由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶及其制備方法
【專利摘要】由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶及其制備方法,屬于酶工程【技術領域】。該固定化多功能淀粉酶是以殼聚糖凝膠微球為載體，多功能淀粉酶通過共價鍵固定在殼聚糖凝膠微球上，殼聚糖凝膠微球上多功能淀粉酶的載酶蛋白數量為0.6～0.7毫克/克。其是采用中和滴定法制備微球大小均一、械強度好、且無毒副作用的殼聚糖凝膠微球，然后以該微球為載體固定多功能淀粉酶，得到穩(wěn)定的固定化多功能淀粉酶。應用本發(fā)明的固定化多功能淀粉酶催化淀粉的降解，可得到葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖。本發(fā)明的固定化多功能淀粉酶具有酶活力穩(wěn)定，酶的性能保持好，宜于儲存，制備方法簡單，成本低廉等優(yōu)點。
【專利說明】由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶工程【技術領域】，具體涉及一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶及其制備方法。
【背景技術】
[0002]多功能淀粉酶是α-淀粉酶家族中的一個亞家族，它們同時具有多種催化活性，包括水解α -1, 4糖苷鍵或α -1, 6糖苷鍵，轉糖苷形成α -1, 4糖苷鍵或α -1, 6糖苷鍵。目前已經發(fā)現的多功能淀粉酶多數是嗜熱酶或中溫酶，它們的催化性質比較接近，分子量一般在60kD~70kD。
[0003]多功能淀粉酶對人類的健康和生活具有重要的意義，并在工業(yè)生產中可最大限度地節(jié)約資源，可以催化淀粉降解、轉化，生成具有重要生理功能的異麥芽低聚糖和麥芽低聚糖產物。異麥芽低 聚糖已被公認為是雙歧桿菌的生長促進因子，具有重要的生理功能和藥用價值，因此多功能淀粉酶在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有非常重要的意義。
[0004]殼聚糖是從甲殼類動物、昆蟲外殼和真菌的細胞壁中提取的一種氨基多糖(2-氨基-2，4-β葡聚糖)，是自然界中唯一的一種堿性多糖，呈網狀結構。由于殼聚糖來源豐富、制備簡單、價格低廉，并具有諸多優(yōu)良特性，如生物兼容性、生理惰性、無毒副性、抗菌性、良好的機械性，以及可天然降解且降解產物亦無毒等，因此長期以來一直是用作固定化酶的良好載體。
[0005]當前以殼聚糖為載體用于酶的固定化的形態(tài)主要有無定型、薄膜、納米尺度、微球，其中以殼聚糖微球在酶固定化中的應用最為普遍。制備殼聚糖微球的方法有:中和滴定法、乳化交聯法、化學交聯沉淀法、離子凝膠法、溶劑蒸發(fā)法、噴霧干燥法等。中和滴定法制備的殼聚糖微球為凝膠微球，結構疏松多孔并在表面保留了大量的氨基，易于與戊二醛等共價連接形成手臂。這些特性使殼聚糖微球成為固定化酶的優(yōu)選載體之一。
[0006]酶的化學本質是蛋白質，各種理化因素均有可能使酶喪失生物活力。酶從天然體系中分離出來后，穩(wěn)定性會降低甚至會很快失去活力，或在催化反應完成后很難從反應體系中分離出來，不易回收，而且隨著反應的繼續(xù)，理化條件的改變會使酶的催化速率迅速下降，這些現象制約了酶在現代工業(yè)中的應用。固定化酶是通過適當的方法將酶固定在一定的固相載體上，在最大限度地保持游離酶功能結構的同時能夠實現回收和重復利用，解決了游離酶在實際應用中的諸多限制。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供了一種制備簡單、成本低廉、安全無毒的固定化多功能淀粉酶及其制備方法。本發(fā)明采用中和滴定法制備特定的殼聚糖凝膠微球，制備得到的殼聚糖凝膠微球大小均一，機械強度好，且無毒副作用，適合應用于食品及醫(yī)藥領域。以所制備的特定殼聚糖凝膠微球為載體，在適合多功能淀粉酶活性穩(wěn)定的特定條件下固定多功能淀粉酶，得到穩(wěn)定的固定化多功能淀粉酶。
