一種高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其重組表達的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一個高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（CGTase）基因，從嗜熱脂肪地芽孢桿菌GeobacilluscaldoxylosilyticusCHB1基因組中擴增得到一個編碼CGTase基因cgt，其序列如SEQ?ID?NO：1所示，該基因用表達載體pLLP-OmpA和pEASY-E2-OmpA實現(xiàn)了胞外分泌表達。該重組酶具有環(huán)化活性，主產(chǎn)物為α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精，最適反應(yīng)溫度為60～65℃，在50℃以下和85℃以上條件下酶活性較低。該重組酶適合工業(yè)生產(chǎn)α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精，可以滿足食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域?qū)Νh(huán)糊精的需求。
【專利說明】一種高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其重組表達
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)基因cgt以及其原核重組表達。具體地說是一種cgt基因的克隆及其在大腸桿菌中分泌性表達。重組酶可以利用可溶性淀粉為底物生產(chǎn)α-環(huán)糊精和環(huán)糊精。
【背景技術(shù)】
[0002]高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)是α -淀粉酶家族的重要成員，具有環(huán)化、歧化、水解和耦合四種活性。目前的生產(chǎn)中主要應(yīng)用其環(huán)化反應(yīng)以淀粉為底物生成環(huán)糊精。CGTase催化淀粉主要產(chǎn)生三種環(huán)糊精:α-環(huán)糊精、β -環(huán)糊精和Y _環(huán)糊精(分別對應(yīng)著6、7和8個葡萄糖基)。環(huán)糊精內(nèi)部疏水外部親水的空腔結(jié)構(gòu)可以包裹許多小分子物質(zhì)從而改善這些物質(zhì)的理化性質(zhì)，因而在食品、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)境等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
[0003]目前應(yīng)用的CGTase主要來源于細菌，已發(fā)現(xiàn)Bacillus sp、Thermococcus sp多種細菌產(chǎn)CGTase。由于產(chǎn)CGTase野生型菌株產(chǎn)酶量相對較低，生產(chǎn)應(yīng)用中比較重視重組CGTase酶基因工程菌的研究，目前最常用的CGTase酶表達宿主菌為大腸桿菌，也有報道用真核表達系統(tǒng)畢赤酵母表達該酶。大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢是表達量大，但也存在重組蛋白易形成包涵體，可溶性差，以及難以實現(xiàn)胞外分泌表達的問題。陳堅等比較了不同信號肽對浸麻油芽孢桿菌來源CGTase在重組大腸桿菌中分泌表達的影響，證明OmpA信號肽能可以有效介導(dǎo)該酶的分泌表達；Montarop Yamabhai發(fā)現(xiàn)來源不同的Bacillus sp信號肽能夠很好地介導(dǎo)重組基因在大腸菌中的分泌表達。
[0004]本發(fā)明克隆得到源自嗜熱菌Geobacillus sp的一個CGTase基因，并應(yīng)用帶有OmpA信號肽的表達載體pLLP-OmpA以及pEASY-E2_0mpA對該酶進行了高效分泌表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其重組表達，一個源于嗜熱菌Geobacillus caldoxy1silyticus CHBl的一個cgt基因，其核苷酸序列包含2136個堿基，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示，該基因有完整的環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因cgt開放閱讀框，起始密碼子ATG,終止密碼子TAA,與GenBank中B.stearthermophiIIuscgt232 gene for cyclodextrin glucanotransferase 的同源性最高 2033/2138(95%)。本發(fā)明的另一個目的是提供上述cgt基因的編碼的高溫CGTase，該酶包含711個氨基酸，其中包括一個35個氨基酸的信號肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，與GenBank中CGTase最高同源性為685/711 (96%)。
[0006]嗜熱脂肪地芽胞桿菌菌株(Geobacillus caldoxy1silyticus) CHB1,該菌株已于2013年8月28日在中國典型培養(yǎng)物菌種保藏中心登記保藏，保藏編號為CCTCC M 2013384，保藏地址為武漢大學。
