一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，該技術(shù)通過在目的原始菌基因A與其相鄰基因B間插入基因片段C，插入的基因片段的插入位點在目的基因A和其相鄰基因B的啟動子間，且不影響2個基因的表達再以質(zhì)粒為載體，經(jīng)雙酶切及連接后轉(zhuǎn)化將上述的兩個片段和基因片段C連接獲得一個新的質(zhì)粒，最后將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原始菌。實現(xiàn)在原始菌內(nèi)直接對目的基因進行點突變，且不改變基因的生存環(huán)境，不影響基因的表達。
【專利說明】—種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物領(lǐng)域，尤其一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]基因點突變(Gene Point Mutation)為DNA鏈中I個或I對堿基發(fā)生改變，包括堿基置換(轉(zhuǎn)換、顛換)和移碼突變(丟失或插人I個或幾個堿基)?；螯c突變是導(dǎo)致細菌性狀改變的重要因素之一，如基因點突變導(dǎo)致抗生素靶位酶的變異，從而導(dǎo)致細菌產(chǎn)生抗生素耐藥。如:(1)細菌喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDRs)編碼靶酶的基因點突變，導(dǎo)致藥物作用靶位的改變，降低喹諾酮類藥物的親和力而耐藥。(2)淋球菌mtrR基因第45位Gly (GGC — GAC) Asp、14 位 His (CAC — CGC) Arg 和第 51 位 Phe (TTC — GTC) Val 突變與淋球菌流行株的多重耐藥性密切相關(guān)。(3) 23SrRNA基因A2143G點突變與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥相關(guān)。(4)rpsL基因的點突變分別與結(jié)核分枝桿菌對利福平、乙氨丁醇、異煙肼和鏈霉素耐藥性密切 相關(guān)。
[0003]目前對基因點突變的研究主要是采用測序、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，PCR-SSCP(單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析，Single-Strand Conformation Polymorphism)等方法進行基因點突變測定，通過攜帶與不攜帶基因點突變菌株目的性狀的比較分析，來認定基因點突變的作用機制。然而，這種方法只能通過基因點突變菌株和未點突變菌株之間的性狀比較，來推測基因點突變與性狀相關(guān)，不能直觀的研究基因點突變的結(jié)果。此外，也有報道，在蛋白質(zhì)功能研究中，采用點突變試劑盒構(gòu)建點突變基因，用以研究基因點突變前后蛋白質(zhì)功能的變化來研究基因點突變的功能。然而細菌的性狀如耐藥程度是多基因、多蛋白參與的復(fù)雜過程，而這種方法局限于個別基因及蛋白，難以解釋基因點突變在細菌內(nèi)部環(huán)境中導(dǎo)致的全部現(xiàn)象。所以，研究基因點突變功能的理想方法是:在原始菌中直接對目的基因進行點突變，而不改變基因的生存環(huán)境，但目前還沒有一種理想的技術(shù)對細菌進行基因點突變。
[0004]同源重組(Homologus Recombination)是指發(fā)生在姐妹染色單體之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，它也是基因敲除的方法之一。目前有采用“上游片段-插入基因-下游片段”的方式使靶基因失活。同源重組原理理論上也能被應(yīng)用到構(gòu)建基因點突變菌株中。但關(guān)鍵是同源重組至原始菌的片段，除攜帶基因點突變外，不能斷開任何基因且不影響基因(含目的基因)表達。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，實現(xiàn)在原始菌內(nèi)直接對目的基因進行點突變，且不改變基因的生存環(huán)境，不影響基因的表達。
[0006]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0007]—種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，在目的原始菌基因A與其相鄰基因B間插入基因片段C，插入的基因片段的插入位點在目的基因A和其相鄰基因B的啟動子間，且不影響2個基因的表達；然后采用PCR方法擴增2個片段，其中一個片段為:目的基因內(nèi)部A開始到目的基因A啟動子與B基因啟動子之間的上游片段；另一片段為:A基因啟動子與B基因啟動子之間的開始到B基因內(nèi)部的下游片段；再以質(zhì)粒為載體，經(jīng)雙酶切及連接后轉(zhuǎn)化將上述的兩個片段和基因片段C連接獲得一個新的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含“上游片段-基因片段C-下游片段”;最后將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原始菌。
[0008]本發(fā)明包括如下步驟:
