一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法。其中，制備得到的淡水蛭弧菌微生物制劑顯著提高了蛭弧菌的成活率，為蛭弧菌的活力差的問題提供了新的解決思路和方法，使得蛭弧菌易培養(yǎng)、長久保存而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的養(yǎng)殖成為可能。本發(fā)明公開的快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法可有效快速評價淡水蛭弧菌的活力保持，操作簡單、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確；無需進(jìn)行傳統(tǒng)的分析檢測，可利用存在的數(shù)據(jù)預(yù)測微生物的活性。
【專利說明】一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物制劑，具體涉及一種淡水蛭弧菌微生物制劑及快速評價其貨架期的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]輕弧菌(Bdellovibrio-and-likeorganisms, BALOs)是一類寄生于其他細(xì)菌并依靠裂解宿主菌使自身得以生長繁殖的細(xì)菌，它具有寄生和裂解細(xì)菌的生理特性，尤其是對許多病原弧菌有良好的裂解作用。在控制細(xì)菌及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景。蛭弧菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于控制病原菌，是近幾年來的研究熱點(diǎn)，蛭弧菌對大多數(shù)致病菌有較強(qiáng)的裂解能力，能改善水質(zhì)，安全環(huán)保，有可能取代抗生素，成為控制病害的新手段。而蛭弧菌大多存在不易保存的問題而使蛭弧菌的應(yīng)用得到限制。因此，使蛭弧菌的活性和穩(wěn)定性得到保障，對擴(kuò)大蛭弧菌的使用范圍和推廣具有十分重要的意義。
[0003]蛭弧菌的生活史由兩個階段組成:自由生活、能運(yùn)動，不進(jìn)行增殖的游泳體階段和在特定宿主細(xì)菌的周質(zhì)空間內(nèi)進(jìn)行生長繁殖的蛭質(zhì)體階段。在游泳體階段，蛭弧菌識別并與宿主發(fā)生不可逆的結(jié)合，然后侵入宿主。蛭弧菌侵入宿主菌后，在其周質(zhì)空間中利用宿主細(xì)胞成分為營養(yǎng)進(jìn)行絲狀生長，通過復(fù)分裂進(jìn)行增殖，最后裂解宿主細(xì)胞并釋放成熟子代個體。
[0004]蛭弧菌游泳體是指侵入宿主細(xì)菌前的生長形式。蛭弧菌游泳體侵入宿主細(xì)菌的過程非?？?，一般在幾秒鐘內(nèi)就能完成。蛭弧菌游泳體相對于蛭質(zhì)體而言，存在著制備繁瑣、不易保存的弱點(diǎn)，但用蛭弧菌游泳體做活性檢測具有起效快的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]溫度是影響蛭弧菌及其制劑穩(wěn)定性的重要因素之一。在保存時，蛭弧菌普遍存在穩(wěn)定性差的問題。即蛭弧菌活性易受到外界環(huán)境的影響，經(jīng)儲存后活菌含量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)降低，達(dá)不到原有的要求。因此保持并延長高濃度蛭弧菌及其制劑的活力，將蛭弧菌作為“活性抗生素”應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、食品行業(yè)及擴(kuò)大其應(yīng)用范圍具有十分重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有蛭弧菌活力保持不夠長而導(dǎo)致蛭弧菌的廣泛應(yīng)用受限的缺點(diǎn)與不足，提供一種淡水蛭弧菌微生物制劑。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速評價上述淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法。
[0009]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，包含如下步驟:
[0011](I)制備蛭弧菌游泳體；
[0012](2)在步驟(1)得到的蛭弧菌游泳體加入保護(hù)劑，得到貨架期延長的淡水蛭弧菌微生物制劑。[0013]所述蛭弧菌優(yōu)選為淡水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDSOl ；
[0014]所述的蛭弧菌游泳體的終濃度為IOiqPFU (plaque forming unit) /mL ；
[0015]所述的淡水蛭弧菌(Bdellovibrio sp.) BDS01 (該菌株已在中國專利申請?zhí)枮椤?00910042274.6”、名稱為“一種防治乳腺炎的蛭弧菌菌株及其應(yīng)用”中公開)于2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209169 ;對所述的蛭弧菌進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下觀察形態(tài)可知=BDSOl呈單細(xì)胞，弧形，大小為0.9X0.25 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度為4 μ m ;所述蛭弧菌BDS01用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)四天可形成直徑I~的透明圓形曬菌斑；
[0016]所述保護(hù)劑為谷氨酸鈉、蔗糖、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的一種或至少兩種；
