一種利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法。本發(fā)明提供了自組裝細(xì)胞芯片在轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物中的應(yīng)用和利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法；其中自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SAMcell芯片可以用來定點(diǎn)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物，該方法有機(jī)結(jié)合了細(xì)胞芯片技術(shù)和定點(diǎn)轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以有效的應(yīng)用于蛋白質(zhì)或化合物的大規(guī)模篩選研究。
【專利說明】一種利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2001年Ziauddin等人首先發(fā)明了反向轉(zhuǎn)染技術(shù)，將可以表達(dá)報(bào)告基因的質(zhì)粒點(diǎn)在玻璃片上，待復(fù)合物晾干之后，在上面培養(yǎng)細(xì)胞，兩天以后觀察轉(zhuǎn)染效果。這種技術(shù)的出現(xiàn)讓生物學(xué)家們有機(jī)會(huì)拋棄孔板技術(shù)而改用芯片技術(shù)來進(jìn)行高通量的篩選工作。這種基于芯片的反向轉(zhuǎn)染技術(shù)有幾大優(yōu)點(diǎn):(1)因?yàn)榉聪蜣D(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染試劑和核酸用量極低，大大降低了成本；(2)所有細(xì)胞都在一個(gè)培養(yǎng)皿中，所以它們具有可比性，這樣實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高；(3)下游操作簡(jiǎn)單，比如細(xì)胞染色等等，只需將芯片統(tǒng)一處理即可。但這種方法還有一個(gè)缺點(diǎn)，就是只有在最后進(jìn)行熒光拍照的時(shí)候才知道哪個(gè)位置點(diǎn)了核酸，也就是定位的問題。
[0003]目前，已經(jīng)發(fā)明了一種SAMcell 芯片(Self-assembled Cell Microarray,自組裝細(xì)胞芯片)技術(shù)。該技術(shù)的主要核心是:(I)應(yīng)用反向轉(zhuǎn)染技術(shù)；(2)利用一種在低溫下可以溶解在水中的高聚物的特性來解決定位的問題。這種高聚物叫做聚-N-異丙基丙烯酰胺(PolyN-1sopropylacrylamide,PNI)。當(dāng)它在水中被加熱到32°C以上時(shí),它會(huì)萎縮脫水，只剩自身體積的10%左右，而這個(gè)過程是可逆的。它的另一特性是細(xì)胞不能在其表面生長(zhǎng)。利用了 PNI的特性，首先在干燥環(huán)境中把PNI鋪在芯片上，晾干，然后用等離子刻蝕機(jī)刻蝕，直到把PNI膜刻穿，刻蝕的大小可以用模具來控制，經(jīng)過刻蝕的地方細(xì)胞就可以在上面生長(zhǎng)。其后在上面點(diǎn)上反向轉(zhuǎn)染的復(fù)合物，接下來在上面培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁之后，把溫度降到32°C以下，PNI膜就會(huì)溶解脫落，洗滌之后就會(huì)形成細(xì)胞島。
[0004]這種技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn)。首先，應(yīng)用微細(xì)加工技術(shù)，圓形區(qū)域的誤差可以控制在不到萬分之一，這樣就可以對(duì)芯片進(jìn)行十分精確的控制；其次，實(shí)驗(yàn)過程中，所有的細(xì)胞島都在相同的培養(yǎng)條件下孵育，所以所有的實(shí)驗(yàn)組都是可以比較的；第三，由于所有的細(xì)胞島在同一張芯片上，這樣在后期處理過程中，操作簡(jiǎn)便而且成本較低?？梢灶A(yù)見，這種技術(shù)在未來的生物研究中具有十分廣闊的應(yīng)用前景。SAMcell芯片技術(shù)已經(jīng)成為了生物學(xué)家們?cè)谘芯炕蚬δ軙r(shí)的得力助手，但目前都是應(yīng)用于轉(zhuǎn)染核酸，對(duì)于轉(zhuǎn)染其他物質(zhì)如蛋白等未有研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供自組裝細(xì)胞芯片的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的自組裝細(xì)胞芯片在轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物中的應(yīng)用；所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜。
[0007] 上述應(yīng)用中，所述蛋白質(zhì)為表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β ;所述化合物為G418。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種定點(diǎn)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法。
[0009]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0010]I)將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
