羅非魚sIgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了羅非魚sIgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白氨基酸序列、編碼基因、重組表達載體、重組表達載體的工程菌和羅非魚sIgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體的制備方法；本發(fā)明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表達了羅非魚sIgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM），分離純化方便、操作簡單、成本低廉、適合大規(guī)模擴大生產；產品經免疫新西蘭兔獲得了高效價、高特異性、高親和性抗抗體，可用于ELISA和Western-Blot的實驗要求。本發(fā)明兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體的制備與特性分析，為羅非魚病原菌和病毒的檢測、疫苗的研制、免疫水平檢測和免疫檢測方法的建立都提供了重要的材料，具有重要的生產價值和廣闊的應用前景。
【專利說明】羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體及其制備方 法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種通過原核表達來生產羅非魚SlgM截 短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體及其該抗體的制備方法。

【背景技術】
[0002] 羅非魚（Tilapia)是一種淡水魚類，屬于麗魚科（Cichlidae)，是非洲和中東特有 的魚種，具有雜食性、生長快、繁殖力強、適應性廣等優(yōu)點，現已經成為21世紀全球水產養(yǎng) 殖業(yè)最重要的養(yǎng)殖品種之一。中國的羅非魚養(yǎng)殖產量占世界的一半以上，每年羅非魚出口 額超過7億美元，出口量超過20多萬噸(折合活魚60多萬噸)。羅非魚具有極強的抗病能力， 曾被認為對細菌性、寄生蟲性、真菌性和病毒性疾病都具有比其它魚類更強的抵抗力。然而 近年來，研究發(fā)現羅非魚對某些細菌和寄生蟲病原都表現敏感，如鏈球菌、柱狀黃桿菌、嗜 水氣單胞菌、愛德華氏菌、小瓜蟲、車輪蟲、三代蟲等。
[0003] 免疫球蛋白是免疫系統(tǒng)中重要的組成成分，是病原診斷和疫苗評價的重要指標。 羅非魚 IgM 具有分泌型（Secretory form of IgM，sIgM)和膜結合型（Membrance-bound, mlgM)兩種形式，其重鏈（IgH)由相同基因編碼但編碼的恒定區(qū)不完全相同。分泌型IgM具 有4個恒定區(qū)，而膜結合型IgM則由3個恒定區(qū)和一個位于CH3下游的跨膜組成。slgM由 漿細胞產生分泌于血液和體液中，是機體進行體液免疫中的重要組成部分，在研究魚類病 害防治及免疫預防方面具有重要意義。目前，國內外關于抗羅非魚IgM抗體甚少，雖然國外 已有鼠抗羅非魚IgM的單克隆抗體，但價格十分昂貴且保質期短。此外，自制單克隆抗體不 僅技術要求高、實驗儀器高而且成本昂貴；而直接從羅非魚血清中提取IgM，不僅難以保證 純度，而且需要大量的血液，違背了動物福利。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種原核表達羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM)的 方法，采用該方法制備的dsIgM產量高、成本低、操作簡單、免疫原性好。
[0005] 為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 1、一種羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體，該蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 2、一種羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白的編碼基因，該編碼基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 3、一種含有編碼基因的重組表達載體。
[0009] 4、一種含有權利要求3中所述的重組表達載體的工程菌。
[0010] 5、羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：
[0011] (1)將該截短重鏈恒定區(qū)基因（dsIgM)與pET32a構建為表達載體 PET32a-dsIgM ;
[0012](2)將pET32a-dsIgM表達載體轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)，構建表達工程菌；
[0013] (3)發(fā)酵培養(yǎng)表達工程菌,進行IPTG誘導表達；
[0014] (4)發(fā)酵產物經親和層析得到純化的截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM);
[0015] (5)該dsIgM免疫新西蘭兔，收集血清，用飽和硫酸銨法純化兔抗dsIgM抗體；
[0016] (6)該兔抗dsIgM抗體作為Western-Blot -抗結合鯉魚、鯽魚、斑點叉尾鮰、羅非 魚血清，測定其特異性；
[0017] (7)該兔抗dsIgM抗體用于非競爭ELISA，檢測其親和常數。
[0018] 進一步的，所述步驟（1)包括：以羅非魚血液為材料提取總RNA，以mRNA為模版合 成第一條cDNA ;
[0019] 設計兩條引物：
