一種fgf-21突變體蛋白的制備及其在治療非酒精性脂肪肝中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種FGF-21突變體蛋白的制備及其在治療非酒精性脂肪肝中的應(yīng)用。本發(fā)明成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：2所示，其編碼基因序列為SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明在獲得了FGF-21突變體基因后，在宿主細(xì)胞中高效可溶性地表達(dá)了FGF-21突變體蛋白，經(jīng)過一系列的蛋白純化步驟獲得了FGF-21突變體蛋白。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的FGF-21突變體能夠更加有效降低非酒精性脂肪肝模型動(dòng)物體內(nèi)的血脂水平，改善肝臟內(nèi)脂肪堆積且能顯著改善肝臟功能。本發(fā)明的FGF-21突變體可用于制備非酒精性脂肪肝藥物。
【專利說明】一種FGF-21突變體蛋白的制備及其在治療非酒精性脂肪肝中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長因子-21(FGF-21)基因突變，涉及FGF-21突變體蛋白的制備，還涉及該FGF-21突變體在制備治療非酒精性脂肪肝疾病藥物中的應(yīng)用，屬于成纖維細(xì)胞生長因子-21突變蛋白領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著人們的生活水平不斷提高，飲食習(xí)慣逐漸發(fā)生不合理的改變，非酒精性脂肪肝(nonalcohol ic fat ty liver di sease, NAFLD)的發(fā)生率日漸增高,約在10% -20%左右。近年來總結(jié)NAFLD的轉(zhuǎn)歸發(fā)現(xiàn)，50%發(fā)展為肝纖維化，15%發(fā)展為肝硬化，3%發(fā)展為肝衰竭或者需要進(jìn)行肝移植。而NAFLD又與目前所共認(rèn)的糖尿病，高血壓，高脂血癥，腹型肥胖等代謝綜合征(MS)共同伴隨。NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝臟脂肪累積、胰島素抵抗起關(guān)鍵作用，反過來，肝臟脂肪變性又加重胰島素抵抗。因此，有學(xué)者認(rèn)為肥胖特別是中心性肥胖和胰島素抵抗是發(fā)生NAFLD的危險(xiǎn)因素。
[0003]成纖維細(xì)胞生長因子-21 (fibrobla st growth factor21, FGF-21)是近期發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)又一個(gè)代謝調(diào)節(jié)因子，屬于成纖維細(xì)胞生長因子家族，其特異性作用于肝臟、脂肪、胰島細(xì)胞且不依賴于胰島素有效安全地調(diào)節(jié)血糖血脂的能力深得研究人員青睞。最新流行病學(xué)研究表明，F(xiàn)GF-21與非酒精性脂肪肝(NAFLD)密切相關(guān)，在健康受試者和NAFLD受試者中，血清FGF-21水平不僅與身高體重比(BMI)呈正相關(guān)，并與長時(shí)禁食相關(guān)。Li等的研究表明，NAFLD患者的血清FGF-21水平顯著高于健康人，并與肝臟甘油三酯水平相關(guān)。除此之外，本實(shí)驗(yàn)室在動(dòng)物 模型中發(fā)現(xiàn)FGF-21可以有效改善胰島素抵抗，降低血清胰島素濃度，顯著降低血清中甘油三脂、膽固醇以及低密度脂蛋白的含量，顯示其具有治療NAFLD的潛能，近期美國禮萊公司針對(duì)FGF-21的臨床結(jié)果也同樣顯示其顯著的降脂效果，更進(jìn)一步說明FGF-21有望成為治療非酒精性脂肪肝的新型藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)突變體及其編碼基因；
[0005]本發(fā)明的目的之二是提供含有成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)突變體基因的重組原核表達(dá)載體，以及含有該重組原核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；
[0006]本發(fā)明的目的之三是提供制備上述成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)突變體的方法；
[0007]本發(fā)明的目的之四是將該成纖維細(xì)胞生長因子-21 (FGF-21)突變體應(yīng)用于制備成治療非酒精性脂肪肝的藥物或藥物組合物。
[0008]本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0009]一種FGF-21突變體，其分子量約為20ku，其氨基酸序列為SEQ ID NO:2所示；編碼該FGF-21突變體的核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。
[0010]獲得本發(fā)明所述的FGF-21突變體的方法，包括如下步驟:從正常人肝臟中提取RNA，并以此為模板逆轉(zhuǎn)錄獲得編碼FGF-21的基因，以此為模板，通過over lap PCR獲得FGF-21突變體基因，將所獲得的FGF-21突變體基因連接到原核表達(dá)載體中；將所述重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)、純化。
[0011]含有FGF-21突變體核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體以及含有該重組原核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選的，可以將FGF-21突變體核苷酸序列與攜帶分子伴侶的原核表達(dá)載體相連接。其中，所述的分子伴侶優(yōu)選為小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)。