[0008]本發(fā)明所述的一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶，是以殼聚糖凝膠微球為載體，多功能淀粉酶通過共價鍵固定在殼聚糖凝膠微球上，殼聚糖凝膠微球上多功能淀粉酶的載酶蛋白數量為0.6~0.7毫克/克。
[0009]應用本發(fā)明的固定化多功能淀粉酶催化淀粉的降解，可得到葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖和異麥芽四糖。本發(fā)明的固定化多功能淀粉酶具有酶活力穩(wěn)定，酶的性能保持好，宜于儲存，制備方法簡單，成本低廉等優(yōu)點。
[0010]本發(fā)明所述的多功能淀粉酶是從嗜溫菌Bacillus sp.ZW2531-1 [參考文獻:王陽，李樊，高朝輝，鄭曉一，張應玖.一株產新型淀粉酶的嗜溫菌ZW2531-1的分離與鑒定.吉林大學學報(理學版).2008, 46(4):779-783]中制備的一種耐熱酶[參考文獻:Fan Li (李樊)，Xuejun Zhu (朱學軍)，Yanfei Li (李雁飛)，Hao Cao (曹昊)，andYingjiu Zhang (張應玫).Functional characterization of a special thermophilicmultifunctional amylase OPMA-N and its N-terminal domain (一種特殊的耐熱性多功能淀粉酶及其N端結構域的功能特性).Acta Biochim Biophys Sin (生物化學與生物物理學報).2011，43(4):324 - 334)]，其比活力為12.82活力單位/毫克。
[0011]本發(fā)明提供的用中和滴定法制備的殼聚糖凝膠微球固定化多功能淀粉酶的制備方法，包括下列步驟:
[0012](I)初級殼聚糖 凝膠微球的制備
[0013]將殼聚糖加入到2.0% (v/v)的乙酸溶液中，配制成1.0~3.0% (w/v)的殼聚糖的乙酸溶液，然后將該溶液逐滴加到等體積的2.0摩爾濃度的氫氧化鈉溶液中，形成白色的凝膠微球，直徑為1.0~4.0毫米；將此凝膠微球室溫放置24~32小時后，用去離子水反復沖洗至中性，得到硬化的初級殼聚糖凝膠微球，呈乳白色，直徑為1.5~4.0毫米；
[0014](2)交聯殼聚糖凝膠微球的制備
[0015]將上述初級殼聚糖凝膠微球加入到1.5~3.5% (v/v)的戊二醛溶液中，兩者的用量比為0.1克:(1~2.0)毫升，然后在15~35°C、160~200轉/分鐘條件下振蕩1.5~
5.0小時，再用去離子水反復沖洗至中性，得到黃色的交聯殼聚糖凝膠微球，直徑為1.5~
4.0毫米；
[0016](3)多功能淀粉酶的固定化
[0017]配制0.1毫克/毫升的多功能淀粉酶的磷酸緩沖液(磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，PH6.5)溶液，再向該溶液中順次加入5.0% (w/v)的淀粉溶液和交聯殼聚糖凝膠微球，三者間的用量比例為(0.8~1.2)毫升:1毫升:0.1克；然后在15~35°C、160~200轉/分鐘條件下振蕩1.5~5.0小時，最后用磷酸緩沖液(磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，pH6.5)洗滌已載有多功能淀粉酶的殼聚糖凝膠微球，從而得到本發(fā)明所述的固定化多功能淀粉酶。
