小鼠成肌細胞的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開采用機械組織分離，原代培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細胞形成40-80％豐度時加分化培養(yǎng)基直至肌管被誘導形成小鼠成肌細胞。采用此方法從每克小鼠肌肉中能分離到約1×108個細胞，其中成肌細胞和衛(wèi)星細胞的比例達到90％以上。成肌細胞在研究肌管形成及肌肉發(fā)育細胞、分子機理方面具有重要作用。
【專利說明】小鼠成肌細胞的制備方法及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明涉及成肌細胞的獲得方法，更具體地說，本發(fā)明涉及小鼠成肌細胞的制備方法，以及該方法的應(yīng)用。
[0002]現(xiàn)有技術(shù)的描述:
[0003]成肌細胞是一種胚胎祖細胞，它能夠分化成為肌肉細胞。當成肌細胞融合在一起時就會形成骨骼肌纖維，因此肌纖維具有多個細胞核，每一個核起源于單個的成肌細胞。成肌細胞融合是骨骼肌特異的(例如二頭肌)，而心肌和平滑肌則不是這樣。那些沒有分化成肌纖維的成肌細胞則去分化為衛(wèi)星細胞。這些衛(wèi)星細胞緊貼在肌纖維上，存在于肌纖維膜和肌內(nèi)膜間。這些連接組織將肌束分成單個的肌纖維(Kuang S，Cell Stem Cell, 2008,2(1):22-31 ；Sacco A, Nature，2008，456 (7221): 502-506)。骨骼成肌細胞長期為研究者提供了一個很好的體外研究肌細胞增殖和分化的工具(Nguyen TH, BMC Cell Biol,2010,11:57)。成肌細胞分化的研究對理解肌肉細胞發(fā)育和修復(再生)是非常重要的。培養(yǎng)中的成肌細胞可以表現(xiàn)出肌肉發(fā)生過程的特征，包括增殖，遷移，融合，肌管形成和收縮。生長于含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中的肌肉細胞即使匯合了，也繼續(xù)增殖；而當它們生長于含2-5%馬血清的培養(yǎng)基中時，卻發(fā)生融合并形成肌管。小鼠細胞系C2C12和C2F3是廣泛用來研究成肌細胞增殖和分化的細胞系。目前的科研要求研究者從實驗動物中分離和培養(yǎng)原代的成肌細胞。Thomas A.Rando通過幾輪的“粘附一脫離”的處理，分離和富集了成肌細胞，丟棄了肌成纖維細 胞(Rando TA, J Cell Biol，1994，125 (6): 1275-1287) Joira A.Lawson 同樣也使用差異粘附的步驟，分離和富集雞的成肌細胞(Lawson MA, Cell Tissues Organs,2000,167(2-3): 130-137)。Yu Zhang報道肌成纖維細胞可以保護成肌細胞，以免發(fā)生內(nèi)在的伴隨有分化的凋亡(Zhang Y, Dev Growth Differ，2010，52 (8): 725-733)。
[0004]在研究中發(fā)現(xiàn)，采用Rando描述的方法來分離和分化新生小鼠的成肌細胞非常困難，成功率低。隨著實驗步驟的增加，得到的成肌細胞越來越少，過程中丟失了很多成肌細胞和衛(wèi)星細胞，衛(wèi)星細胞是成肌細胞分化所必需的，并且是成肌細胞的來源；少數(shù)存活下來的成肌細胞生長及其緩慢，非常容易發(fā)生凋亡。
[0005]發(fā)明技術(shù)內(nèi)容:
[0006]本發(fā)明的第一個目的是提供一種小鼠成肌細胞的制備方法，采用該方法，可方便快捷地獲得大量的小鼠成肌細胞，成活率高，生長旺盛，可以很好地用于分化成肌管的研究，其細胞學特征和分子表達的變化穩(wěn)定。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供所獲取的成肌細胞在研究肌管形成及肌肉發(fā)育細胞、分子機理方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明公開了一種小鼠成肌細胞的制備方法，該方法包括下列步驟:
[0009]A)將剛離體、并剪碎的小鼠腿部肌肉按體積比1:2加入分散劑，在37°C顛倒搖動5-10min, 1000rpm離心5min,去上清,得組織碎片；
[0010]B)組織碎片中按體積比1:2加入分散劑，在37°C上下顛倒搖動5-10min成漿糊狀，按體積比1:10加入血清以終止酶消化；[0011 ] C)過濾80 μ m無菌尼龍網(wǎng)，去除大的組織碎片，濾液1000rpm離心5min,去上清，
