一種產(chǎn)連翹脂苷a、b和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌及其應用，屬于生物【技術領域】。該內(nèi)生真菌為枝狀枝胞菌（Cladosporium cladosporioides）LQ-1，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏編號：CGMCC No.8728；可以代謝產(chǎn)生與連翹成分相同的成分，具有較強的滅菌、抑菌作用，發(fā)酵培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生對致病性大腸桿菌（E.coli K99，ATCC hb-8178）、沙門氏菌（Salmonella.Typhimurium，ATCC 14028）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus，ATCC 29213）等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，包括連翹脂苷A、B和連翹苷等，是醫(yī)藥行業(yè)重要的微生物資源。
CGMCC No.8728
2014.01.15
【專利說明】一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌及其應用，屬于生物技 術領域。

【背景技術】
[0002] 從微生物中尋找能應用于農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥的天然產(chǎn)物是一個不斷變化發(fā)展的過程。這 些潛在的菌種資源對研究生物多樣性、發(fā)現(xiàn)新化合物和開發(fā)新藥都具有重要的意義。內(nèi)生 真菌次生代謝產(chǎn)物的化學結構多樣性也蘊藏著其生物活性的多樣性，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具 有重要的應用潛力。在過去70多年中，已從微生物中發(fā)現(xiàn)了 3萬?5萬種天然產(chǎn)物，其中 1萬多種有生物活性，8千多種具有抗菌或抗腫瘤活性。從微生物中獲得的抗生素、抗腫瘤 齊U、殺蟲劑、以及微生物產(chǎn)生的酶、維生素和氨基酸等都有廣泛應用。
[0003] 植物內(nèi)生真菌是個巨大的微生物新資源，具有重要的農(nóng)藥和醫(yī)藥應用潛力。從特 殊生境植物和傳統(tǒng)的藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物中篩選具有藥用價值的活性物質(zhì)或 新型化合物以創(chuàng)制新藥，解決自然資源不足，開發(fā)緊缺及新型藥物，將在很大程度上豐富人 類的藥物寶庫。
[0004] 連翹出自《神農(nóng)本草經(jīng)》，其別名又有旱連子、空翹、落翹、黃奇丹，為植物連翹的干 燥果實。其對金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、肺炎雙球菌、人型結核桿菌、百日咳桿菌，以及流 感病毒、真菌、鼻病毒等均有抑制作用。能明顯抑制炎性滲出和增強小鼠吞噬炎癥細胞能 力。水溶液能降壓，所含蘆丁能增強毛細血管致密度。此外，還有解熱、利尿、鎮(zhèn)吐、抗肝損 傷等作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌。
[0006] 同時，本發(fā)明還提供一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用。
[0007] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：
[0008] 一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌，所述的連翹內(nèi)生真菌為枝狀枝孢 (Cladosporium cladosporioides)，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年1月15日，保藏編號： CGMCCNo. 8728。
[0009] 一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用，具體的，連翹內(nèi)生真菌在 生產(chǎn)藥物活性成分(連翹脂苷A、B和連翹苷）中的應用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真菌 (CGMCC No. 8728)發(fā)酵培養(yǎng)液，分離藥物活性成分即可。更具體的，連翹內(nèi)生真菌在制備藥 物中的應用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真菌（CGMCC No. 8728)發(fā)酵培養(yǎng)液，分離藥物活性 成分，與輔料混合即可。
[0010] 所述的藥物活性成分為連翹脂苷A、連翹脂苷B和連翹苷，經(jīng)分離、純化后，可以按 照常規(guī)方法制備成片劑、顆粒劑、粉劑、注射液、口服液、脂質(zhì)體等劑型。所述的輔料為醫(yī)藥、 農(nóng)藥領域常規(guī)輔料。當制備成注射液時，輔料可采用甘露醇、葡萄糖、山梨醇等，片劑時采用 淀粉、羧甲基淀粉鈉、微晶纖維素等；口服液時采用油性基質(zhì)如脂肪酸、脂肪酸甘油酯等。