[0018]本發(fā)明提供的固定化多功能淀粉酶的制備方法中，如果沒有特殊說明，均為蒸餾水溶液。
[0019]本發(fā)明制備的固定化多功能淀粉酶可催化淀粉降解和轉化為多種小分子產物，其中包括大量的功能寡糖，如異麥芽三糖和異麥芽四糖，它們具有雙歧因子的作用，可促進人體腸道中雙歧桿菌的增殖。雙歧桿菌是棲息在人體腸道內的一種有益菌，具有治病、防病和保健三重作用，其功能主要有:①抑制產生毒素的有害菌如產氣莢膜桿菌的生長，保護肝臟；②促進腸道蠕動，防止便秘；③合成并保障維生素的供應，特別是維生素B族和維生素K，直接被人體吸收降低血膽固醇水平，防止動脈硬化；?增強機體免疫力并分解致癌物，抵抗腫瘤；⑥可在腸道內合成蛋白質，并促進蛋白質的消化吸收，利于機體的生長發(fā)育；⑦預防和治療乳糖消化不良；⑧增加血中SOD活性和含量，抗衰老。在兒童腸道中，雙歧桿菌占絕對優(yōu)勢。隨著年齡的增長，其數量逐漸減少，相反，有害菌的數量卻逐漸增加，引起腸道內腐敗產物的增加，從而導致人體衰老及致病。而功能寡糖如異麥芽三糖和異麥芽四糖可促進雙歧桿菌的增殖，同時又不被腸道中的有害菌利用。長期食用功能寡聚糖，可使人體腸道的雙歧桿菌增殖而保持優(yōu)勢，并從根本上增強人體的免疫力，起到增進人體健康和延緩衰老的作用。因此，本發(fā)明制備的固定化多功能淀粉酶可以在制備功能性寡糖中得到應用，進一步在制備保健品中得到應用。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:固定化多功能淀粉酶的操作穩(wěn)定性分析圖；
[0021]圖2:固定化多功能淀粉酶的儲存穩(wěn)定性分析曲線；
[0022]圖3:固定化多功能淀粉酶的最適pH曲線；
[0023]圖4:固定化多功能淀粉酶的pH穩(wěn)定性曲線；
[0024]圖5:固定化多功能淀粉酶的最適溫度曲線；
[0025]圖6:固定化多功能淀粉酶的溫度穩(wěn)定性曲線；
[0026]圖7:固定化多功能淀粉酶的L-B雙倒數曲線；
[0027]圖8:固定化多功能淀粉酶催化淀粉降解的產物分析譜圖，其中I為標準物葡萄糖(G1)、異麥芽三糖(IG3)和麥芽五糖(G5);2為標準物麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)和異麥芽四糖(IG4);3為固定化多功能淀粉酶催化淀粉的產物[葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、異麥芽三糖(IG3)和異麥芽四糖(IG4)]。
【具體實施方式】:
[0028]實施例1固定化多功能淀粉酶的制備I
[0029]將殼聚糖(購自北京索來寶，脫乙酰度≥90%)加入到2.0% (v/v)的乙酸溶液中，配制成2.0% (w/v)的殼聚糖乙酸溶液，然后將此溶液逐滴加到等體積的2.0摩爾濃度的氫氧化鈉溶液中，形成白色的凝膠微球，平均直徑為2.0毫米，將此微球室溫放置24小時后，用去離子水反復沖洗至中性，得到硬化的初級殼聚糖凝膠微球，呈乳白色，平均直徑為2.0毫米，平均質量為0.025克。
[0030]將上述硬化的殼聚糖凝膠微球按質量體積比為0.1:1 (克:毫升)加到2.0% (v/V)的戊二醛(購自國藥集團化學試劑有限公司)溶液中，然后在35°C、180轉/分鐘條件下振蕩3.5小時，然后用去離子水洗殼聚糖凝膠微球5次至中性，得到黃色的交聯殼聚糖凝膠微球，平均直徑為2.0毫米，平均質量為0.025克。
[0031]將多功能淀粉酶用50毫摩爾濃度的磷酸緩沖液(磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，pH6.5)配制成0.1毫克/毫升的酶溶液，并用蒸餾水配制5.0% (w/v)的淀粉(購自天津市北聯精化學品開發(fā)有限公司)溶液，然后按0.8:1:0.1 (毫升:毫升:克)比例將上述0.1毫克/毫升的多功能淀粉酶溶液、5.0% (w/v )的淀粉溶液和上述制備的黃色殼聚糖凝膠微球混合，在25°C、180轉/分鐘條件下振蕩1.5小時，然后用50毫摩爾濃度的磷酸緩沖液(磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，PH6.5)洗滌已載有多功能淀粉酶的黃色殼聚糖微球，得到固定化多功能淀粉酶。