[0007] 本發(fā)明的再一個目的是提供包含本發(fā)明的兩種重組表達載體pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt。[0008]本發(fā)明的又另一個目的是提供包含上述重組表達載體的兩個宿主細胞大腸桿菌ToplOF’ 和 BL21 菌株。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的:
一個編碼高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，所述基因為cgt基因，其堿基序列如SEQID NO:I 所示。
[0010]如權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011 ] 所述重組表達載體為pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,該表達載體含有分泌型表達信號肽OmpA和權(quán)利要求1所述cgt基因。
[0012]在兩種宿主細胞ToplOF’和BL21中，分別轉(zhuǎn)化入表達載體pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,實現(xiàn)cgt基因在兩種宿主細胞中分泌性表達。
[0013]具體方法如下:
首先對該cgt基因進行克隆并測序
Cl)模板制備:取處于對數(shù)后期的CHBl菌液ImL于1.5 mL離心管中10000 g離心，用100 ul無菌水懸浮菌體,沸水浴10 min后迅速置于冰上30 min,即制得PCR擴增模板。
[0014](2)引物設(shè)計:上游引物為CF:ATGAAAAGATGGCTTTCATTG,下游引物為CR:GTTTTGCCAATTCACTATAAT。 [0015](3)cgt 的PCR擴增:95°C預(yù)變性5 min，然后94 °C 50s, 55 °C 50s, 72 °C 2 min 30s,33個循環(huán)，最后后延伸10 min，擴增產(chǎn)物連接到pMD19T后測序。
[0016]進一步地針對該基因序列構(gòu)建表達載體并進行重組表達
(O構(gòu)建表達載體:從cgt信號肽序列后設(shè)計前端引物CGTF:CGCGGATCCAATAAGGTAAATTTTACATCG (BamHl ),后端引物 CGTR:CGGAATTCGTTTTGCCAATTCACTATAAT (EcoRI),以 Geobacillus sp 菌液為模板擴增帶有酶切位點的目的基因，擴增產(chǎn)物與PMD19T載體連接后送測序公司測序以確認堿基無突變，得到重組質(zhì)粒pMD19T-cgt。提取pMD19T-cgt質(zhì)粒,用BamHl和EcoRl雙酶切,膠回收cgt目的片段。提取質(zhì)粒pLLP-OmpA和質(zhì)粒pEASY-E2_0mpA，同樣用BamHl和EcoRl雙酶切后膠回收酶切產(chǎn)物。將雙酶切后的目的基因和質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞。挑取轉(zhuǎn)化子重新提質(zhì)粒，雙酶切驗證為陽性克隆，得到重組表達質(zhì)粒pLLP-OmpA-cgt 和 pEASY-E2-0mpA_cgt。
[0017](2)重組子獲取及誘導(dǎo)表達:將重組質(zhì)粒pLLP-OmpA-cgt熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌化學感受態(tài)細胞ToplOF’，將重組質(zhì)粒pEASY-E2-0mpA-cgt熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21，在Amp抗性LB平板上挑取轉(zhuǎn)化菌落擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)物0D_達到0.6時加入終濃度為ImMIPTG誘導(dǎo)表達，表達條件為30 0C, 220 rpm, 10 h ;培養(yǎng)物超速離心獲取菌體，PBS懸浮后冰浴超聲破碎，超聲參數(shù)為功率400 W，超聲2s，間隔2s，工作80次；分別取破碎后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。SDS-PAGE采用12 %的分離膠和4 %的濃縮膠，考馬斯亮藍R250染色。
[0018]進一步地檢測重組菌的胞外酶活力
(O挑取重組菌單菌落，于50 mL氨芐青霉素濃度為100 mg/L的LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨 I %，酵母浸粉 0.5 %，NaCl I %，pH 7.0)中，37 °C，200 rpm 培養(yǎng)過夜；
(2)1 %的接種量將上述種子液接入50 mL氨芐青霉素濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，37 V，200 rpm培養(yǎng)至OD 600達到0.6時加入終濃度為ImM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)，每個6 h取樣檢測胞外酶活性；