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法為：取經(jīng)活化的連翹內(nèi)生真菌置于PDB培養(yǎng)基中，在 27?29°C下震蕩培養(yǎng)4?7天即可。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明中連翅內(nèi)生真菌為枝胞菌黑霉菌（Cladosporium cladosporioides)，從河 南省洛陽市周山風景區(qū)的連翹活體中分離得到，屬于一種共生微生物，可以代謝產(chǎn)生與連 翹成分相同的成分，具有很強的殺滅和抑制細菌的作用，發(fā)酵培養(yǎng)后能夠產(chǎn)生對致病性大 腸桿菌（E. coli K99, ATCC hb-8178))、沙門氏菌（Salmonella. Typhimurium，ATCC14028)和 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus, aureus，ATCC29213)等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，包 括連翹脂苷A、B和連翹苷等，是醫(yī)藥行業(yè)重要的微生物資源。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實施例1中連翹內(nèi)生真菌在IOOX油鏡下的菌株形態(tài)圖；
[0015] 圖2為實施例1中連翹內(nèi)生真菌18s rDNA PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；
[0016] 圖3為實施例1中連翹內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；
[0017] 圖4中實施例2中連翹內(nèi)生真菌的抑菌效果圖；
[0018] 圖5為實施例2中連翹內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液的液相色譜圖。

【具體實施方式】
[0019] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。
[0020] 實施例1
[0021] 本實施例中產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌，為枝狀枝胞菌 (Cladosporium cladosporioides)LQ_l，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏編號：CGMCC No. 8728。該菌株是從河南省洛 陽市周山風景區(qū)連翹活體中分離得到。
[0022] 所述連翹內(nèi)生真菌的分離純化方法，包括以下步驟：
[0023] (1)連翹組織預處理：采集新鮮無蟲害的連翹莖、葉和花，用無菌水將表面的塵土 沖洗干凈，放入超凈工作臺，切成2cm的片段；
[0024] (2)連翹組織的表面消毒：將步驟（1)中采集的組織在無菌操作臺上進行表面消 毒，先用75%的酒精浸泡4min(3?5min均可),然后用無菌水漂洗4次（3?4次均可),再 在0. 1%的升萊中浸泡4min (3?5min均可)，最后用無菌水漂洗5次，陰干待用；
[0025] (3)檢驗消毒效果：取步驟（2)中最后一次無菌水沖洗液，涂布到PDA平板上，37°C 培養(yǎng)3天，檢驗滅菌效果，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)皿中無菌落出現(xiàn)，證明組織表面滅菌徹底(否則該分離 結果不能使用）；
[0026] (4)連翹組織內(nèi)生菌的培養(yǎng)：檢驗合格后，將步驟（2)中表面消毒過的葉和花在超 凈工作臺上用滅菌的解剖刀切成0. 5cmX0. 5cm大小的薄片，莖則用無菌刀片除去外皮層， 分內(nèi)皮層、韌皮部和木質(zhì)部各切成Icm長的片段，然后從縱切方向剪為4個部分，將小塊樣 品緊貼于PDA培養(yǎng)基平板上，每個平板接種2片（1?2片均可)，做4個重復，置于28°C恒 溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)6天（5?7天均可）；
[0027] (5)連翹內(nèi)生菌的分離純化：待步驟（4)中材料周圍長出菌落時，采用尖端菌絲 挑取法對所分離的不同形態(tài)的內(nèi)生真菌于PDA固體培養(yǎng)基平板上用劃線分離法進行純化， 28°C恒溫培養(yǎng)6天（5?7天均可)，直到分離得到單菌落；
[0028] (6)連翹分離菌的鏡檢：挑取步驟（5)中的單菌落固定在載玻片上，用革蘭氏染色 法進行染色(草酸銨結晶紫染色lmin，自來水沖洗，碘液染lmin，水洗，95%的酒精脫色20s， 水洗，番紅復染2min，水洗)，干燥后，滴加香柏油，在高倍鏡下觀察菌落形態(tài)（圖1所示為 100X油鏡下連翹內(nèi)生菌菌絲形態(tài))，并根據(jù)其菌落特征和菌絲特點，對所分離到的內(nèi)生真 菌進行初步分類鑒定，見圖1 (圖中LQ-I的菌絲在100X油鏡下呈長桿狀，無隔，有少量分 支）；