[0011]所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)為蛋白質(zhì)或化合物；
[0012]2)將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上，得到固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片；
[0013]所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜；
[0014]3)將目的細(xì)胞接種到所述固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片上，培養(yǎng)；實(shí)現(xiàn)所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)轉(zhuǎn)染到所述目的細(xì)胞中。
[0015]上述方法中，
[0016]步驟I)中，所述將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方法包括如下步驟:將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)溶液與明膠溶液混勻，孵育，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物；
[0017]步驟2)中，所述將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上的方法包括如下步驟:先將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物點(diǎn)樣在所述自組裝細(xì)胞芯片上的用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域，再進(jìn)行干燥。
[0018]上述方法中，
[0019]所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)為蛋白質(zhì)或化合物；
[0020]所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)溶液為待轉(zhuǎn)染物質(zhì)水溶液；
[0021]所述明膠溶液由明膠、纖維連接蛋白和水組成，其中明膠在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.4%，纖維連接蛋白在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01%。
[0022]上述方法中，
[0023]步驟I)中，所述蛋白質(zhì)與所述明膠的質(zhì)量比為1:1 X 106-1 X 108，所述蛋白質(zhì)與所述明膠的質(zhì)量比具體為1:4X106;
[0024]所述化合物與所述明膠的質(zhì)量比為1: 3-5，所述化合物與所述明膠的質(zhì)量比具體為 1:4 ;
[0025]步驟3)中，所述目的細(xì)胞和所述蛋白質(zhì)的配比為I X IO4-1 X IO7個(gè):I納克，所述目的細(xì)胞和所述蛋白質(zhì)的配比具體為4X106個(gè):1納克；
[0026]所述目的細(xì)胞和所述化合物的配比為IO-1XlO7個(gè):1納克，所述目的細(xì)胞和所述化合物的配比具體為20個(gè):1納克。
[0027]上述方法中，
[0028]步驟I)中，所述孵育的溫度為25-28°C，所述孵育的時(shí)間為5min_30min ;所述孵育的溫度具體為25°C,所述孵育的時(shí)間具體為5min ；
[0029]步驟2)中，所 述干燥的時(shí)間為2_20h ;所述干燥的時(shí)間具體為12h ；
[0030]步驟3)中，所述培養(yǎng)的溫度為34-45 °C;所述培養(yǎng)時(shí)間為12_48小時(shí)；所述培養(yǎng)的溫度具體為37°C ;所述培養(yǎng)時(shí)間具體為24小時(shí)。
[0031]上述方法中，
[0032]所述蛋白質(zhì)為表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β ；[0033]所述化合物為G418 ;
[0034] 所述目標(biāo)細(xì)胞為Hela細(xì)胞或含有GFP蛋白表達(dá)的Hela細(xì)胞，其中在本發(fā)明的實(shí)施例中，含有GFP蛋白表達(dá)的Hela細(xì)胞為Hela-H2B_GFP。
[0035]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，SAMcell芯片可以作為蛋白質(zhì)或化合物的有效載體而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)染，相對(duì)于傳統(tǒng)的利用多孔板的方法有以下優(yōu)點(diǎn):
[0036]1、采用聚合物包裹蛋白質(zhì)或化合物，使得這些分子有控制地釋放到周圍的溶液中，而不對(duì)相鄰的點(diǎn)陣造成交叉污染，達(dá)到定點(diǎn)釋放的目的；
[0037]2、蛋白質(zhì)或化合物在點(diǎn)制的區(qū)域集中作用細(xì)胞，作用效果明顯；
[0038]3、所有的細(xì)胞都在相同的培養(yǎng)條件下孵育，實(shí)驗(yàn)組的平行性會(huì)非常好；
[0039]4、芯片作為載體更加集成化，使得蛋白質(zhì)或者化合物的用量大大降低；
[0040]5、芯片是一個(gè)開放性體系，后期處理過程中，操作簡(jiǎn)便而且成本較低。