[0009](I)克隆載體及菌株的選取:選取合適的質(zhì)粒載體，確認其酶切位點，選擇合適菌株作為克隆圃；
[0010](2)插入基因片段的選擇；
[0011](3)上游片段及下游片段的制備:針對目的基因點突變位置和插入基因片段位置及相鄰基因設(shè)計引物；每條上、下游引物添加相應(yīng)的酶切位點和保護堿基，且上游片段的下游引物和下游片段的上游引物為堿基序列互補，引物位置在目的基因與其相鄰基因的啟動子間；
[0012](4)同源重組后基因點突變菌株的制備:上游片段、插入基因片段、下游片段分別經(jīng)3次雙酶切及連 接后轉(zhuǎn)化至克隆菌，獲得兩端含原始菌基因片段、中間為抗生素篩選基因的質(zhì)粒。
[0013]所述的原始菌為福氏志賀菌、大腸桿菌、沙門菌、霍亂菌或空腸彎曲菌等。
[0014]所述的插入基因片段為抗生素篩選基因。
[0015]本發(fā)明一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，實現(xiàn)在原始菌內(nèi)直接對目的基因進行點突變，且不改變基因的生存環(huán)境，不影響基因的表達。細菌基因點突變是導(dǎo)致細菌性狀改變的重要因素之一。本發(fā)明提供了一種細菌基因點突變的分子克隆技術(shù)，所述的技術(shù)通過福氏志賀菌的gyrA基因點突變進行驗證并獲得成功，該技術(shù)可推廣應(yīng)用到別的細菌如大腸桿菌、沙門菌、霍亂、空腸彎曲菌等細菌。該技術(shù)用10天左右時間可在實驗室構(gòu)建一個基因點突變菌株，可在實驗室推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:構(gòu)建gyrA基因點突變不意圖；(A).卡那霉素耐藥基因插入的位點，箭頭表示引物的位置(gyrAFl (Fl)，gyrARl (Rl)，gyrAF2 (F2)，gyrAR2 (R2)) ； (B) gyrA 基因突變點的序列。
【具體實施方式】
[0017]下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但本發(fā)明并不為實施例所限制。
[0018]實施例1:細菌性痢疾是一種嚴重的腸道傳染性疾病，流行范圍廣、傳播速度快、發(fā)病率高，全球每年發(fā)病約1.65億，其中1.63億發(fā)生在發(fā)展中國家，每年死亡100萬人。志賀菌是細菌性痢疾的病原菌，氟喹諾酮類藥物(以環(huán)丙沙星為代表)是世界衛(wèi)生組織(WH0，2004)推薦治療細菌性痢疾的首選藥物。但志賀菌氟喹諾酮耐藥呈加重趨勢，現(xiàn)有研究表明福氏志賀菌喹諾酮類藥物耐藥與gyrA Ser-83 — Leu (TCG — TTG)突變的密切相關(guān)，與87位點的基因點突變也有一定關(guān)系，但志賀菌gyrA Ser-83 — Leu及87位點的基因點突變直接導(dǎo)致其對環(huán)丙沙星MIC多大變化還沒定論。所以本研究室通過構(gòu)建基因點突變(gyrA基因的83位點TCG — TTG, 87位點GAC — GGC)菌株，以研究2個位點的基因點突變對氟喹諾耐藥的影響，具體如下:
[0019]人工構(gòu)建福氏志賀菌2a301的gyrA基因點突變菌株。采用抗生素篩選同源重組的方法構(gòu)建福氏志賀菌2a301的gyrA基因點突變菌株，卡那霉素耐藥基因盒插入gyrA基因與它的下游基因(UbiG)間，引物及耐藥基因盒插入位點如圖1所示，操作方法如下(完成5個階段的時間約為10天):
[0020]1.下游片段轉(zhuǎn)入質(zhì)粒。以福氏志賀菌2a301為模板，以表2中引物gyrAF2和gyrAR2擴增出PCR產(chǎn)物片段(792bp，下游引物);下游片段與質(zhì)粒pUC19經(jīng)KpnI和EcoRI雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，產(chǎn)生菌株P(guān)UC19:gyrAF2R2，經(jīng)PCR擴增后證實。
[0021]2.抗生素篩選基因轉(zhuǎn)入質(zhì)粒，并與下游片段相連。以KanF及KanR引物擴增aphA3基因(卡那霉素耐藥篩選基因)，提取PUC19:gyrAF2R2質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒以KpnI和XbaI雙酶切后，連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，以含卡那霉素的LB培養(yǎng)基進行篩選，產(chǎn)生pUC19:gyrAF2R2:Kan菌株，經(jīng)PCR擴增后證實。
[0022]3.上游片段-抗生素篩選基因-下游片段相連接。菌株I和菌株13 (見表1)為杭州市氟喹諾耐藥志賀菌分離株，其中菌株13的gyrA基因的83位點((TCG — TTG，絲氨酸—亮氨酸)；菌株I除83位點外，在87位點上也有突變(GAC — GGC，天冬氨酸一甘氨酸)。①以gyrAFl和gyrARl為引物，分別以福氏2a301、菌株1、菌株13等3個菌株為PCR模板，擴增獲得3種上游片段。②提取pUC19:gyrAF2R2:Kan質(zhì)粒，質(zhì)粒及以上的3種上游片段經(jīng)XbaI及PstI雙酶切連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，以含卡那霉素50 μ g ml_l及含氨芐西林IOOyg ml-?的平板進行篩選。③按以上的3種上游片段克隆獲得3種類型的菌株，分別為pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl- 301 (上游片段以福氏 2a:301 為模板)、pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl-1 (上游片段以菌株 I 為模板)、pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl_13 (上游片段以菌株13為模板)。