[0032]多功能淀粉酶的活力測定方法如下:
[0033]在10毫升試管中依次加入3.0毫升蒸餾水，0.5毫升磷酸緩沖液(50毫摩爾濃度的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，PH7.0), I毫升淀粉溶液(見實施例2)，0.5毫升多功能淀粉酶溶液(見實施例2)，混勻后置于50°C水浴中反應30分鐘，再加入I毫升終止劑[含有0.5%(w/v) 3，5- 二硝基水楊酸，30% (w/v)酒石酸鉀鈉，1.6% (w/v)氫氧化鈉]后置于沸水浴中5分鐘,再置于冰水浴冷卻反應液。在25毫升血糖管中依次加入1.5毫升蒸懼水，1.5毫升DNS[含有0.5% (w/v)結晶酚，0.5% (w/v)亞硫酸氫鈉，21% (w/v)酒石酸鉀鈉，0.7% (w/v)3，5- 二硝基水楊酸，2.6% (w/v)氫氧化鈉]，0.5毫升上述反應液，混合均勻后放入沸水中煮5分鐘，稍后置于冰水中冷卻，用蒸餾水定容至25毫升，混均勻后在520nm吸光度下測定其吸光度值。
[0034]多功能淀粉酶的酶活力單位定義為:在50°C下，30分鐘內水解1%淀粉產生相當于I微摩爾葡萄糖還原端的酶量為一個活力單位。
[0035]測定固定化多功能淀粉酶的酶活力時，用0.05克的固定化多功能淀粉酶取代上述方法中的多功能淀粉酶，其余同上。
[0036]分別按上述方法測定固定化多功能淀粉酶和未固定化的多功能淀粉酶的活力與酶蛋白數量，并按下列公式計算固定化多功能淀粉酶的固定的酶蛋白數量與活力回收率:
[0037]固定的酶蛋白數量(毫克)=加入的酶蛋白數量(毫克)一未固定上的游離酶蛋白數量(暈克)
[0038]酶活力回收率=固定化酶的總活力單位/加入酶的總活力單位X 100%
[0039]經測定和計算，固定化多功能淀粉酶的活力為35.7活力單位/毫克，固定的酶蛋白數量為0.6毫克/克微球，酶活力回收率為232%。
[0040]實施例2固定化多功能淀粉酶的制備II
[0041]應用實施例1制備的黃色的交聯殼聚糖凝膠微球，按1.0:1:0.1(毫升:毫升:克)比例將實施例1中配制的0.1毫克/毫升的多功能淀粉酶溶液、5.0% (w/v)的淀粉溶液和上述黃色殼聚糖凝膠微球混合，用實施例1中的方法制備固定化多功能淀粉酶。
[0042]按實施例1中方法經測定和計算，固定化多功能淀粉酶的活力為42.8活力單位/毫克，固定的酶蛋 白數量為0.7毫克/克微球，酶活力回收率為201%。
[0043]實施例3固定化多功能淀粉酶的制備III
[0044]應用實施例1制備的黃色的交聯殼聚糖凝膠微球，按1.2:1:0.1(毫升:毫升:克)比例將實施例1中配制的0.1毫克/毫升的多功能淀粉酶溶液、5.0% (w/v)的淀粉溶液和上述黃色殼聚糖凝膠微球混合，用實施例1中的方法制備固定化多功能淀粉酶。
[0045]按實施例1中方法經測定和計算，固定化多功能淀粉酶的活力為42.8活力單位/毫克，固定的酶蛋白數量為0.7毫克/克微球，酶活力回收率為195%。本實施例的結果表明，本發(fā)明制備的殼聚糖凝膠微球上多功能淀粉酶的載酶蛋白的飽和數量為0.7毫克/克。
[0046]實施例4固定化多功能淀粉酶的性質分析(實施例2制備的固定化多功能淀粉酶)
[0047]( I)固定化多功能淀粉酶操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性分析[0048]按照如下公式計算固定化酶的半衰期:t1/2=0.693t/2.3031g(E0/E)。其中，t1/2:固定化酶半衰期；t:放置時間；Eq:初始酶活力；E:放置時間t后的酶活力。