(3)檢測重組a -CGTase活性，取離心后得到的發(fā)酵液上清即粗酶液0.1 mL，加入到裝有0.9 ml預(yù)先用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)配制的3 % (w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在60 °C下反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL I mo I/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)，再加入1.0 ml預(yù)先用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)配制的0.1 mmol/L的甲基橙溶液,混勻后于16。(^下保溫20 min,在波長505 nm處測定吸光度。根據(jù)α-環(huán)糊精標準曲線計算出α-環(huán)糊精的濃度，一個酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘生成I μ mol的α -環(huán)糊精所需的酶量。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點在于:提供了一種高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，同時本發(fā)明所用于表達該基因的兩株重組菌均可實現(xiàn)重組環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的胞外分泌表達。為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)基礎(chǔ)。重組酶作用于可溶性淀粉的主產(chǎn)物為α-環(huán)糊精和β -環(huán)糊精，因此該酶可用于生產(chǎn)這兩種環(huán)糊精產(chǎn)品。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1 cgt 基因重組質(zhì)粒 pLLP-OmpA-cgt。
[0021]圖2 cgt 基因重組質(zhì)粒 pEASY-E2-0mpA_cgt。
[0022]圖3 cgt重組菌pLLP-0mpA-cgt/Topl0F’的SDS-PAGE驗證,其中泳道M:蛋白標準分子量泳道1:菌株ToplOF’破碎后上清蛋白泳道2:含有質(zhì)粒pLLP-OmpA空載體的ToplOF’菌株破碎后上清蛋白泳道3:重組菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’未誘導(dǎo)上清蛋白泳道4:重組菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’經(jīng)IPTG誘導(dǎo)破碎后沉淀蛋白泳道5:重組菌株pLLP-OmpA-cgt/ToplOF’經(jīng)IPTG誘導(dǎo)破碎后上清蛋白泳道6:鎳柱純化后的重組CGTase。
[0023]圖4 cgt重組菌pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21表達驗證，其中泳道M:蛋白標準分子量泳道1:菌株大腸桿菌BL21破碎后沉淀蛋白泳道2:菌株大腸桿菌BL21破碎后上清蛋白泳道3:重組菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21未誘導(dǎo)沉淀蛋白泳道4:重組菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21 未誘導(dǎo)上清蛋白泳道 5:重組菌株 pEASY-E2-0mpA_cgt/BL21 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)破碎后沉淀蛋白泳道6:重組菌株pEASY-E2-0mpA-cgt/BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)破碎后上清蛋白。
[0024]圖5 pEASY-E2-0mpA-cgt表達重組酶的最適反應(yīng)溫度。
[0025]圖6 α，β和Y環(huán)糊精標準品的HPLC峰圖。其中峰6.709為α-環(huán)糊精，峰7.352為β -環(huán)糊精，峰8.267為Y -環(huán)糊精。
[0026]圖7 pEASY-E2-0mpA-cgt表達CGTase催化可溶性淀粉產(chǎn)物的HPLC峰圖，其中峰
6.709為α -環(huán)糊精，峰7.352為β -環(huán)糊精，峰8.267為Y -環(huán)糊精
【具體實施方式】
[0027]實施例1
本實施例說明菌株Geobacillus caldoxy1silyticus CHBl基因組編碼的cgt基因的克隆。
[0028]挑取Geobacillus cal doxy 1si lyticus CHBl菌株單菌落接種于CHBl液體發(fā)酵培養(yǎng)基(牛肉浸膏0.5 %，大豆蛋白胨0.9 %，磷酸氫二鉀0.1 %，磷酸二氫鉀0.75 %，蒸餾水配制，pH 7.2), 60°C, 180 rpm恒溫搖床培養(yǎng),取對數(shù)后期菌液ImL于1.5 mL滅菌的離心管中，1000 g離心,再用100 ul無菌水懸浮菌體,沸水浴10 min后迅速置于冰上30 min,即為擴增cgt所需模板?；旌螴 ul模板，I ul上游引物(CF:ATGAAAAGATGGCTTTCATTG), I ul下游引物(CR:GTTTTGCCAATTCACTATAAT), 25 ul ExTaqMix (包含 Buffer，Taq 酶和 dNTP)，ddH20 補足至50 ul。