[0017]優(yōu)選的，所述保護(hù)劑為終濃度1%~10%W/V(質(zhì)量/體積)的谷氨酸鈉、終濃度1%~10%ff/v的蔗糖、終濃度1%~10%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度1%~10%W/V的棉子糖、終濃度1%~10%W/V的葡萄糖、終濃度5%~30%W/V的甘油、終濃度1%~10%W/V的蔗糖+終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉、終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度1%~10%w/v的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的棉子糖、終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的葡萄糖或終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度5%~30%W/V的甘油；
[0018]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述保護(hù)劑為終濃度5%W/V的谷氨酸鈉、終濃度5%W/V的蔗糖、終濃度5%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度5%W/V的棉子糖、終濃度5%W/V的葡萄糖、終濃度15%W/V的甘油或終濃度5%W/V的谷氨酸鈉+終濃度15%W/V的甘油；
[0019]所述的蛭弧菌游泳體優(yōu)選通過中國專利申請?zhí)枮椤?00710031166.X”、名稱為“高
密度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)”中公開的高密度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵方法進(jìn)行制備，具體步驟如下:
[0020]㈠宿主菌懸浮液的制備
[0021]將宿主菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液離心棄上清，得到的沉淀用2~3mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基懸??；得到宿主菌懸浮液，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0022]㈡蛭弧菌游泳體的制備
[0023]將步驟(-)制備的宿主菌懸浮液接種到IOOmL的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，然后將宿主菌培養(yǎng)液離心棄上清；將沉淀加入到IOOmL的DNB液體培養(yǎng)基中，再加入蛭弧菌的噬菌斑，搖床培養(yǎng)，然后將蛭弧菌培養(yǎng)液離心，取上清液，再將上清液離心，保留沉淀，加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌游泳體；
[0024]步驟(-)中所述的宿主菌為嗜水氣單胞菌；所述的搖床培養(yǎng)條件優(yōu)選為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ;所述的離心條件優(yōu)選為4°C、6000rpm離心20min ；
[0025]步驟㈡中所述的宿主菌搖床培養(yǎng)的條件為200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18h ;所述的宿主菌培養(yǎng)液的離心條件為4°C、5000rpm離心15min ； [0026]步驟㈡中所述的蛭弧菌搖床培養(yǎng)條件優(yōu)選為250rpm、28°C培養(yǎng)36h ;所述的蛭弧菌培養(yǎng)液離心條件優(yōu)選為4°C、6000rpm離心20min ;所述的上清液離心的條件為4°C、16000rpm 離心 20min ；
[0027]一種淡水蛭弧菌微生物制劑，通過上述制備方法得到；[0028]一種快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法，包含如下步驟:
[0029]①將上述淡水蛭弧菌微生物制劑進(jìn)行經(jīng)典恒溫加速實(shí)驗(yàn):檢測淡水蛭弧菌微生物制劑的初始活菌數(shù)CO ;將上述淡水蛭弧菌微生物制劑在不同檢測溫度下保存并于不同的時間間隔t取樣檢測，獲得蛭弧菌微生物制劑的活菌數(shù)C ;計(jì)算出蛭弧菌微生物制劑在各檢測溫度下保存不同時間后的相對活性Cr=Cztci ；
[0030]②運(yùn)用阿倫尼烏斯方程計(jì)算出淡水蛭弧菌微生物制劑的貨架期:以IgCr對時間間隔t進(jìn)行回歸分析，得出各檢測溫度下淡水蛭弧菌微生物制劑的失活速度常數(shù)k ;將Igk對1/TX IO3進(jìn)行回歸分析，得到阿倫尼烏斯方程(Arrhenius方程)；最后，根據(jù)所得的阿倫尼烏斯方程(Arrhenius方程)計(jì)算出降低2個數(shù)量級濃度的淡水蛭弧菌微生物制劑的貨架期；
[0031]③通過貨架期來確定保護(hù)劑的效果:當(dāng)貨架期越長，活力越大，保護(hù)劑效果越好；當(dāng)貨架期越小，活力越小，保護(hù)劑效果越差；
[0032]步驟①中所述的檢測溫度為25°C、37°C、45°C、55°C和65°C ;所述的檢測溫度對應(yīng)的取樣間隔時間分別為12h、8h、4h、40min和20min ；
[0033]步驟②中所述的T為步驟①中檢測溫度的絕對溫度；
[0034]經(jīng)典恒溫法的理論依據(jù)為阿倫尼烏斯方程(Arrhenius方程)的指數(shù)定律k=e_E/KT，其對數(shù)形式為:logk=- E/2.303RT+logA。其中k為反應(yīng)速率常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù)，A是一個與反應(yīng)物分子相互碰撞有關(guān)的常數(shù)。