[0041]SAMcell芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法相對(duì)于之前的核酸芯片具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0042]1、蛋白質(zhì)或化合物更容易進(jìn)入細(xì)胞或者直接作用于細(xì)胞表面,所以不需要用轉(zhuǎn)染試劑，成本大大降低；
[0043]2、由于該種方法不需要使用轉(zhuǎn)染試劑，可以采用更加低溫進(jìn)行儲(chǔ)存，比如-20度，延長(zhǎng)了保存期；
[0044]3、蛋白質(zhì)或化合物比核酸見效快，因此通常24小時(shí)后就可以觀測(cè)表型，而不用等到48或96小時(shí)后，縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
[0045]總之，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)SAMcell芯片可以用來定點(diǎn)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物，該方法有機(jī)結(jié)合了細(xì)胞芯片技術(shù)和定點(diǎn)轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以有效的應(yīng)用于蛋白質(zhì)或化合物的大規(guī)模篩選研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)結(jié)果圖
[0047]圖2為利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖
[0048]圖3為利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染化合物結(jié)果圖
[0049]圖4為利用自組裝細(xì)胞芯片轉(zhuǎn)染化合物結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖
【具體實(shí)施方式】
[0050]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052]下述實(shí)施例中所用的SAMcell芯片(自組裝細(xì)胞芯片)包括基底，在基底上設(shè)有用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在基底上除用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜(PNI膜)；具體構(gòu)建方法如下:
[0053]用去垢劑和超純水清洗實(shí)驗(yàn)室常用的玻片(25毫米*25毫米)表面。在其表面滴一層聚合物薄膜，使用65微升6% (W/V)的Poly (N-1sopropylacryIamide)乙醇溶液,干燥后，在室溫保存12小時(shí)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求制備硅片掩模，利用微加工技術(shù)可在其上刻出微孔，得到SAMcell芯片(自組裝細(xì)胞芯片)，該方法也在專利申請(qǐng)200910210565.1中公開。[0054]下述實(shí)施例中所用的Hela-H2B_GFP細(xì)胞記載在如下文獻(xiàn)中，B.Neumann, etal., ^Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy revealscell division genes, "Nature, vol.464, pp.721-7，Aprl2010,公眾可從蘇州吉諾瑞生物科技有限公司獲得。
[0055]實(shí)施例1、利用SAMcell芯片技術(shù)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)
[0056]在現(xiàn)代生物領(lǐng)域，科學(xué)家們對(duì)蛋白質(zhì)以及多肽的功能尤其關(guān)注，本研究中試圖將SAMcell芯片技術(shù)應(yīng)用在篩選 蛋白質(zhì)以及多肽的領(lǐng)域。
[0057]表皮生長(zhǎng)因子(EGF) (SinoBio公司，貨號(hào)C029A)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) β(CellSignaling Technology 公司，貨號(hào) 5154LC)
[0058]EGF溶液為將表皮生長(zhǎng)因子(EGF)溶解在高純水中得到的溶液；
[0059]TGF液為將轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF) β溶解在高純水中得到的溶液。
[0060]1、取IOul濃度為Ing/mL的EGF溶液和IOul濃度為Ing/mL的TGF溶液分別加入96孔板的每個(gè)孔中；再向上述處理后的每個(gè)孔中加入IOul明膠溶液(該溶液由明膠(Sigma公司、貨號(hào)G-9391)、纖維連接蛋白(Sigma公司、貨號(hào)H)895)和水組成，其中明膠在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.4%，纖維連接蛋白在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01%);蛋白EGF或TFG與明膠的質(zhì)量比均為1:4X IO6;充分混勻，室溫(25°C)孵育5分鐘，得到混合液即為反向轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)EGF復(fù)合物和反向轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)TGF復(fù)合物。
