì)粒載體，如SEQ ID N0.2所/Jn ο
3.—種檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的生物樣品中是否存在水通道蛋白-4自身抗體的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: 1)載體構(gòu)建:構(gòu)建強(qiáng)組成型啟動(dòng)子CMV介導(dǎo)的融合表達(dá)人AQP-4基因及熒光標(biāo)記基因EGFP的慢病毒載體； 無(wú)終止密碼子的人AQP-4基因與EGFP基因用5個(gè)氨基酸組成的柔性序列(GGGGS)相連接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整個(gè)融合蛋白的N端，以保證AQP-4蛋白的天然狀態(tài)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞位置和兩個(gè)蛋白相對(duì)獨(dú)立的功能；pEGFP-ΝΙ載體上擴(kuò)增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5’- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’ 和 EGFPR: 5’- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’，擴(kuò)增片段切膠回收后連入T載體，經(jīng)測(cè)序比對(duì)序列正確后將其用BamHI和SalI雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP載體片段相連接，用EGFP置換掉原載體中的EFl-copGFP序列；以人視神經(jīng)cDNA為模板，擴(kuò)增AQP-4 (Ml)序列，所用引物為:AQP4F: 5’ -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3，和 AQP4R: 5，-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3’，擴(kuò)增片段切膠回收后連入T載體，經(jīng)測(cè)序比對(duì)序列正確后將其用XbaI和BglII雙酶切后與經(jīng)XbaI和BamHI雙酶切后的步驟I獲得質(zhì)粒載體相連接，得到慢病毒質(zhì)粒載體(如SEQ ID N0.2所示)； 2)病毒包裝及HEK293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的獲得:細(xì)胞系及其培養(yǎng):人胚腎HEK293細(xì)胞系由本室常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞置于含有10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放入37°C，5% CO2孵箱，按常規(guī)方法培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)； 細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代:預(yù)先向50ml離心管中加入20mL DMEM培養(yǎng)基，從液氮罐取出凍存的細(xì)胞迅速投入37°C水浴中并不斷搖動(dòng)使其在最短時(shí)間內(nèi)解凍，用70%酒精消毒凍存管外表后，將細(xì)胞存儲(chǔ)液轉(zhuǎn)移至上述離心管中，1000rmp離心10分鐘，棄上清，重懸細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)； 待HEK293細(xì)胞長(zhǎng)至70%密度時(shí)，撤掉舊的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞，利用CaCl2法包裝表達(dá)AQP-4-EGFP(pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP)融合蛋白的慢病毒，收集病毒懸液在6 μ g/ml Polybrene存在的情況下感染HEK293細(xì)胞，I周后，分選陽(yáng)性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；繼續(xù)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行二次篩選，獲得100%轉(zhuǎn)染過(guò)的穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的HEK293細(xì)胞系；所述的傳代培養(yǎng)指的是細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用胰酶消化貼壁細(xì)胞2-5分鐘，后傳代至培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng); 3)細(xì)胞免疫熒光染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定血清AQP-4抗體: 獲得待檢血清后，用含1%BSA (Sigma) DMEM-Hepes洗液稀釋待測(cè)血清，收集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，按I:1的比例混合，總數(shù)為5X105，用流式staining緩沖液(1XPBS含3%的馬血清及0.02%的疊氮鈉NaN3)清洗I次，離心后棄去上清，用100 μ I稀釋過(guò)的血清或人Ig對(duì)照重懸細(xì)胞，4度孵育30min,然后加入流式staining緩沖液清洗I次,離心收集細(xì)胞后加入IOOul稀釋后的Fast blue標(biāo)記的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining緩沖液清洗I次，然后用300ul流式staining緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀雙通道檢測(cè)熒光信號(hào)，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞亞群及人Ig染色組為對(duì)照，判斷AQP-4抗體陽(yáng)性樣本，依據(jù)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞類群中的Fast blue信號(hào)強(qiáng)弱用來(lái)標(biāo)示抗體濃度的相對(duì)量； 4)統(tǒng)計(jì)分析:使用GraphPadPrism 4軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖及統(tǒng)計(jì)分析得出結(jié)果。
4.權(quán)利要求1所述水通道蛋白-4自身抗體融合表達(dá)病毒載體在制備用于提高視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化臨床診療方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK103937836SQ201410139698
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月4日
【發(fā)明者】閆亞平, 施福東, 金薇娜, 李敏淑, 齊媛 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院