一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟：（1）將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，活化培養(yǎng)，制得活化菌株；（2）將活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)，制得發(fā)酵種子；（3）將發(fā)酵種子接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)，即得。本發(fā)明利用木糖母液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，將木糖母液變廢為寶，并且有效降低了桔霉素的產(chǎn)生，降低桔霉素濃度與發(fā)酵液色價比值，提高紅曲產(chǎn)品的安全性。
【專利說明】一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]紫色紅曲菌(Monascus purpureus)是紅曲紅色素和降血脂藥的重要生產(chǎn)菌株,其發(fā)酵產(chǎn)物也被廣泛應(yīng)用于飲食烹飪。1995年，Blanc在紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了腎毒素桔霉素(citrinin)，桔霉素會導(dǎo)致腎臟腫大，腎小管擴張，上皮細胞壞死，同時還具有致畸致癌作用，因此紅曲產(chǎn)品的安全性受到了質(zhì)疑。
[0003]傳統(tǒng)的紅曲霉培養(yǎng)方式以大米(淀粉)為原料，有調(diào)察顯示中國市場內(nèi)約有一半的紅曲產(chǎn)品桔霉素含量超標(Yan I1.,2012)。
[0004]為了降低紅曲產(chǎn)品中桔霉素的產(chǎn)量，研究者對紅曲菌進行大量的菌種改良和發(fā)酵工藝改良研究。這其中有對紅曲霉菌株進行基因工程改造(周禮紅，江南大學)，使用60Co輻照誘變(許贛榮，江南大學)，有研究利用大豆水解液為氮源優(yōu)化發(fā)酵工藝降低桔霉素產(chǎn)量(陳蘊，江南大學)。
[0005]如中國專利文獻CN102987180A (申請?zhí)?01210536354.9)公開了一種低桔霉素紅曲米的生產(chǎn)方法，其采用紫色紅曲菌發(fā)酵大米而成，該方法的工藝步驟為:(I)將清洗干凈的大米放入加有桔霉素抑制劑的水中浸泡；(2)浸泡后的大米經(jīng)浙干、蒸米、降溫、接種，再堆積培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入通風培養(yǎng)；所述通風培養(yǎng)期間通過補加水使物料的含水量保持在50wt%~70wt%，所述補加的水中加入有金屬螯合劑；(3)所述通風培養(yǎng)結(jié)束前，向物料加入氧化劑以去除紅曲米上的桔霉素；所述通風培養(yǎng)結(jié)束后，出料烘干，即可得到低桔霉素紅曲米。
[0006]中國專利文獻CN1807576A (申請?zhí)?00610033131.5)公開了一種不含桔霉素的功能性紅曲菌菌絲體的培養(yǎng)方法。該方法通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)室或塑膜溫室送風量排風量或敞開式通風系統(tǒng)，在菌絲體生長對數(shù)期以低濃度醋酸霧狀物以及點燃稻草產(chǎn)生煙熏進行刺激，以及加大通氣量，使菌絲體培養(yǎng)階段晝夜間變溫、調(diào)濕，調(diào)控培養(yǎng)基料含水量，保持淀粉質(zhì)培養(yǎng)基料疏松，加速菌絲體生長速率及功能性代謝產(chǎn)物Monacolin K的合成和積累，同時有效抑制Monascidin A(Citrinin)的形成。但上述研究仍然不能滿足市場的需求。
[0007]將玉米秸、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣、稻草、小麥秸桿等植物原料進行加壓加熱預(yù)處理以及酸水解后，再對水解液進行木糖濃縮結(jié)晶，在結(jié)晶分離后得到的廢液一木糖母液；木糖母液采用菲林法測定其還原糖含量為3%~80%的生產(chǎn)廢棄糖液；通常采用高效液相色譜法(HPLC)測定其可溶性糖為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖各種糖的濃度，該廢液的木糖含量為25~70%，葡萄糖含量為5~25%，阿拉伯糖含量為5~25%。針對上述木糖母液，目前還沒有很好的利用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下:[0010]一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟:
[0011](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在25~35°C活化培養(yǎng)4~5天，制得活化菌株；
[0012](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在25~35°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)2~4天，制得發(fā)酵種子；
[0013](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10~1:5接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25~35°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)7~10天，即得；
[0014]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0015]木糖母液30 ~50mL，NaN032 ~4g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g,MgS04.7H200.5g, FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH5 ~7。
[0016]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，每升組分如下:
[0017]木糖母液30mL， NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH6。
[0018]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的紅曲霉菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種保藏編號40943。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況選擇不同的紅曲霉菌株進行制備紅曲制劑。
[0019]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的PDA斜面培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0020]去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，定容至1000mL。
[0021]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的PDA種子培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0022]去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，定容至1000mL。
[0023]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述木糖母液的組分如下，均為重量百分比:
[0024]木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量為水。DNS法測得總還原糖濃度為600 ~700g/L。
[0025]有益效果