[0061]2、利用點(diǎn)樣儀將反向轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)EGF復(fù)合物和反向轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)TGF復(fù)合物分別交錯(cuò)地點(diǎn)在SAMcell芯片的用于固定蛋白質(zhì)的部分區(qū)域，其余部分不點(diǎn)任何物質(zhì)作為對(duì)照，干燥過夜(室溫，大于12h)，得到固定蛋白質(zhì)的芯片；
[0062]3、將Hela-H2B_GFP細(xì)胞消化并吹打均勻，然后接種于固定蛋白質(zhì)的芯片上(細(xì)胞和蛋白質(zhì)的配比為4X IO6個(gè):1納克)，37°C溫度培養(yǎng)24h，得到轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的芯片；實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染到Hela-H2B-GFP細(xì)胞中，其中，EGF/TFG、明膠、細(xì)胞的配比為0.025ng:1 X 105ng:
IX IO5 個(gè)；
[0063]4、將轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的芯片在室溫(25°C)放置5分鐘，PNI膜脫落，然后使用PBS水溶液(PH7.4)清洗3次，得到含有轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)細(xì)胞小島的待檢測(cè)芯片。由于只在芯片上的某些位置上進(jìn)行蛋白質(zhì)點(diǎn)樣，其余部分不點(diǎn)任何物質(zhì)作為對(duì)照；因此，同一張芯片上既有轉(zhuǎn)染了蛋白質(zhì)的細(xì)胞小島，又有未轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的細(xì)胞小島(對(duì)照組，Mock)。
[0064]將待檢測(cè)芯片置于倒置熒光顯微鏡(Nikon, LH - M100CB)下檢測(cè)，在10倍物鏡下觀察綠色熒光。以未轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)的細(xì)胞小島為陰性對(duì)照(mock)。
[0065]結(jié)果如圖1所示，圖中的綠色代表Hela-H2B_GFP細(xì)胞的細(xì)胞核；可以看出，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)可以顯著促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在對(duì)應(yīng)含有兩種生長(zhǎng)因子的位置上，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照組。
[0066]統(tǒng)計(jì)每個(gè)小島內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果如圖2所示。
[0067]以陰性對(duì)照(Mock)細(xì)胞小島的作為1，其余各小島中的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為其余各小島中的細(xì)胞個(gè)數(shù)/陰性對(duì)照(Mock)細(xì)胞小島。
[0068]轉(zhuǎn)染表皮生長(zhǎng)因子(EGF)細(xì)胞小島的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為3.8 ；
[0069]轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)細(xì)胞小島的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為2.7 ；
[0070]陰性對(duì)照(Mock)細(xì)胞小島的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為1.0。[0071]從此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:
[0072]1、在芯片上點(diǎn)有EGF或者TGF的區(qū)域細(xì)胞明顯生長(zhǎng)旺盛，而沒有點(diǎn)蛋白的區(qū)域(對(duì)照組)生長(zhǎng)較慢。說明SAMcell芯片技術(shù)可以有效應(yīng)用于轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)，并且不會(huì)干擾到相鄰的位點(diǎn)。
[0073]2、蛋白的使用量非常小，只有納克級(jí)別，大大節(jié)約了用量，而得到的效果是非常顯著的。
[0074]3、實(shí)驗(yàn)過程中并沒有使用轉(zhuǎn)染試劑幫助轉(zhuǎn)染，而蛋白可以很好的作用并起到效果，大大降低了成本。
[0075]4、接種細(xì)胞后24小時(shí)就可以看到明顯的效果，縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
[0076]5、從圖1和圖2可以看出，同一張芯片上平行的三組復(fù)孔平行性很好。
[0077]實(shí)施例2、利用SAMcell芯片技術(shù)轉(zhuǎn)染化合物G418