得沉淀；
[0012]D)沉淀置膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，加原代成肌細胞生長培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0013]E)當成肌細胞生長到40-80%豐度時，去生長培養(yǎng)基，加分化培養(yǎng)基，每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成；
[0014]其中，分散劑組成是0.2%膠原酶和0.05%分散酶，余量為PBS，pH=7.5-7.8;原代成肌細胞生長培養(yǎng)基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，2.5-5.0ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF組成；分化培養(yǎng)基由94-97%DMEM，2-5%馬血清，1%青霉素與鏈霉素組成。
[0015]本發(fā)明還公開了一種優(yōu)選的制備方法，該方法包括下列步驟:
[0016]A)將剛離體、并剪碎的小鼠腿肌肉按體積比1:2加入分散劑，在37°C顛倒搖動IOmin, 1000rpm離心5min,去上清,得組織碎片；
[0017]B)組織碎片中按體積比1:2加入分散劑，在37°C上下顛倒搖動IOmin成漿糊狀，按體積比1:10加入血清以終止酶消化；
[0018]C)過濾80 μ m無菌尼龍網(wǎng)，去除大的組織碎片濾液1000rpm離心5min,去上清；
[0019]D)沉淀置膠原 蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并加原代成肌細胞生長培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0020]E)當成肌細胞生長到80%豐度時，去生長培養(yǎng)基，加分化培養(yǎng)基，每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成；
[0021]其中，分散劑組成是0.2%膠原酶和0.05%分散酶，余量為PBS，pH=7.8;原代成肌細胞生長培養(yǎng)基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，和5.0ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF組成；分化培養(yǎng)基為100%馬血清。
[0022]本發(fā)明所公開的方法適用于從正常野生型小鼠、基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠中分離和分化成肌細胞。
[0023]本發(fā)明還公開了小鼠成肌細胞的制備方法在MAMLl轉(zhuǎn)基因小鼠腿部成肌細胞分化成肌管方面的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明中所使用的新生小鼠為出生2天以內(nèi)的小鼠。從I克小鼠肌肉中大約能夠分離到I X IO8個成肌細胞或衛(wèi)星細胞。本發(fā)明中所使用的bFGF，其濃度不能低于2.5ng/mL。在15mL離心管中使用膠原酶和分散酶消化肌肉碎片時應(yīng)嚴密封好管口，防治液體漏出。
[0025]細胞豐度超過80%后，成肌細胞分化能力減弱，豐度超過95%后，細胞基本上不能形成肌管。細胞豐度低于40%時，細胞數(shù)量偏少，也不利于分化。
[0026]分化培養(yǎng)基中不能使用胎牛血清、小牛血清和牛血清，它們都不能很好地誘導成肌細胞的分化。
[0027]分化所使用的馬血清濃度不能低于2%，否則成肌細胞生長不好，甚至會發(fā)生凋亡。其濃度也不能高于5%，否則誘導肌管形成的能力降低。
[0028]馬血清能夠誘導成肌細胞分化并形成肌管。實驗中發(fā)現(xiàn)圓而小的衛(wèi)星細胞對新生小鼠成肌細胞分化和形成肌管是必需的，如圖3，4和5所示。如果沒有衛(wèi)星細胞，成肌細胞將繼續(xù)增殖并轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，它們不會分化和形成肌管。在正確的條件下，幾乎90%培養(yǎng)的成肌細胞能夠分化并形成肌管如圖5所示。如圖4所示，在將生長培養(yǎng)基換成含有2-5%馬血清的分化培養(yǎng)基一天后，野生型小鼠成肌細胞在培養(yǎng)皿中只形成幾個小的肌管，但是MAMLl轉(zhuǎn)基因小鼠的成肌細胞卻能形成更多的肌管。兩天后，有MAMLl轉(zhuǎn)基因成肌細胞形成的肌管變得更長和更粗壯了。三天后，其中有些肌管延伸得特別長。四天后，由野生型成肌細胞形成的肌管開始萎縮降解，那些由MAMLl轉(zhuǎn)基因成肌細胞形成的肌管也開始萎縮，但是較為溫和，并且它們能夠持續(xù)維持存在超過五天，然后才降解。