[0026]1、本發(fā)明利用木糖母液作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，將木糖母液變廢為寶，并且有效降低了桔霉素的產(chǎn)生，降低桔霉素濃度與發(fā)酵液色價比值，提高紅曲產(chǎn)品的安全性；
[0027]2、本發(fā)明采用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲霉，相比固態(tài)發(fā)酵操控性強，且物質(zhì)利用效率高，節(jié)約能源。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為紅曲菌株經(jīng)發(fā)酵后的發(fā)酵液在500nm的發(fā)酵液色價、桔霉素濃度和桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值的柱狀圖；
[0029]圖2為紅曲菌株經(jīng)發(fā)酵后的發(fā)酵液在400nm和500nm的發(fā)酵液色價、桔霉素濃度和桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值的柱狀圖；
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。
[0031]培養(yǎng)基
[0032]實施例中的PDA斜面培養(yǎng)基按如下方法制備:
[0033]去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，定容至1000mL,充分溶解后，121°C高壓蒸汽滅菌30min ；
[0034]實施例中的PDA種子培養(yǎng)基按如下方法制備:
[0035]去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，定容至1000mL,充分溶解后，121°C高壓蒸汽滅菌30min。
[0036]發(fā)酵產(chǎn)物指標(發(fā)酵液色價、桔霉素濃度)檢測方法如下:
[0037]發(fā)酵液色價檢測方法:用發(fā)酵液四倍體積的無水乙醇在60°C水浴中萃取lh，12000rpm/min離心5min,取上清，用適量無水乙醇稀釋，以無水乙醇做空白對照，測量在400nm和500nm處測量吸光值。
[0038]色價=500nm波 長下吸光值X稀釋倍數(shù)；
[0039]或者
[0040]色價=(400nm波長下吸光值+500nm波長下吸光值)X稀釋倍數(shù)
[0041]桔霉素檢測方法:用發(fā)酵液四倍體積的無水乙醇在60°C水浴中萃取lh，12000rpm/min離心5min,取上清液,用0.22 μ m的濾膜微濾后,進行HPLC分析。
[0042]菌株來源:購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種保藏編號40943。
[0043]木糖母液購自山東龍力生物科技股份有限公司，經(jīng)檢測，木糖母液的組分如下，均為重量百分比:
[0044]木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量為水。DNS法測得還原糖含量為600 ~700g/Lo
[0045]實施例1
[0046]—種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟:
[0047](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0048](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)3天，制得發(fā)酵種子；
[0049](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0050]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0051]木糖母液30mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0052]經(jīng)分析本次使用木糖母液木糖含量為468g/L ;葡萄糖含量為114g/L ；DNS法測得還原糖量為618g/L
[0053]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的紅曲霉菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種保藏編號40943。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際情況選擇不同的紅曲霉菌株進行制備紅曲制劑。
[0054]本發(fā)明所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為17.2U/mL，桔霉素含量為0.598mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.03μ g/U。
[0055]實施例2
[0056]一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟:
[0057](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0058](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)4天，制得發(fā)酵種子；
[0059](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；[0060]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0061]木糖母液20mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0062]本發(fā)明所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為6.54U/mL，桔霉素含量為0.548mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.083μ g/U。
[0063]實施例3
[0064]一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟:
[0065](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0066](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)4天，制得發(fā)酵種子；
[0067](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0068]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0069]木糖母液30mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0070]上述低桔霉素產(chǎn)生的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基的應(yīng)用，步驟如下:
[0071]本發(fā)明所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為6.3U/mL，桔霉素含量為0.47mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.075μ g/U。
[0072]實施例4
[0073]一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，包括如下步驟:
[0074](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0075](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)4天，制得發(fā)酵種子；