[0023]4.“上游片段-抗生素篩選基因-下游片段”同源重組至原始菌，獲得基因點突變株。①以菌株pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl_301/l/13 為模板，以 gyrARl 及 gyrAR2 為引物，擴增出2560bpPCR片段。②純化后電轉(zhuǎn)化至福氏志賀菌2a301中，以含卡那霉素50 μ gml-1的LB平板篩選同源重組子，其中以pUC19:gyrAF2R2:Kan:gyrAFlRl-301為模板的獲得的菌株為Kan301 (不含基因點突變的篩選抗生素耐藥對照株);以菌株I和13為模板獲得的菌株為Kan301:83Leu87Gly和Kan301:83Leu(含基因點突變的篩選抗生素耐藥突變株)。③經(jīng)PCR擴增測序后證實上述突變株。
[0024]5.對基因點突變菌株進行目的性狀的研究。通過以上步驟獲得I個原始菌、I個對照株和2個基因點突變株等4個菌株，具體為:S.flexneri2a301 (原始菌)，Kan301 (不含基因點突變的篩選抗生素耐藥，對照株)，Kan301:83Leu (含83位點基因點突變的篩選抗生素耐藥突變株I)，Kan301:83Leu87Gly (含83和87雙位點基因點突變的篩選抗生素耐藥突變株2)。
[0025]采用常量肉湯稀釋法，測定上述4類菌株對氟喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果表明:S.flexneri2a301(原始菌)和Kan301菌株(對照株)對環(huán)丙沙星的MIC都為0.03125 μ gmL—1。我們認為在gyrA和ubiG基因間插入卡那霉素篩選抗生素基因，對目的性狀(即對環(huán)丙沙星的MIC)不影響。而Kan301:83Leu(突變株I)和Kan301:83Leu87Gly菌株(突變株2)對環(huán)丙沙星的MIC都為0.125 μ gmL-1，是
S.flexneri2a301 (原始菌)和Kan301菌株(對照株)MIC的4倍。
[0026]基于以上結(jié)果，得出結(jié)論:①在福氏志賀菌gyrA基因83位點的點突變直接導(dǎo)致菌株對環(huán)丙沙星的MIC從0.03125 μ gmL—1上升至0.125 μ g mL'②gyrA基因87位點的是否點突變，不直接影響gyrA基因83位點的點突變對MIC的影響。
[0027]表1本研究中所用到的菌株
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，其特征在于在目的原始菌基因A與其相鄰基因B間插入基因片段C，插入的基因片段的插入位點在目的基因A和其相鄰基因B的啟動子間，且不影響2個基因的表達；然后采用PCR方法擴增2個片段，其中一個片段為:目的基因內(nèi)部A開始到目的基因A啟動子與B基因啟動子之間的上游片段；另一片段為:A基因啟動子與B基因啟動子之間的開始到B基因內(nèi)部的下游片段；再以質(zhì)粒為載體，經(jīng)雙酶切及連接后轉(zhuǎn)化將上述的兩個片段和基因片段C連接獲得一個新的質(zhì)粒，該質(zhì)粒含“上游片段-基因片段C-下游片段”;最后將新的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至原始菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，其特征在于包括如下步驟: (1)克隆載體及 菌株的選取:選取合適的質(zhì)粒載體，確認其酶切位點，選擇合適菌株作為克隆囷； (2)插入基因片段的選擇； (3)上游片段及下游片段的制備:針對目的基因點突變位置和插入基因片段位置及相鄰基因設(shè)計引物；每條上、下游引物添加相應(yīng)的酶切位點和保護堿基，且上游片段的下游引物和下游片段的上游引物為堿基序列互補，引物位置在目的基因與其相鄰基因的啟動子間； (4)同源重組后基因點突變菌株的制備:上游片段、插入基因片段、下游片段分別經(jīng)3次雙酶切及連接后轉(zhuǎn)化至克隆菌，獲得兩端含原始菌基因片段、中間為抗生素篩選基因的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，其特征在于所述的原始菌為福氏志賀菌、大腸桿菌、沙門菌、霍亂菌或空腸彎曲菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于同源重組的細菌基因點突變分子克隆技術(shù)，其特征在于所述的插入基因片段為抗生素篩選基因。
【文檔編號】C12R1/19GK103966248SQ201410150158
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月10日
【發(fā)明者】濮小英, 潘勁草, 張蔚, 鄭偉, 汪皓秋 申請人:杭州市疾病預(yù)防控制中心