一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用，該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia?coli1098-3，保藏號為CGMCC?No.8696，其16S?rRNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明對膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過量表達膜蛋白，具有良好的應用前景。
【專利說明】一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物表面活性劑領域，特別涉及一種可過量表達膜蛋白細菌及其應用。
【背景技術】
[0002]本世紀60至70年代對大腸桿菌的研究使之成為自然界中最普遍為人們所認識的生物體。大腸桿菌具有兩個顯著特征:操作簡單和能在廉價的培養(yǎng)基中高密度培養(yǎng)，它的這些特征加上十多年外源基因表達的經驗使其在大多數科研應用中成為高效表達異源蛋白最常用的原核表達系統。盡管大腸桿菌有眾多的優(yōu)點，但并非每一種基因都能在其中有效表達。
[0003]正常生理條件下膜蛋白的天然表達水平較低，對其異源大量表達成為功能和結構研究的先決條件。結合膜蛋白純化和結晶的困難，膜蛋白的異源表達也因其疏水特性、細胞脫容量的有限性、對宿主細胞的毒性等問題成為膜蛋白相關研究的瓶頸。尤其對于真核細胞膜蛋白的原核表達，宿主的不相容性往往會帶來更大的難題:截至2005年止，尚無一例以重組表達方式獲得結構信息的膜蛋白的報道。而一個耐受膜蛋白的表達菌對于成功表達膜至關重要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種可過量表達膜蛋白細菌，該菌株對膜蛋白異常有極大耐受性，采 用上述菌株，可過量表達膜蛋白，具有良好的應用前景。
[0005]本發(fā)明的一種可過量表達膜蛋白細菌，該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia colil098_3，保藏號為 CGMCC N0.8696，其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。于2014年I月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0006]本發(fā)明的一種可過量表達膜蛋白細菌的應用，具體方法如下:利用超表達載體攜帶外源膜蛋白基因序列，通過電擊轉化或熱激轉化轉入菌株，菌株37°C培養(yǎng)OD6c?至
0.3-0.4，加IPTG至終濃度0.7mg/L，培養(yǎng)6_18h，收獲菌種。
[0007]所述電擊轉化的工藝條件為:0.2cm的電轉化池放入槽中，1_1.5kV，25uF，200歐；電擊后取出加入1ml SOB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時；涂布于SD平板。
[0008]所述熱激轉化的工藝條件為:100L感受態(tài)細胞置于冰上，將細胞均勻懸浮；加入IOL連接好的質粒，DNA濃度為10pg/L，混勻；冰上放置30分鐘；42°C水浴熱激55秒；冰上放置10分鐘；加100L LB培養(yǎng)液，370C 250轉/分振蕩培養(yǎng)30分鐘；與此同時將LB平板置于37°C，放置片刻后加入4uL IPTG和40uL X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附滲透；將細菌涂布在含抗生素瓊脂平板上，平皿在37°C下正向放置I小時，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，培養(yǎng)過夜。
[0009]本發(fā)明描述一種從油污污染土壤中分離得到的細菌，膜厚度大，可耐受較大機械壓力，同時也能夠耐受膜蛋白毒性，可以對膜蛋白外源表達有較好耐性。根據BLAST聚類分析及形態(tài)學鑒定結果(見圖1)，將該菌株定命名為Escherichia colil098_3。該菌經檢測可顯著降低表面張力，國內外已經發(fā)現菌株是前所未見或未有應用的。
[0010]本發(fā)明提供的菌株Escherichia colil098_3的特征如下:
[0011]本發(fā)明該菌菌落圓形，凸起，表面光滑濕潤，邊緣整齊，不透明；呼吸類型為好氧呼吸，在有氧條件下生長良好，革蘭氏染色呈陽性，形態(tài)觀察菌體桿狀。測定菌株的16S rRNA部分序列，進行系統發(fā)育學分析。
_2] 有益.效果
[0013]本發(fā)明對膜蛋白異常有極大耐受性，采用上述菌株，可過量表達膜蛋白，具有良好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明菌株16S rRNA序列系統發(fā)育樹；
[0015]圖2左圖為普通菌種過量表達膜蛋白細胞結構，右圖為本發(fā)明菌株過量表達膜蛋白細胞結構。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0017]實施例1