[0020] Pl :5，-GGATCCGCCACTTCAACTGC-3'
[0021] P2 :5' -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3'
[0022] 其中下劃線為BamH I和xhol I酶切位點，以該cDNA為模版，通過PCR擴增得 到編碼SlgM的截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM)的DNA片段，測序確認后，通過雙酶切與質粒 pET32a連接，構建表達載體pET32a-dsIgM。
[0023] 進一步的，所述步驟（3)包括：采用LB培養(yǎng)基，37°C發(fā)酵培養(yǎng)表達工程菌至0D_達 到0. 6,加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導表達4h。
[0024] 進一步的，所述步驟（6)包括：采集鯉魚、鯽魚、斑點叉尾鮰、羅非魚血液進行 SDS-PAGE，運用Western-Blot檢測兔抗dsIgM抗體的特異性。
[0025] 進一步的，所述步驟（7)包括：用純化羅非魚血清作為抗原，按50li g/ml、25li g/ ml、12. g/ml、6. 25ii g/ml、3. 12ii g/ml、l. 56ii g/ml 和 0? 78ii g/ml 包被 ELISA板，將步驟 (5)中的兔抗 dsIgM 抗體按 1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、 1:25600、1:51200、1:102400、1:204800的比例倍比稀釋作為一抗，羊抗兔IgG-HRP作為二 抗，進行親和常數測定。
[0026] 本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明應用基因工程技術在原核宿主細胞中高效表 達了羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM)，分離純化方便、操作簡單、成本低廉、適合 大規(guī)模擴大生產。產品經免疫新西蘭兔獲得了高效價、高特異性、高親和性抗抗體，可用于 ELISA和Western-Blot的實驗要求。本發(fā)明兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體的制備與特性分 析，為羅非魚病原菌和病毒的檢測、疫苗的研制、免疫水平檢測和免疫檢測方法的建立都提 供了重要的材料，具有重要的生產價值和廣闊的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0028] 圖1是羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM)表達載體重組質粒 pET32a-dsIgM的構建示意圖；
[0029] 圖2是表達蛋白的SDS-PAGE圖，其中蛋白MarkerIII的分子量大小為94KDa，（由 上至下依次為94、60、45、27、18、）；1 :純化的dsIgM ;2 :pET32a誘導前對照；3 :pET32a誘導 后對照；4 :PET32a-dsIgM誘導前對照；5 :PET32a-dsIgM誘導后對照；
[0030] 圖3是免疫印跡分析兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體特異性，I =Marker ;2:鯉魚血 清；3 :鯽魚血清；4 :斑點叉尾鮰血清；5 :羅非魚血清；
[0031]圖4是兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體親和常數的測定，C=180(V(100X Iog2X)，Y軸 為OD值。

【具體實施方式】
[0032] 下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0033] 實施實例1
[0034] 本實施提供原核表達羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白（dsIgM)的方法，步驟如下 所示：
[0035] (1)采集羅非魚血液，采用總RNA提取試劑盒提取羅非魚RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit反轉錄試劑盒合成cDNA;
[0036](2)選擇slgM重鏈區(qū)域CH1-4核酸序列，利用Primer5. 0設計一對特異性引物， Pl :5' -GGATCCGCCACTTCAACTGC-3'，P2 :5' -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3'，上游引物包 含BamH I酶切位點，下游引物包含xholI酶切位點，該引物可擴增出slgM基因截短重鏈 基因（dsIgM)，片段大小為1338bp(序列如SEQ ID NO. 2所示）；
[0037] (3)回收dsIgM基因的PCR產物，構建pMD19-T_dsIgM載體，克隆dsIgM基因后構 建 PET32a-dsIgM，轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)(載體構建見圖1);
[0038] (4)含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)BL21-pET32a-dsIgM培養(yǎng)約3-4h至 菌液〇D_值達到0. 6,加入IPTG=L OmM，進行誘導表達，4h后離心收集菌體，取表達產物加 入5 ii L5XLoadingBuffer煮沸后取10 ii L進行SDS-PAGE電泳檢測（蛋白表達見圖2);