應(yīng)用上述反應(yīng)體系進行PCR擴增，擴增程序為95°C預(yù)變性5 min，然后94°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸2 min 30s，共33個循環(huán)，最后在于72°C后延伸IOmin。I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測證明擴增得到長約2100 bp的目的片段。瓊脂糖凝膠切膠回收后的PCR產(chǎn)物連接于pMD19-T克隆載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于藍白篩選固體平板，37 °〇培養(yǎng)過夜，挑取8個白色克隆子于液體LB抗性培養(yǎng)基(蛋白胨1%，酵母浸粉0.5 %，NaCl I %，pH 7.0，氨芐青霉素100 mg/L)，培養(yǎng)基渾濁后提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒委托測序公司測序，結(jié)果表明插入的片段為2136個核苷酸的目的基因，其開放閱讀框可以編碼含711個氨基酸的蛋白質(zhì)。
[0029]實施例2
本實施例說明cgt基因表達載體的構(gòu)建程序。
[0030]本發(fā)明應(yīng)用兩種表達載體構(gòu)建cgt基因的重組質(zhì)粒，pLLP-OmpA質(zhì)粒是一個由PL啟動子控制的含分泌型信號肽OmpA的一個表達質(zhì)粒，pEASY-E2-0mpA是一個由T7啟動子控制的含有OmpA信號肽的表達質(zhì)粒，首先應(yīng)用限制性內(nèi)切酶BamHl和EcoRl對質(zhì)粒pLLP-OmpA、pEASY-E2_0mpA進行雙酶切，瓊脂糖凝膠切膠回收雙酶切產(chǎn)物。然后從cgt信號肽序列后設(shè)計前端表達引物CGTF:CGCGGATCCAATAAGGTAAATTTTACATCG (BamHl )，后端表達引物 CGTR:CGGAATTCGTTTTGCCAATTCACTATAAT (EcoRI )，擴增體系為 I ul 上游引物 CGTF，I ul 下游引物 CGTR, 25 ul ExTaqMix (包含 Buffer, Taq 酶和 dNTP)，ddH20 補足至 50 ul。擴增程序為95°C預(yù)變性5 min,然后94°C變性50s，55°C退火50s，72°C延伸2 min 30s，共33個循環(huán)，最后在于72°C后延伸10 min。I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測后瓊脂糖凝膠電泳切膠回收cgt基因片段。應(yīng)用BamHl和EcoRl對目的基因雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，將回收的目的片段分別與雙酶切后的pLLP-OmpA和pEASY-E2_0mpA質(zhì)粒連接，應(yīng)用T4DNA連接酶連接，目的基因和質(zhì)粒的摩爾比為10:1，將兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100 mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取若干單菌落劃線于新的氨芐青霉素的抗性平板，用純化的單克隆進行PCR驗證，結(jié)果兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后均獲得了陽性克隆，即獲得了 cgt基因重組質(zhì)粒pLLP-OmpA-cgt (圖1)和pEASY-E2-0mpA-cgt (圖2)，LB液體培養(yǎng)陽性菌落，抽提質(zhì)粒。
[0031]實施例3
本實施例說明cgt基因重組菌的獲得程序。
[0032] 將重組質(zhì)粒pLLP-OmpA-cgt轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplOF’,將重組質(zhì)粒pEASY-E2-0mpA-cgt轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21，將兩種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含100 mg/L氨芐青霉素的LB抗性平板，37°C過夜培養(yǎng)，每種平板各挑取6個單菌落轉(zhuǎn)接于液體氨芐青霉素抗性培養(yǎng)基，37°C，200 rpm培養(yǎng)至菌液變渾濁，應(yīng)用表達引物CGTF和CGTR進行菌液PCR驗證，結(jié)果證明得到了兩種重組大腸桿菌ToplOF’ /pLLP-OmpA-cgt和BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt。分別挑取兩種轉(zhuǎn)化子與100mg/L氨芐抗性LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，然后以I %的接種量轉(zhuǎn)接入100 mg/L氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37°C，200 rpm培養(yǎng)至0D600達0.6時加入終濃度為ImM的IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間為7 h。