[0018]菌種來源:本菌種來源于油污污染土壤，具體分離方法如下:
[0019](I)富集:取油污地土壤Ig于富集培養(yǎng)基(牛肉膏0.5g、蛋白胨lg、氯化鈉
0.5g, ρΗ7.0~7.6)中，于28°C、120轉/min恒溫培養(yǎng)48h。再取其培養(yǎng)液2mL轉入另一富集培養(yǎng)基中，28°C，120轉/min進一步富集培養(yǎng)48h。
[0020](2)初篩:取終富集液100 μ L油平板培養(yǎng)基(原油5g、氯化銨6g、硫酸鎂0.2g、氯化鈣0.0Olg磷酸二氫鉀4.lg、磷酸氫二鈉14g、EDTA0.0Olg、瓊脂20g、酵母粉0.5g、H201000ml、pH7.4)，初步篩選出透明圈較大的單菌落。
[0021](3)復篩:將初篩得到的菌種分別點接于磷酸消解蛋白培養(yǎng)基平板和羽毛粉平板培養(yǎng)基平板，于37°C下恒溫振蕩培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液離心得上清測表面張力大小,最后獲得菌株1098-3，表面張力為34.3mN/m。
[0022]菌種鑒定:
[0023](I)菌落形態(tài)觀察:在LB平板上對菌株進行劃線分離，24h后觀察單菌落形態(tài)并對細菌進行革蘭氏染色，觀察細胞形態(tài)。
[0024](2)菌體形態(tài)觀 察:將菌株制片，進行革蘭式染色后，用帶拍攝裝置的光學顯微鏡觀察菌體的形狀、大小、及其特殊構造，并拍攝菌體染色照片。
[0025](3)分子鑒定
[0026]①菌株DNA的提取方法[0027]A、取Iml細菌過夜培養(yǎng)液移至1.5mL的Eppendorf管中，5000rpm離心10分鐘,去
上清液；
[0028]B、立即加入600 μ L預熱的提取緩沖液，混勻后，65°C溫浴Ih ；
[0029]C、冰浴冷卻(5分鐘)，加入600 μ L酚/氯仿(1:1)溶液，顛倒混勻后，靜置lOmin，然后 12000rpm 離心 6min ；
[0030]D、上清轉移至另一個Eppendorf管中，加入等體積氯仿,靜置5min, 12000rpm離心5min ;E、取上清液，加入等體積異丙醇，沉淀DNA ；
[0031]F、用玻棒撈出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于500yLTE或重蒸水中，-20°C保存。如DNA沉淀無法撈出，可5000rpm離心，使DNA沉淀；
[0032]②16S rRNA的基因擴增
[0033]A、PCR反應引物為通用引物:
[0034]BSF8 (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和 BSRl541(AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)
[0035]B、在冰上建立PCR反應體系:
【權利要求】
1.一種可過量表達膜蛋白細菌，其特征在于:該菌株為埃希氏大腸桿菌，命名為Escherichia colil098_3，保藏號為 CGMCC N0.8696，其 16S rRNA 序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一種如權利要求1所述的可過量表達膜蛋白細菌的應用，其特征在于:具體方法如下:利用超表達載體攜帶外源膜蛋白基因序列，通過電擊轉化或熱激轉化轉入菌株，菌株37°C培養(yǎng)OD6tltl至0.3-0.4，加IPTG至終濃度0.7mg/L,培養(yǎng)6_18h，收獲菌種。
3.根據權利要求2所述的一種可過量表達膜蛋白細菌的應用，其特征在于:所述電擊轉化的工藝條件為:0.2cm的電轉化池放入槽中，1-1.5kV，25uF，200歐；電擊后取出加入Iml SOB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)I小時；涂布于SD平板。
4.根據權利要求2所述的一種可過量表達膜蛋白細菌的應用，其特征在于:所述熱激轉化的工藝條件為:100L感受態(tài)細胞置于冰上，將細胞均勻懸??；加入IOL連接好的質粒，DNA濃度為10pg/L，混勻；冰上放置30分鐘；42°C水浴熱激55秒；冰上放置10分鐘；加100LLB培養(yǎng)液，370C 250轉/分振蕩培養(yǎng)30分鐘；與此同時將LB平板置于37°C，放置片刻后加入4uL IPTG和40uL X-Gal均涂布于平板表面放置使之吸附滲透；將細菌涂布在含抗生素瓊脂平板上，平皿在37°C下正向放置 I小時，待接種的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，培養(yǎng)過夜。
【文檔編號】C12N1/21GK103992979SQ201410145843
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權日:2014年4月11日
【發(fā)明者】張中鴿, 曹張軍 申請人:東華大學, 張中鴿