[0012]本發(fā)明還提供了一種制備FGF-21突變體的方法，包括:將攜帶FGF-21突變體核苷酸序列的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中；誘導(dǎo)表達(dá)FGF-21突變體融合蛋白，分離純化FGF-21突變體融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除與FGF-21突變體融合表達(dá)的分子伴侶部分，純化，即得。
[0013]優(yōu)選的，所述的原核表達(dá)載體為pSUMO (Cat.N0.1005,1006, Life Sensors),所述的宿主細(xì)胞為TransB(DE3)(北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào):CD811);所述的分子伴侶優(yōu)選為小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO);其中，所述的純化包括:將融合蛋白進(jìn)行樹脂親和層析，依次經(jīng)洗滌、洗脫、脫鹽；純化的融合蛋白酶切后進(jìn)行樹脂親和層析，即得。[0014]優(yōu)選的，對(duì)于蛋白純化，所述的親和層析樹脂為HisTrapTM FF crude colum ;所述的雜蛋白洗脫液包括:45mmol / L 咪唑，500mmol / L NaCl, 55mmol / L Na3PO4, ρΗ7.4 ;所述的洗脫液包括:550mmol / L 咪唑，500mmol / L NaCl,55mmol / L Na3PO4,ρΗ7.4 ;所述的脫鹽采用 HiPr印ΤΜ26 / IODesaltingo
[0015]pSUMO和大腸桿菌TransB (DE3)都可通過商業(yè)途徑購買得到。
[0016]本發(fā)明在獲得了 FGF-21突變體基因后，與原核表達(dá)載體pSUMO重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，經(jīng)過一系列的蛋白純化步驟后獲得了 FGF-21突變體蛋白，并對(duì)純化后的FGF-21突變體進(jìn)行活性檢測。
[0017]本發(fā)明所制備的FGF-21突變體是通過MSG模型鼠來檢測其治療NAFLD效果的。動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型FGF-21相比，本發(fā)明FGF-21突變體能夠更加有效降低非酒精性脂肪肝模型動(dòng)物體內(nèi)的血脂水平，改善肝臟內(nèi)脂肪堆積且能顯著改善肝臟功能。本發(fā)明的FGF-21突變體可作為藥物治療非酒精性脂肪肝。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1FGF-21突變體蛋白純化
[0019]1.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；2.未純化的FGF-21突變體融合蛋白；3.純化的FGF-21突變體融合蛋白；4.FGF-21突變體融合蛋白酶切產(chǎn)物；5.純化的FGF-21突變體蛋白
[0020]圖2HPLC分析FGF-21突變體蛋白
[0021 ] 經(jīng)過HPLC分析，在大約16min處出現(xiàn)FGF-21突變體蛋白峰，且其純度可達(dá)95 %以上。
[0022]圖31-5周各實(shí)驗(yàn)組體重變化
[0023]治療組體重相對(duì)于生理鹽水組體重顯著下降，且從治療第三周開始，F(xiàn)GF-21突變體治療組體重較野生型FGF-21治療組體重下降更多(差異顯著)，與正常組無明顯差異，與模型組差異極顯著。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P < 0.01vs生理鹽水組，#P < 0.05，##P < 0.01vs 野生型 FGF-21。
[0024]圖 40GTT
[0025]口服葡萄糖后30min，生理鹽水組小鼠血糖迅速上升至最高達(dá)到(14.7±0.49)mmol.L-1，而正常對(duì)照組小鼠血糖為(10.7±0.49)mmol.L-1。FGF-21突變體治療組小鼠血糖上升幅度顯著低于生理鹽水組為(11.6±0.64)mmol.L-10此外，F(xiàn)GF-21突變體治療組血糖下降速度明顯快于野生型FGF-21治療組。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P< 0.01vs生理鹽水組。[0026]圖5-9停藥后，各實(shí)驗(yàn)組肝臟脂代謝關(guān)鍵基因表達(dá)變化
[0027]FGF-21突變體顯著降低？八540:140:2基因表達(dá)水平，顯著升高0)1^、此?-1基因表達(dá)水平，且顯著優(yōu)于野生型FGF-21治療組。注:n=8，mean土SEM.*P < 0.05，**P < 0.01vs生理鹽水組，#P < 0.05，##P < 0.01vs 野生型 FGF-21。
[0028]圖10停藥后，各實(shí)驗(yàn)組肝臟HE染色結(jié)果對(duì)比
[0029]在光學(xué)顯微鏡下，生理鹽水組肝細(xì)胞腫脹，胞漿可見大量空泡，以肝小葉中央?yún)^(qū)為重，空泡大小不等，以大為主；FGF-21突變體治療組肝細(xì)胞漿內(nèi)可見較小的脂肪空泡，數(shù)量比較少；野生型FGF-21治療組肝細(xì)胞內(nèi)可見較小的脂肪空泡，但數(shù)量較多。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0031]說明:本發(fā)明中涉及的基因的設(shè)計(jì)、合成、突變和克隆，原核表達(dá)載體的構(gòu)建，核酸提取及序列分析及鑒定，以及表達(dá)產(chǎn)物的分離和純化等操作步驟，可按照本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行(參見CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0032]實(shí)施例1FGF-21突變體基因的克隆