[0035]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0036]( I)本發(fā)明所述的保護(hù)劑簡單易得，成本低。
[0037](2)本發(fā)明的淡水蛭弧菌微生物制劑顯著提高了蛭弧菌的成活率。所有受試的保護(hù)劑對受試的蛭弧菌都有延長活力的作用，與對照組相比，加入保護(hù)劑的處理組的活力都延長了。
[0038](3)本發(fā)明所述的微生物制劑能保持活力，使得適用范圍得以推廣，使得本發(fā)明所述的微生物制劑有望取代抗生素而避免濫用抗生素所帶來的副作用。高濃度蛭弧菌便于儲存及運(yùn)輸，克服了現(xiàn)有的制劑活性不高的缺點(diǎn)。
[0039](4)本發(fā)明公開了一種快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法，該方法可有效快速評價淡水蛭弧菌的活力延長，操作簡單、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確；無需進(jìn)行傳統(tǒng)的分析檢測，可利用存在的數(shù)據(jù)預(yù)測微生物的活性。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0041]實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基和菌株:
[0042]DNB(diluted nutrient broth)培養(yǎng)基為一種蛭弧菌的培養(yǎng)基,組成成分為:營養(yǎng)肉湯0.8g,酪氨酸酸水解物0.5g,酵母提取物0.1g,蒸懼水1000mL, pH7.2~7.6,分裝后再121 °C 0.1MPa條件下處理20min后保存?zhèn)溆谩?br> [0043]嗜水氣單胞菌購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GMl.172。
[0044]使用的蛭弧菌菌株為BDSOl，于2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M209169 ;將所述蛭弧菌BDSOl進(jìn)行負(fù)染后于電子顯微鏡下觀察形態(tài)可知:BDS01呈單細(xì)胞， 弧形，大小為0.9X0.25 μ m,端生鞭毛，鞭毛長度為4 μ m ;所述蛭弧菌BDSOl用雙層平板培養(yǎng)的方法于28°C培養(yǎng)4d可形成直徑I~2mm的透明圓形曬菌斑。
[0045]實(shí)施例1
[0046]—、淡水蛭弧菌微生物制劑的制備
[0047](1)宿主菌懸浮液的制備
[0048]嗜水氣單胞菌購于廣東省微生物所菌種保藏中心，編號GMl.172。從保存的劃有嗜水氣單胞菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上挑取一環(huán)菌體，接種于無菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯18g，蒸餾水lOOOmL，pH7.2)中，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液于4°C、6000rpm離心20min,棄上清,沉淀用2~3mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基懸??；得到嗜水氣單胞菌懸浮液，4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0049](2)蛭弧菌BDSOl游泳體的制備
[0050]蛭弧菌游泳體通過中國專利申請?zhí)枴?00710031166.V’的國家發(fā)明專利申請公開的高密度蛭弧菌游泳體的發(fā)酵方法進(jìn)行發(fā)酵:在I個裝有IOOmL營養(yǎng)肉湯(NB)液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯18g，蒸餾水lOOOmL，pH7.2)的錐形瓶中接種由步驟(1)制備的嗜水氣單胞菌懸浮液，200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18h，然后將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)液于4°C、5000rpm離心15min，棄上清；將沉淀加入到裝有IOOmL DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物0.lg，溶于1000mL蒸餾水，pH7.2~7.6，121。。0.1MPa條件下處理20min。)的錐形瓶中，再加入從平板上挑取的蛭弧菌BDS01的噬菌斑。在恒溫?fù)u床上250rpm、28°C培養(yǎng)36h,培養(yǎng)液于4°C 6000rpm離心20min,取上清液,再將上清液于4°C 16000rpm離心20min,保留沉淀，加入滅菌的DNB液體培養(yǎng)基(營養(yǎng)肉湯0.8g，酪蛋白酸水解物0.5g，酵母提取物
0.lg，溶于1000mL蒸餾水，pH7.2~7.6)重新懸浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌BDS01游泳體；
[0051](3)蛭弧菌BDS01微生物制劑的制備
[0052]將制備得到的蛭弧菌游泳體與不同種類或濃度的保護(hù)劑混合，得到貨架期延長的淡水蛭弧菌BDS01微生物制劑，其中，蛭弧菌游泳體的終濃度為1010PFU/mL ;表1為蛭弧菌微生物制劑中添加保護(hù)劑的種類及其終濃度。
[0053]表1淡水蛭弧菌BDS01微生物制劑中添加保護(hù)劑的種類以及終濃度(W/V)