[0039] (5)菌體超聲破碎后，4°C，12000r/min離心lOmin，分別將表達蛋白可溶部分和包 涵體溶解液溶解部分用鎳離子柱親和層析純化，透析復性后，用核酸蛋白儀測定蛋白的濃 度為2. 19mg/ml，并將重組蛋白置-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 實施例2
[0041] 本實施提供兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體的制備方法，步驟如下所示：
[0042] (1)第一次免疫時，按Img/只SPF新西蘭兔的免疫劑量，取步驟（4)純化的羅非 魚dsIgM與弗式完全佐劑混合，充分乳化后在新西蘭兔足趾、脊部皮下進行多點注射免疫， 10-14天后進行第二次、第三次免疫，第二、三次免疫是將純化的dsIgM按2mg/只與等體積 不完全弗氏佐劑混合，充分乳化，在新西蘭兔背部皮下多點注射，每次注射間隔7天。第四 次是將純化的dsIgM按2mg/只直接耳緣靜脈注射；
[0043] (2)第四次免疫后3-4天，對免疫的新西蘭兔進行心臟采血，收集、純化得到兔抗 羅非魚dsIgM的多克隆抗體，濃度為I. 800mg/ml。
[0044] 實施例3
[0045] 本實施提供Western-Blot檢測兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體特異性的方法，步驟 如下所示：
[0046] (1)采集鯉魚、鯽魚、斑點叉尾鮰和羅非魚血液，血液于37 °C靜置4h后凝固， 5000r/min離心15min收集血清；
[0047] (2)上述血清運用12%濃度的凝膠進行SDS-PAGE，電泳分離后，轉移至PVDF膜 上，用3%BSA/TBST封閉，以本發(fā)明步驟（5)中兔抗dsIgM抗體為一抗I :1000稀釋后，4°C 孵育過夜；洗膜后，以羊抗兔IgG-HRP為二抗，37°C孵育Ih ;用DAB進行顯色lOmin，CldH2O 終止顯示反應。觀察Western-blot結果，判斷兔抗dsIgM多克隆抗體具有良好的特異性 (Western-Blot 見圖 3)。
[0048] 實施例4
[0049] 本實施提供兔抗羅非魚dsIgM多克隆抗體親和常數的測定方法，步驟如下所示：
[0050] (1)收集羅非魚血清，用親硫樹脂純化羅非魚IgM，用核酸蛋白儀測定IgM濃度；
[0051] (2)將純化的羅非魚血清用碳酸鹽緩沖液稀釋至50 ii g/ml、25ug/ml、12. 5 ii g/ml、 6. 25 ii g/ml、3. 12 ii g/ml、I. 56 ii g/ml 和 0? 78 ii g/ml，100 ii L/孔加入到 96 孔聚苯乙烯酶聯 反應板中，4°C包被過夜；
[0052] (3)用 PBST 洗滌包被板后，分別按 I :100、1 :200、1 :400…I :6400…I :28400 的比 例倍比稀釋本發(fā)明步驟（5)中兔抗dsIgM多克隆抗體，按100 y L/孔加入上述96孔板；
[0053] (4)用PBST洗滌包被板后，加入I:2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，IOOiiL/孔，37°C 作用30min ;
[0054] (5)用PBST洗滌包被板后，加入TMB底物顯色液，IOOii L/孔，室溫避光反應 15min。加入2MH2S04終止反應，100 ii L/孔，置酶標儀上測定每孔的OD45tlnm值。
[0055] (6)運用EXCEL軟件，以Iog2 (0.18/C)為X軸，OD45tlnm值為Y軸，擬合結合反應曲 線模型(擬合曲線見圖4)。
[0056](7)按照親和常數Kaff=(n-l)/2(n[Ab']t_[Ab]t)計算抗體相對親和常數。式中， n=[Ag]t/[Ag' ]t，其中[Ag]dP [Ag' 1為酶標板上每孔的固定化抗原濃度，[AbiUP [Ab' ] t為相應固化抗原濃度時最大吸光值一半（0D50和0D50'）時所對應的可測量抗體濃度。得 出親和常數 kaff=l. 179X 108L/mol。
[0057] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0058] SEQUENCELISTING <110>四川農業(yè)大學 <120〉羅非魚SlgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體及其制備方法<130〉權利要求丨5、說明書 <160 4 <170> PatentIn version 3.5 <210>1 <211〉 442 <212> PRT <213> SEQ ID NO. 1 <400> 1 Ala Thr Ser Thr Ala Pro Thr Val Phe Pro Leu Val Pro Cys Ser Thr 15 10 15 Glu Ser Gly Asp Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr Gly Phe Asn 20 25 30 Pro Pro Ala Val Thr Phe Ser Trp Thr Lys Gly Gly Ala Ala Leu Thr 35 40 45 Asp Phe lie Gln Tyr Pro Ser Val Gln Lys Gly Asn Val Tyr Thr Gly 50 55 tiO Val Ser Gln Yal Gln Val Arg Lys Gln Asp Trp Asp Thr Arg Gln Asn 65 70 75 30 Val Gln Cys Val Val Asn His Ala Ala Gly Asn Ala Gln Thr Pro He 8b 90 95 Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe I.ys Gln Asn Pro Thr Leu Lys Ala Phe