[0033]1、FGF-21 cDNA 的獲得
[0034]Trizol提取人肝臟總RNA，以總RNA為模板，Oligo (dT) 15為引物，參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行cDNA第一條鏈合成。
[0035]2、PCR方法擴(kuò)增FGF-21基因
[0036]根據(jù)FGF-21基因去除信號(hào)肽的核苷酸序列，設(shè)計(jì)引物，通過互補(bǔ)延伸的方法獲得去除信號(hào)肽的FGF-21基因。利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)FGF-21基因克隆引物(Pl和P2)。
[0037]循環(huán)參數(shù)為:95°C預(yù)變性5min，95°C 30s，56°C 30s，72°C 45s的順序，15個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸 lOmin。
[0038]3、overlap PCR 獲得 FGF_21 突變基因
[0039]利用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)FGF-21突變引物(P3、P4和P5)。以P3和P4為引物，F(xiàn)GF-21基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物I ;以P2和P5為引物，F(xiàn)GF-21基因?yàn)槟０?，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物2 ;以P3和P2為引物，PCR產(chǎn)物I和PCR產(chǎn)物2混合物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得FGF-21突變基因。
[0040]循環(huán)參數(shù)為:941:預(yù)變性51^11，941: 30s, 58°C 40s，72°C 50s的順序，12個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸 lOmin。
[0041]表1克隆FGF-21突變體基因的引物
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體，其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID N0:2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示。
3.含有權(quán)利要求2所述成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體基因的原核表達(dá)載體。
4.含有權(quán)利要求3所述原核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞TransB(DE3)。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體的方法，包括:將編碼成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體核苷酸序列與原核表達(dá)載體相連接，得到重組原核表達(dá)載體；載體本身攜帶分子伴侶SUMO，連接后形成SUMO與成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體連接而成的融合基因；將該重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞TransB(DE3)中；誘導(dǎo)表達(dá)成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體融合蛋白，分離純化該融合蛋白，利用SUMO蛋白酶切除與其融合表達(dá)的分子伴侶部分，純化，即得。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述的原核表達(dá)載體為pSUMO;所述的宿主細(xì)胞為TransB(DE3);所述的分子伴侶為小分子泛素樣修飾蛋白。
7.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述的成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體核苷酸序列為SEQ ID NO:1所示；成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體氨基酸序列為SEQ IDNO:2所示。
8.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的純化包括:成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體融合蛋白進(jìn)行樹脂親和層析，依次經(jīng)過洗滌、洗脫、脫鹽；將酶切后的蛋白進(jìn)行樹脂親和層析，即得。
9.一種治療非酒精性脂肪肝的藥物組合物，包括:治療上有效的權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體和藥學(xué)上可接受的載體或輔料。
10.權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子-21突變體在制備治療非酒精性脂肪肝藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103923207SQ201410150150
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】任桂萍, 朱升龍, 李德山, 王文飛, 劉銘瑤, 葉賢龍 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)