[0029] (7)連翹分離菌的保存：挑取步驟（6)中鏡檢時所用的菌絲接種于含有PDB培養(yǎng)基 的三角瓶中，在37°C、150r/min搖床中培養(yǎng)12h，至細菌長到對數(shù)期，蘸取菌懸液接種于PDA 斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)3天（2?4天均可)，再轉移到4°C的冰箱中斜面真空冷凍干燥保 存?zhèn)溆谩?br> [0030] 所述連翹內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定方法，包括以下步驟：
[0031] (1)連翹內(nèi)生真菌的活化：將保存的連翹內(nèi)生真菌菌種用平板劃線法接種在PDA 平板上，在28°C恒溫條件下倒置培養(yǎng)，待菌落生長成熟后，保存待用；
[0032] (2)連翹內(nèi)生真菌基因組DNA的提取，采用CTAB法提取連翹內(nèi)生真菌的rDNA，具 體操作步驟如下：
[0033] 1)取步驟（1)中活化的少量孢子(約0.2g)置于研缽內(nèi)，加入IOOOiiL IXCTAB提 取液，研磨；
[0034] 2)將研磨混合液轉入I. 5mL離心管中，并向離心管中再加入300 ii L IXCTAB提取 液，輕輕搖動，再將管置于65°C水浴中消化lh，在此過程中輕輕搖動3次（2?3次均可）；
[0035] 3)加入等體積預冷的苯酚-氯仿-異戊醇(體積比25:24:1 )，搖勻，12000rpm離心 lOmin，將上清液移至干凈的離心管中；
[0036] 4)在步驟3)上清液中加入等體積預冷的氯仿-異戊醇(體積比24:1)，并劇烈振 蕩使之形成懸乳狀，12000rpm離心lOmin，將上清液移至干凈的離心管中；
[0037] 5)重復3)、4)步驟，最終收集得到上清液；
[0038] 6)在步驟5)上清液中加人3mol/L NaAc使溶液終濃度為0? lmol/L，再加入2倍 體積預冷的無水乙醇，上下轉動混勻，放入_20°C冰箱過夜，沉淀DNA，沉淀完畢于12000rpm 離心15min，收集沉淀；
[0039] 7)棄去上清后，用預冷75%的乙醇洗滌DNA沉淀，然后棄去冷乙醇，共洗滌3次；
[0040] 8)將管中乙醇倒凈后，將管倒置在吸水紙上，使乙醇完全揮發(fā)；
[0041] 9)加入30 ii L TE緩沖液溶使DNA沉淀，-20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0042] (3 )PCR擴增連翹內(nèi)生真菌rDNA，采用真菌通用引物ITSl和ITS4在PCR儀上完成 PCR擴增，基因擴增反應體系（50 iiL)如下：
[0043]

【權利要求】
1. 一種產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌，其特征在于：所述的連翹內(nèi)生真菌 為枝狀枝胞菌（Cladosporium cladosporioides) LQ-1，保藏單位：中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年1月15日，保藏編號：CGMCCNo. 8728。
2. -種如權利要求1所述的產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用，其特征 在于：所述的連翹內(nèi)生真菌在生產(chǎn)藥物活性成分中的應用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真 菌發(fā)酵培養(yǎng)液，分離藥物活性成分即可。
3. 根據(jù)權利要求2所述的產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用，其特征在 于：所述的連翹內(nèi)生真菌在制備藥物中的應用，包括以下步驟：取連翹內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng) 液，分離藥物活性成分，與輔料混合即可。
4. 根據(jù)權利要求2或3所述的產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用，其特 征在于：所述的藥物活性成分為連翹脂苷A、連翹脂苷B和連翹苷。
5. 根據(jù)權利要求2或3所述的產(chǎn)連翹脂苷A、B和連翹苷的連翹內(nèi)生真菌的應用，其 特征在于：所述發(fā)酵培養(yǎng)液的制備方法為：取經(jīng)活化的連翹內(nèi)生真菌置于PDB培養(yǎng)基中，在 27?29°C下震蕩培養(yǎng)4?7天即可。
【文檔編號】C12R1/645GK104293678SQ201410149031
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權日:2014年4月14日
【發(fā)明者】牛明福, 萬鵬, 張婷婷, 李鑫玲, 秦翠麗, 宮強, 張敏, 孫軍杰, 李翔 申請人:河南科技大學