[0049]重復使用固定化多功能淀粉酶催化淀粉降解，每日一次，比較每次測得的固定化淀粉酶的催化活力，結果如圖1所示，固定化多功能淀粉酶重復使用了 15次后，其催化活力仍可保持初始活力的75%，按照半衰期計算公式計算出固定化多功能淀粉酶的操作半衰期為36次。該結果表明本發(fā)明制備的固定化多功能淀粉酶具有良好的操作穩(wěn)定性。
[0050]將固定化多功能淀粉酶置于4°C、磷酸緩沖液(pH7.0)環(huán)境中儲存，每5天測定一次酶活力，共儲存30天，結果如圖2所示。結果發(fā)現儲存30天后固定化多功能淀粉酶活力能夠保存49%，按照上述半衰期計算公式計算得到固定化酶的4°C儲存半衰期為29天。
[0051](2)固定化多功能淀粉酶的最適pH測定
[0052]在ρΗ5.5~9.0的磷酸緩沖液(50毫摩爾濃度的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉)體系中測定固定化多功能淀粉酶的催化活性，以最高活力為100%計，結果如圖3所示。圖3結果表明，固定化多功能淀粉酶的最適PH為6.0，在pH5.5~8.5的范圍內，固定化多功能淀粉酶的催化活力均能保持在80%以上，表明固定化的多功能淀粉酶對于pH的改變有著較好的適應性。[0053](3)固定化多功能淀粉酶酸堿穩(wěn)定性分析
[0054]分別將固定化多功能淀粉酶置于pH3.0~10.0的緩沖液(50毫摩爾濃度的醋酸-醋酸鈉，PH3.0~5.0 ；50毫摩爾濃度的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，pH6.0~8.0 ；50毫摩爾濃度的甘氨酸-氫氧化鈉，PH9.0~10.0)中孵育I小時后，測定其催化活性，以最高活力為100%計，結果如圖4所不。圖4結果表明，固定化多功能?疋粉酶在pH為7.0環(huán)境中穩(wěn)定性最好，在PH5.0~8.0環(huán)境中酶活力能夠保持80%以上。
[0055](4)固定化多功能淀粉酶的最適溫度測定
[0056]在30°C~90°C條件下測定固定化多功能淀粉酶的催化活性以最高活力為100%計，結果如圖5所示。圖5結果表明，固定化多功能淀粉酶的最適溫度為50°C，當溫度高于50°C時，固定化多功能淀粉酶的催化活力明顯下降，而在低于50°C時，酶活力可保留80%以上。
[0057](5)固定化多功能淀粉酶的熱穩(wěn)定性分析
[0058]將固定化多功能淀粉酶置于20°C~90°C的環(huán)境中孵育I小時后，測定其催化活性，以最高活力為100%計，結果如圖6所示。圖6結果表明，在低溫時，多功能淀粉酶能保持較高的酶活力，而隨著溫度的升高，固定化酶的穩(wěn)定性有所降低。
[0059](6)固定化多功能淀粉酶催化動力學參數測定
[0060]在50°C，pH7.0的磷酸緩沖液(50毫摩爾濃度的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉)中，分別以2、4、6、8、10、15、20毫克/毫升淀粉作底物，測定固定化多功能淀粉酶在所述不同底物濃度下的反應初速度，雙倒數作圖如圖7所示，根據7雙倒數曲線分別計算固定化多功能淀粉酶Km (米氏常數)為23.1毫克/毫升、kcat (催化常數)為114.9分鐘^及kcat/Km為
4.9毫升.毫克―1.分鐘、
[0061](7)固定化酶催化產物的分析
[0062]固定化多功能淀粉酶反應體系:1.5毫升EP管中加入0.5毫升蒸餾水，0.1毫升磷酸鹽緩沖液(50毫摩爾濃度的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉，pH7.0)，0.2毫升淀粉溶液(見實施例2)，在60°C水浴中預熱5分鐘后，加入0.02g固定化多功能淀粉酶，總體積為I毫升。將上述反應體系置于50°C水浴中72小時，再煮沸5分鐘，離心(4°C，12000轉/分鐘，3分鐘)，