[0033]各取8 mL菌液離心，3 mLPBS緩沖液懸浮沉淀，冰浴超聲破碎，超聲參數(shù)為功率400 W，超聲2s，間隔2s，工作80次；分別取破碎后的上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析。SDS-PAGE采用12 %的分離膠和4 %的濃縮膠，考馬斯亮藍R250染色。SDS-PAGE結(jié)果表明兩種重組大腸桿菌均實現(xiàn)了 CGTase的表達，ToplOF’ /pLLP-OmpA-cgt表達情況見圖3，BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt 表達情況見圖 4。
[0034]實施例4
本實例說明重組CGTase的胞外分泌表達。
[0035]重組重組CGTase胞外酶活性的定性檢測:將兩種重組大腸桿菌的種子液按照1%的接種量接種50 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200 rpm培養(yǎng)，OD600達到0.6時用終濃度ImM的IPTG誘導(dǎo)，25°C繼續(xù)培養(yǎng)，每隔6 h取ImL菌液，超速離心后取100 ul上清和100 ul 2 %的可溶性淀粉溶液于60°C反應(yīng)5 min，碘液顯色觀察淀粉分解活性，發(fā)現(xiàn)重組菌ToplOF’/pLLP-OmpA-cgt和BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt均具有胞外降解淀粉的能力，說明二者均實現(xiàn)了胞外表達。
[0036]重組CGTase胞外酶活性的測定:以BL21/pEASY-E2-0mpA-cgt為例應(yīng)用甲基橙褪色法檢測胞外酶環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)α-環(huán)糊精的活性。取離心后得到的發(fā)酵液上清即粗酶液0.1mL,加入到裝有0.9 ml預(yù)先用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)配制的3% (w/v)可溶性淀粉溶液的試管中，在60°C下反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL lmol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)，再加入1.0 ml預(yù)先用50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)配制的0.1 mmol/L的甲基橙溶液，混勻后于16°C下保溫20 min，應(yīng)用酶標儀在波長505 nm處測定吸光度A，設(shè)置空白對照吸光度A0，校正吸光度Al (可溶性淀粉+甲基橙溶液)和校正吸光度A2 (酶液+甲基橙溶液)，每個測定值設(shè)置三個重復(fù)，計算公式Λ A= (AO-A)- (AO-Al)- (Α0-Α2)，根據(jù)α -環(huán)糊精標準曲線計算出α -環(huán)糊精的濃度，一個酶活力單位定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘生成I μ mol的α -環(huán)糊精所需的酶量。測定結(jié)果顯示在誘導(dǎo)至70 h時胞外酶的環(huán)化活性達到 12 U。
[0037]實施例5
本實例確定了該重組CGTase酶的溫度反應(yīng)范圍。應(yīng)用上述甲基橙褪色法測定該酶在不同溫度下酶活，結(jié)果如圖5所示。
[0038]實施例6
本實例確定了該重組CGTase酶的反應(yīng)產(chǎn)物。取適量純化后的重組酶于3%的可溶性淀粉溶液中，60%反應(yīng)3h，反應(yīng)產(chǎn)物用0.22 μ m的微孔濾膜過濾后用HPLC分析產(chǎn)物成分。以α，β和Y三種環(huán)糊精標準品作為對照。色譜柱為氨基柱，流動相為60%乙腈，流速為
0.9mL/min，柱溫是30度，應(yīng)用示差折光檢測器檢測器。檢測結(jié)果顯示α-環(huán)糊精的質(zhì)量比為32.04%, β -環(huán)糊精為56.24%，Y -環(huán)糊精為11.72%。峰圖結(jié)果如圖6。
【權(quán)利要求】
1.一個編碼高溫環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的基因，其特征在于:所述基因為Cgt基因，其減基序列如SEQ ID NO:I所不。
2.如權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID NO:2所/Jn ο
3.如權(quán)利要求1所述基因的重組表達載體，其特征在于:所述重組表達載體為pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt，該表達載體含有分泌型表達信號肽OmpA和權(quán)利要求1所述cgt基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因的重組表達，其特征在于:在兩種宿主細胞ToplOF’和BL21中，分別轉(zhuǎn)化入表達載體pLLP-OmpA-cgt和pEASY-OmpA-cgt,實現(xiàn)cgt基因在兩種宿主細胞中分泌性表達。
【文檔編號】C12N1/21GK103993026SQ201410148770
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】林新堅, 陳濟琛, 賈憲波, 林戎斌, 陳龍軍 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所