[0076](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0077]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0078]木糖母液50mL，NaN033g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。[0079]本發(fā)明所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為6.5U/mL，桔霉素含量為0.58mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.09μ g/U。
[0080]對比例I
[0081](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0082](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)3天，制得發(fā)酵種子；
[0083](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0084]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下:
[0085]木糖30g, NaN033g,酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000ml, pH6.0。
[0086]對比例I所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為8.7U/mL,桔霉素含量為0.348mg/L,桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.03 μ g/U。
[0087]對比例2
[0088](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0089](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)3天，制得發(fā)酵種子；
[0090](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0091]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基使用PDA培養(yǎng)基作為對比，每升組分如下:
[0092]去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，定容至1000mL。
[0093]對比例2所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為20.8U/mL,桔霉素含量為8.62mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.41 μ g/U。
[0094]對比例3
[0095](I)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在30°C活化培養(yǎng)4天，制得活化菌株;
[0096](2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)4天，制得發(fā)酵種子；
[0097](3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C >200rpm/min條件下,培養(yǎng)8天，即得；
[0098]所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，參照文獻報道方法制備(邢淑婕，周穎，劉開華.玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的研究及條件優(yōu)化[J].中國釀造，2010 (9):130-132)出玉米芯水解液，依照還原糖量添加玉米芯水解液配置發(fā)酵培養(yǎng)基，還原糖量與實施例2相同，培養(yǎng)基其余成分不變。
[0099] 對比例3所涉及的紅曲霉菌株在上述發(fā)酵方法下生產(chǎn)的發(fā)酵液色價為5.0U/mL,桔霉素含量為0.44mg/L，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價的比值為0.08 μ g/U。[0100]結(jié)果分析
[0101]由上述結(jié)果可以看出，使用木糖母液(實施例1)相對于純木糖培養(yǎng)(對比例I),具有較高色價，同時保持較低的桔霉素濃度與色價比值；相對于PDA培養(yǎng)基(對比例2)，本發(fā)明可以極大的降低桔霉素產(chǎn)量；而相對于文獻報道的方法(對比例3)本發(fā)明具有較高的發(fā)酵液色價，桔霉素濃度與發(fā)酵液色價比值也較低(實施例2、3、4)，同時，當木糖母液添加量為30mL/L時(實施例3),發(fā)酵效果最佳。
[0102]雖然本申請已以較佳實施例揭露如上，然并非用以限定本申請實施的范圍，依據(jù)本申請的權(quán)利要 求書及說明內(nèi)容所作的簡單的等效變化與修飾，仍屬于本申請技術(shù)方案的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種利用木糖母液制備紅曲制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將紅曲霉菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，在25~35°C活化培養(yǎng)4~5天，制得活化菌株； (2)將步驟(1)制得的活化菌株接種于PDA種子培養(yǎng)基中，在25~35°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)2~4天，制得發(fā)酵種子； (3)將步驟(2)制得的發(fā)酵種子按照體積比1:10~1:5接種于紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25~35°C、200rpm/min條件下，培養(yǎng)7~10天，即得； 所述步驟(3)中的紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，每升組分如下: 木糖母液 30 ~50mL，NaN032 ~4g，酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g,MgS04.7H200.5g, FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH5 ~7。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每升組分如下: 木糖母液 30mL, NaN033g,酵母提取物 lg，K2HP041g, KC10.5g, MgS04.7H200.5g,FeS04.7H200.01g，水定容至 1000mL, pH6。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的紅曲霉菌株購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)，菌種保藏編號40943。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的PDA斜面培養(yǎng)基，每升組分如下: 去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，定容至1000mL。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的PDA種子培養(yǎng)基，每升組分如下: 去皮馬鈴薯200g，切塊，加水600mL煮沸30分鐘，八層紗布過濾，加入20g葡萄糖，定容至 1000mL。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述木糖母液的組分如下，均為重量百分 比: 木糖40~50%，葡萄糖10%，阿拉伯糖10%，余量為水。
【文檔編號】C12R1/66GK103937682SQ201410152887
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】方詡, 自振滔, 石文昊, 李鈺茜, 王明鈺 申請人:山東大學