取上清液進行薄層層析。
[0063]薄層層析:將樣品在硅 膠板上距離下沿處每隔1.5-2.0厘米點一種樣品，可反復點樣，控制點樣斑直徑不超過2毫米，晾干后放入層析缸用展開劑[正丁醇8:冰乙酸1:水I (v/v)]展開三至四次。將層析板晾干，均勻地把顯色劑(苯胺0.5毫升+ 二苯胺0.5g+25毫升丙酮+5毫升磷酸)噴霧在硅膠板上，晾干后放入100°C烘箱內5-10分鐘至斑點顯現。
[0064]結果如圖8所示。根據顯色斑點發(fā)現，固定化多功能淀粉酶催化淀粉的產物有葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、異麥芽三糖(IG3)和異麥芽四糖(IG4)。
【權利要求】
1.一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶，其特征在于:是以殼聚糖凝膠微球為載體，多功能淀粉酶通過共價鍵固定在殼聚糖凝膠微球上，殼聚糖凝膠微球上多功能淀粉酶的載酶蛋白數量為0.6~0.7毫克/克。
2.一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶的制備方法，其步驟如下: (1)初級殼聚糖凝膠微球的制備 將殼聚糖加入到乙酸溶液中，配制成1.0~3.0% (w/v)的殼聚糖的乙酸溶液，然后將該溶液逐滴加到等體積的2.0摩爾濃度的氫氧化鈉溶液中，形成白色的凝膠微球；再將此凝膠微球室溫放置24~32小時后，用去離子水反復沖洗至中性，得到硬化的初級殼聚糖凝膠微球； (2)交聯殼聚糖凝膠微球的制備 將上述初級殼聚糖凝膠微球加入到戊二醛溶液中，兩者的用量比為0.1克:(1~2.0)毫升，振蕩反應后用去離子水反復沖洗至中性，得到黃色的交聯殼聚糖凝膠微球； (3)多功能淀粉酶的固定化 配制0.1毫克/毫升的多功能淀粉酶的磷酸緩沖液溶液，再向該溶液中順次加入5.0%(w/v)的淀粉溶液和交聯殼聚糖凝膠微球，三者間的用量比例為(0.8~1.2)毫升:1毫升:0.1克；振蕩反應后用磷酸緩沖液洗滌已載有多功能淀粉酶的殼聚糖凝膠微球，從而得到由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶。
3.如權利要求2所述的一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶的制備方法，其特征在于:乙酸溶液的濃度為2.0% (v/v)0
4.如權利要求2所述的一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶的制備方法，其特征在于:振蕩反應是在15~35°C、160~200轉/分鐘條件下振蕩1.5~5.0小時。
5.如權利要求2所述的一種由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶的制備方法，其特征在于:戊二醛溶液的濃度為1.5~3.5% (v/v)0
6.權利要求1所述的由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶在制備功能性寡糖中的應用。
7.權利要求1所述的由殼聚糖凝膠微球制備的固定化多功能淀粉酶在制備保健品中的應用。
【文檔編號】C12N11/04GK103937774SQ201410149288
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月14日 優(yōu)先權日:2014年4月14日
【發(fā)明者】張應玖, 夏瑩 申請人:吉林大學