[0078]目前通過篩選化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞各種表型的影響，來確定該化學(xué)物質(zhì)是否可以成為化合物，SAMcell芯片技術(shù)應(yīng)用于化合物篩選。實(shí)驗(yàn)中選取G418 (Cellgrog公司，貨號(hào)30-234-CI)作為測(cè)試化合物，G418是一種抗生素，它也被稱作遺傳霉素，G418—般用于對(duì)含有特定抗性基因的穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，普通的細(xì)胞沒有該抗性基因，所以它對(duì)普通的細(xì)胞具有致死效果。
[0079]G418溶液:將G418溶于PBS水溶液(pH7.4)中，得到G418溶液，G418在G418溶液中的終濃度為lmg/mL。
[0080]1、取IOul濃度為lmg/mL的G418溶液加入96孔板的每個(gè)孔中；再向上述處理后的每個(gè)孔中加入IOul明膠溶液(該溶液由明膠(Sigma公司、貨號(hào)G-9391)、纖維連接蛋白(Sigma公司、貨號(hào)H)895)和水組成，其中明膠在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.4%，纖維連接蛋白在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01%)，且G418和明膠的質(zhì)量比為1:4，充分混勻；室溫(25°C)孵育5分鐘，得到混合液即為轉(zhuǎn)染G418復(fù)合物；
[0081]2、利用點(diǎn)樣儀將轉(zhuǎn)染G418復(fù)合物(混合液)交錯(cuò)地點(diǎn)在SAMcell芯片的用于固定化合物的區(qū)域，干燥過夜(12h)，得到固定G418的芯片；
[0082]3、將Hela-H2B_GFP細(xì)胞接種到固定G418的芯片上(細(xì)胞和G418的配比:20個(gè)細(xì)胞/I納克)，37°C溫度培養(yǎng)48h。得到轉(zhuǎn)染G418的芯片；實(shí)現(xiàn)G418轉(zhuǎn)染到Hela-H2B_GFP細(xì)胞中，其中，明膠、G418和細(xì)胞的配比為IXlO5ng:2.5X 104ng: 5 X IO5個(gè)；
[0083]4、將轉(zhuǎn)染G418的芯片在室溫(25°C )放置5分鐘，PNI膜脫落，然后使用PBS水溶液(pH7.4)清洗3次，得到含有轉(zhuǎn)染G418細(xì)胞小島的待檢測(cè)芯片。其中未加入G418為陰性對(duì)照。由于只在芯片上的某些位置上進(jìn)行化合物點(diǎn)樣，其余部分不點(diǎn)任何物質(zhì)作為對(duì)照；因此，同一張芯片上既有轉(zhuǎn)染了化合物的細(xì)胞小島，又有未轉(zhuǎn)染化合物的細(xì)胞小島(對(duì)照組，Mock)。
[0084]將待檢測(cè)芯片置于倒置熒光顯微鏡(Nikon, LH-M100CB)下檢測(cè)，在10倍物鏡下觀察綠色熒光。以未轉(zhuǎn)染化合物的細(xì)胞小島為陰性對(duì)照(Mock)；
[0085] 結(jié)果如圖3所示(其中左圖為點(diǎn)樣示意圖，右圖為熒光照片)，左圖中白色代表轉(zhuǎn)染G418混合物，黑色代表沒有加入G418的陰性對(duì)照(Mock);從圖中可以看出，含有G418的位置，細(xì)胞生存數(shù)量相對(duì)對(duì)照組很少，而沒有G418的細(xì)胞就生長(zhǎng)得很好，說明了 SAMcell芯片可以有效地轉(zhuǎn)染G418這種化學(xué)物質(zhì)，而且基本上沒有交叉污染的情況出現(xiàn)。[0086]統(tǒng)計(jì)每個(gè)小島內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果如圖4所示。
[0087]轉(zhuǎn)染G418細(xì)胞小島的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為0.1 (圖中縱坐標(biāo)為相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù))；
[0088]陰性對(duì)照(Mock)細(xì)胞小島的相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù)為1.0 (圖中縱坐標(biāo)為相對(duì)細(xì)胞個(gè)數(shù))。
[0089]從此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出以下結(jié)論:
[0090]1、在芯片上點(diǎn)有G418的區(qū)域細(xì)胞明顯死亡率高，而沒有點(diǎn)G418的區(qū)域(對(duì)照組)生長(zhǎng)狀態(tài)良好。說明SAMcell芯片技術(shù)可以有效應(yīng)用于轉(zhuǎn)染化合物，并且不會(huì)干擾到相鄰的位點(diǎn)。
[0091]2、化合物的使用量非常小，只有微克級(jí)別，大大節(jié)約了用量，而得到的效果是非常顯著的。
[0092]3、實(shí)驗(yàn)過程中并沒有使用轉(zhuǎn)染試劑幫助轉(zhuǎn)染，而化合物可以很好的作用并起到效果，大大降低了成本。
[0093]4、從圖3和圖4可以看出，同一張芯片上平行的副孔之間平行性很好。
[0094]綜上所述，對(duì)以SAMcell芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行開發(fā)，并發(fā)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)染體系可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)染SiRNA、質(zhì)粒、蛋白質(zhì)或多肽和化學(xué)物質(zhì)等領(lǐng)域，從而成為核酸、蛋白質(zhì)與多肽和生物化學(xué) 等諸多領(lǐng)域中進(jìn)行高通量篩選的有力工具。