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于包含如下步驟: (1)制備蛭弧菌游泳體； (2)在步驟(1)得到的蛭弧菌游泳體加入保護(hù)劑，得到貨架期延長的淡水蛭弧菌微生物制劑； 所述蛭弧菌為淡水蛭弧菌BDSOl，于2009年8月7日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC NO:M209169 ； 所述保護(hù)劑為谷氨酸鈉、蔗糖、內(nèi)消旋肌醇、棉子糖、葡萄糖和甘油中的一種或至少兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于: 所述保護(hù)劑為終濃度1%~10%w/v的谷氨酸鈉、終濃度1%~10%W/V的蔗糖、終濃度1%~10%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度1%~10%W/V的棉子糖、終濃度1%~10%W/V的葡萄糖、終濃度5%~30%W/V的甘油、終濃度1%~10%W/V的蔗糖+終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉、終濃度1%~10%w/v的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度1%~10%ff/v的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的棉子糖、終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度1%~10%W/V的葡萄糖或終濃度1%~10%W/V的谷氨酸鈉+終濃度5%~30%W/V的甘油。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于: 所述保護(hù)劑為終濃度5%w/v的谷氨酸鈉、終濃度5%W/V的蔗糖、終濃度5%W/V的內(nèi)消旋肌醇、終濃度5%W/V的棉子糖、終濃度5%W/V的葡萄糖、終濃度15%W/V的甘油或終濃度5%W/V的谷氨酸鈉+終濃度15%W/V的甘油。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌游泳體的終濃度為1010PFU/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌游泳體的制備方法，包含如下步驟: ㈠宿主菌懸浮液的制備 將宿主菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)液離心棄上清，得到的沉淀用2~3mL營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基懸浮；得到宿主菌懸浮液，4°C保存?zhèn)溆茫? (二)蛭弧菌游泳體的制備 將步驟(-)制備的宿主菌懸浮液接種到IOOmL的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)，然后將宿主菌培養(yǎng)液離心棄上清；將沉淀加入到IOOmL的DNB液體培養(yǎng)基中，再加入蛭弧菌的噬菌斑，搖床培養(yǎng)，然后將蛭弧菌培養(yǎng)液離心，取上清液，再將上清液離心，保留沉淀，加入DNB液體培養(yǎng)基重新懸浮蛭弧菌沉淀物，得到蛭弧菌游泳體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種淡水蛭弧菌微生物制劑的制備方法，其特征在于: 步驟(-)中所述的宿主菌為嗜水氣單胞菌；所述的搖床培養(yǎng)條件為200rpm、28°C培養(yǎng)18h ;所述的離心條件為4°C、6000rpm離心20min ； 步驟㈡中所述的宿主菌搖床培養(yǎng)的條件為200rpm、28°C搖床培養(yǎng)18h ;所述的宿主菌培養(yǎng)液的離心條件為4°C、5000rpm離心15min ； 步驟㈡中所述的蛭弧菌搖床培養(yǎng)條件為250rpm、28°C培養(yǎng)36h ;所述的蛭弧菌培養(yǎng)液離心條件為4°C、6000rpm離心20min ;所述的上清液離心的條件為4°C、16000rpm離心20mino
7.一種淡水蛭弧菌微生物制劑，其特征在于采用權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述方法制備得到。
8.一種快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法，其特征在于包含如下步驟: ①將權(quán)利要求7所述的淡水蛭弧菌微生物制劑進(jìn)行經(jīng)典恒溫加速實(shí)驗(yàn):檢測淡水蛭弧菌微生物制劑的初始活菌數(shù)Ctl ;將權(quán)利要求7所述的淡水蛭弧菌微生物制劑在不同檢測溫度下保存并于不同的時間間隔t取樣檢測，獲得蛭弧菌微生物制劑的活菌數(shù)C ;計(jì)算出蛭弧菌微生物制劑在各檢測溫度下保存不同時間后的相對活性Cr=Cztci ； ②運(yùn)用阿倫尼烏斯方程計(jì)算出淡水蛭弧菌微生物制劑的貨架期:以IgCr對時間間隔t進(jìn)行回歸分析，得出各檢測溫度下淡水蛭弧菌微生物制劑的失活速度常數(shù)k ;將Igk對I/TX IO3進(jìn)行回歸分析，得到阿倫尼烏斯方程；最后，根據(jù)所得的阿倫尼烏斯方程計(jì)算出降低2個數(shù)量級濃度的淡水蛭弧菌微生物制劑的貨架期； ③通過貨架期來確定保護(hù)劑的效果:當(dāng)貨架期越長，活力越大，保護(hù)劑效果越好;當(dāng)貨架期越小，活力越小，保護(hù)劑效果越差。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法，其特征在于: 步驟①中所述的檢測溫度為25°C、37°C、45°C、55°C和65°C ;所述的檢測溫度對應(yīng)的取樣間隔時間分別為12 h、8h、4h、40min和20min。
10.根據(jù)權(quán)利要8所述的一種快速評價淡水蛭弧菌微生物制劑貨架期的方法，其特征在于: 步驟②中所述的T為步驟①中檢測溫度的絕對溫度。
【文檔編號】C12R1/01GK103952339SQ201410143854
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】蔡俊鵬, 田雙娥 申請人:華南理工大學(xué)