[0059] ioo 105 no Ser Ser Ser Ser Asp Glu Asp Arg Thr Tyr Thr Ala Ser Cys Phe Ala 115 120 125 Lys Glu Phe Ala Pro Lys Asn His Asn Leu Lys Trp Leu Lys Asn Gly 130 135 140 Ala Asp lie Thr Asp Lys He Asp Leu Thr Glu Thr Val Tyr Glu Ser 145 150 15b 160 Lys Asn Ala Ala Gly Lys Thr Val Tyr Asn Ala Val Ser Phe Leu Thr Ibo 170 175 Val Asn Ser Thr Gly Leu Lys Glu Lys Thr He Phe Met Cys Leu Phe 180 185 iyu Thr Gly Gly Glu Asp Ala Ser Leu Asn Lys Thr Val Ala Tyr Lys Asp 195 200 205 Asn Thr Pro Asp Pro Lys Pro Cys Ser Ser Ser Asp Val Lys Ala Leu 210 215 220 He Phe Gly Pro Thr Thr Lys Asp Met Leu Phe Asn Lys Lys Gly Thr 225 230 235 240 lie Thr Cys Lys Val Met Ala Glu Asn Lys Lys Leu Asn lie Thr Trp 245 250 255 Glu Asp Glu Glu Gly Asn Asp Met Ala Ser Lys Pro He Thr Pro Ala 260 265 270 Asn Gly Met Gln Asn Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Asp lie Thr Tyr Asp 275 280 285 Giu Trp Thr Arg Gly Vai Lys Arg Phe Cys Val Va丄His His Gln Asp 290 295 300
[0060] Leu ile Glu Pro Leu Arg Giu Pro Tyr Glu Axg Asp Phe Gly Gly Asn 305 310 315 320 Pro Gln Arg Pro Ser Val Phe Met Leu Pro Pro Leu Glu Gln Thr Asn 325 330 335 Lys Ala Glti Val Thr Leu Thr Cys Phe Vai Lys Asp Phe Phe Pro Lys 340 345 3b0 Glu Val Phe Val Ser Trp Leu Val Asp Asp Glu Glu Ala Asp vSer Ser 355 360 365 Tyr Ala Phe Asn Thr Thr Glu Pro He Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Ser 370 375 380 Ala Tyr Gly Gln Leu Phe Val Ser Leu His Gln Trp Gln Arg Asp Asp 385 390 395 400 Ala Val Tyr Ser Cys Val Val Tyr His Glu Ser Val Val Asn Thr Thr 405 410 415 Arg Ala He Val Arg Ser He Gly Tyr Arg Thr Phe Asp Lys Asn Arg 420 425 430 He Asp Leu Asn Met Asn He Asn Gln Asp 435 440 <210>2 <211〉 1326 <212> DM <213〉SEQ ID NO. 2 <400〉 2 gccacttcaa ctgoaccoac tgtgtttcot otggtaocat gtagoactga gagcggagat 60
[0061] atggtcaoto ttggctgcct tgccactggc ttta,a.cnctx ctgcagtgac tttctcgtgg 120 accaaaggcg gcgctgcctt gacagatttc atccagtacc cttoagtaca gaaaggcaat 18U gtttatactg gagtcagtca agtccaagtg aggaaacagg actgggatac acgacagaat 240 gtccaatgtg ttgtgaatca cgctgctggg aatgcacaga ctcctatccc accaccacca 300 ccgccattta agcagaatcc aactcttaaa gcgttttcct cctcttctga tgaggaccgt 360 acctatactg cctcctgctt tgccaaagag tttgcaccaa agaaccataa cttaaaatgg 420 ctgaaaaatg gagcagacat caccgacaaa atagatctga ccgaaacagt ttatgaatca 480 aaaaatgcgg ctggaaaaac agtgtacaat gcagtaagtt ttctcacagt aaattccact 540 ggcctgaaag agaagactat atttatgtgt ctctttaccg gaggagaaga tgcatctttg 600 aacaaaactg tggcttacaa agacaatacg ccagatccta aaccatgtag ttcgtcagat 660 gtgaaggcac taatttttgg ccccacaacc aaggacatgc ttttcaataa aaaaggaact 720 