【權(quán)利要求】
1.自組裝細(xì)胞芯片在轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物中的應(yīng)用；所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述蛋白質(zhì)為表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β ;所述化合物為G418。
3.一種定點(diǎn)轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的方法，包括如下步驟: 1)將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物； 所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)為蛋白質(zhì)或化合物； 2)將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上，得到固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片； 所述自組裝細(xì)胞芯片包括基底，在所述基底上設(shè)有用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域；在所述基底上除用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域外的其他區(qū)域覆蓋抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的聚-N-異丙基丙烯酰胺膜； 3)將目的細(xì)胞接種到所述固定待轉(zhuǎn)染物質(zhì)的芯片上，培養(yǎng)；實(shí)現(xiàn)所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)轉(zhuǎn)染到所述目的細(xì)胞中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)通過明膠包裹得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物的方法包括如下步驟:將待轉(zhuǎn)染物質(zhì)溶液與明膠溶液混勻，孵育，得到轉(zhuǎn)染復(fù)合物； 步驟2)中，所述將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物固定到自組裝細(xì)胞芯片上的方法包括如下步驟:先將所述轉(zhuǎn)染復(fù)合物點(diǎn)樣在所述自組裝細(xì)胞芯片上的用于固定所述轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或化合物的區(qū)域，再進(jìn)行干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于: 所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)為蛋白質(zhì)或化合物； 所述待轉(zhuǎn)染物質(zhì)溶液為待轉(zhuǎn)染物質(zhì)水溶液； 所述明膠溶液由明膠、纖維連接蛋白和水組成，其中明膠在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.4%，纖維連接蛋白在溶液中的質(zhì)量百分含量為0.01%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述蛋白質(zhì)與所述明膠的質(zhì)量比為1:1Χ106-1Χ108，所述蛋白質(zhì)與所述明膠的質(zhì)量比具體為1:4X IO6 ; 所述化合物與所述明膠的質(zhì)量比為1:3-5，所述化合物與所述明膠的質(zhì)量比具體為1:4 ； 步驟3)中，所述目的細(xì)胞和所述蛋白質(zhì)的配比為1X1O4-1 X 1O7個(gè):I納克，所述目的細(xì)胞和所述蛋白質(zhì)的配比具體為4Χ106個(gè):1納克； 所述目的細(xì)胞和所述化合物的配比為10-1 X IO7個(gè):I納克，所述目的細(xì)胞和所述化合物的配比具體為20個(gè):1納克。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法,其特征在于: 步驟1)中，所述孵育的溫度為25-28°C，所述孵育的時(shí)間為5min-30min ;所述孵育的溫度具體為25°C,所述孵育的時(shí)間具體為5min ； 步驟2)中，所述干燥的時(shí)間為2-20h ;所述干燥的時(shí)間具體為12h ； 步驟3)中，所述培養(yǎng)的溫度為34-45°C;所述培養(yǎng)時(shí)間為12-48小時(shí)；所述培養(yǎng)的溫度具體為37°C ;所述培養(yǎng)時(shí)間具體為24小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于: 所述蛋白質(zhì)為表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β ; 所述化合物為G418 ; 所述目標(biāo)細(xì)胞為H ela細(xì)胞或含有GFP蛋白表達(dá)的Hela細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/07GK103966155SQ201410156548
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月25日
【發(fā)明者】張函槊, 莊峰鋒, 李紹路, 李娟
申請(qǐng)人:蘇州吉諾瑞生物科技有限公司