ataacatgta aagtcatggc ggaaaataaa aaactcaata taacttggga agatgaggaa 780 ggaaatgaca tggcgagtaa gccaataaca ccagccaatg gcatgcagaa cgcatacaaa 840 tctgaacttg acatcaccta tgatgaatgg accagggggg taaaacgctt ctgtgttgtt 900 caccaccaag acttgattga gcctttgagg gaaccttatg aaagggattt cggaggaaac 960 cctcagcgcc cgtcagtgtt tatgctccct cctttagaac aaactaacaa agcagaggtg 1020 accctgactt gctttgtgaa agacttcttc cctaaggagg tttttgtgtc ttggcttgtg 1080 gatgacgagg aagcagactc aagttatgct tttaatacca cagaacccat tgaaaacaat 1140 ggattctatt ctgcttatgg ccagttattt gtcagccttc accagtggca aagggatgat 1200 gctgtctata gctgtgtagt gtaccatgaa tctgtggtta acacaactag agctattgtc 1260 aggtccattg ggtacagaac atttgacaaa aaccgcattg acctcaacat gaacatcaac 1320 caagac 1326 <210> 3 <211〉 20[0062] <212> DNA <213〉引物 Pl <400〉 3 ggatccgcca cttcaactgc 20 <210> 4<211〉 22 <212〉 DNA <213〉引物 P2 <400> 4 ctcgaggtct tggttgatgt tc 22
【權利要求】
1. 一種羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體，其特征在于，該蛋白氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -種羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白的編碼基因，其特征在于，該編碼基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3. -種含有編碼基因的重組表達載體。
4. 一種含有權利要求3中所述的重組表達載體的工程菌。
5. 羅非魚slgM截短重鏈恒定區(qū)蛋白多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 將該截短重鏈恒定區(qū)基因與pET32a構建為表達載體PET32a-dsIgM ; (2) 將pET32a-dsIgM表達載體轉化入大腸桿菌BL21，構建表達工程菌； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)表達工程菌，進行IPTG誘導表達； (4) 發(fā)酵產物經親和層析得到純化的截短重鏈恒定區(qū)蛋白； (5) 該dsIgM免疫新西蘭兔，收集血清，用飽和硫酸銨法純化兔抗dsIgM抗體； (6) 該兔抗dsIgM抗體作為Western-Blot -抗結合鯉魚、鯽魚、斑點叉尾鮰、羅非魚血 清，測定其特異性； (7) 該兔抗dsIgM抗體用于非競爭ELISA，檢測其親和常數。
6. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)包括：以羅非魚血液為材 料提取總RNA，以mRNA為模版合成第一條cDNA ; 設計兩條引物： PI ：5/ -GGATCCGCCACTTCAACTGC-3' P2 ：5/ -CTCGAGGTCTTGGTTGATGTTC-3' 其中下劃線為BamH I和xhol I酶切位點，以該cDNA為模版，通過PCR擴增得到編碼 slgM的截短重鏈恒定區(qū)蛋白的DNA片段，測序確認后，通過雙酶切與質粒pET32a連接，構建 表達載體 pET32a_dsIgM。
7. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（3)包括：采用LB培養(yǎng)基， 37°C發(fā)酵培養(yǎng)表達工程菌至0D_達到0. 6,加入終濃度為lmmol/L的IPTG，37°C誘導表達 4h。
8. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（6)包括：采集鯉魚、鯽魚、斑 點叉尾鮰、羅非魚血液進行SDS-PAGE，運用Western-Blot檢測兔抗dsIgM抗體的特異性。
9. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（7)包括：用純化羅非魚血 清作為抗原，按 50 μ g/ml、25 μ g/ml、12. 5 μ g/ml、6. 25 μ g/ml、3. 12 μ g/ml、1. 56 μ g/ml 和 0. 78μ g/ml 包被 ELISA 板，將步驟（5)中的兔抗 dsIgM 抗體按 1:100、1:200、1:400、1:800、 1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 的比例倍比稀釋 作為一抗，羊抗兔IgG-HRP作為二抗,進行親和常數測定。
【文檔編號】C12N15/70GK104262485SQ201410149405
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】汪開毓, 賀揚, 陳德芳, 楊倩, 耿毅, 王二龍 申請人:四川農業(yè)大學