[0029]在Rando (1994)的實驗方案中，他們將小鼠組織碎片經(jīng)過幾次傳代，以除去快速貼壁的成纖維細胞，而富集緩慢貼壁的成肌細胞。他們從培養(yǎng)皿的側(cè)邊很強地敲擊桌角，以脫落成肌細胞，而成纖維細胞仍然粘貼在平皿上。但采用這個方法后，收獲到越來越少的細胞。雖然這些類似成肌細胞的短而小的細胞能夠存活2周，最后都發(fā)生凋亡了，不會象Rando所描述的那樣形成克隆。我們在改變了胎牛血清從10%到20%，CO2從5%到10%，或bFGF從lng/ml到10ng/ml的濃度，改變了傳代方式_從敲桌角到酶消化，改變了平皿包被蛋白-從膠原蛋白到層粘蛋白之后，這種成肌類似細胞仍然最終凋亡了。
[0030]通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠成肌細胞，包括大量的能夠發(fā)育成為成肌細胞的衛(wèi)星細胞，呈現(xiàn)為圓球形；以及大量的成肌細胞，呈現(xiàn)為短梭形。肌球蛋白Myosin和MyoD是成肌細胞區(qū)別于成纖維細胞特征性表達的蛋白，我們以此來鑒定成肌細胞，如圖1和圖6所示。在圖1中，發(fā)綠色熒光的細胞是高表達MyoD蛋白的小鼠成肌細胞及衛(wèi)星細胞，成肌細胞的祖先細胞。實驗中使用抗鼠MyoD的一抗及FITC標記的二抗。在圖6中，將來自野生型WT和MAMLl轉(zhuǎn)基因型TG小鼠的成肌細胞誘導分化三天，然后收集成肌細胞和肌管，制備總蛋白，并用Western blot和抗體進行肌球蛋白檢測，Internal loading是選定的內(nèi)參。
[0031]在本發(fā)明中，分散劑配制方法是:稱量0.2克膠原酶和0.05克分散酶，充分溶解于100毫升磷酸緩沖液PBS中，使用無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。
[0032]在本發(fā)明中，原代成肌細胞生長培養(yǎng)基的配制方法是:在80毫升的FlO培養(yǎng)基中加入I毫升的青霉素與鏈霉素的混合液，再加入稱量和稀釋的堿性成纖維細胞生長因子bFGF，終濃度達到5.0ng/mL，加入19-20毫升的胎牛血清，混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在
4。。。
[0033]在本發(fā)明中，分化培養(yǎng)基的配制方法是:將94毫升的DMEM培養(yǎng)基與I毫升的青霉素和鏈霉素混合液混勻，加入5毫升的馬血清，混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。
[0034]除非特別定義，本發(fā)明中所使用的術(shù)語和簡寫具有通常的意義。例如，“mm”指毫米，“min”指分鐘，“mL”指毫升，“ V ”指攝氏度，“ng”指納克，“F10培養(yǎng)基”指Ham’ sF-1ONutrient Medium,“DMEM，，指 Dulbecco，s Modified Eagle Medium,“rpm”指轉(zhuǎn) / 分鐘。
[0035]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點:
[0036]1.能夠分離到較多、較純的小鼠成肌細胞和衛(wèi)星細胞。從每克小鼠肌肉中能分離到約IXlO8個細胞，其中成肌細胞和衛(wèi)星細胞的比例達到90%以上。
[0037]2.分離到的細胞生長旺盛 ，能夠在馬血清的誘導下分化形成大量典型的肌管，數(shù)量是其它方法形成肌管的10倍以上。
[0038]3.操作更加簡單，時間更短，細胞質(zhì)量更好。成肌細胞的分離與獲取只需要1.5-2小時，只需要使用常規(guī)儀器設(shè)備，90%以上培養(yǎng)的細胞能夠分化形成肌管。[0039]4.在成肌細胞分離和分化過程中能夠檢測到特征蛋白的表達變化，符合文獻報道。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1是成肌細胞中特征蛋白MyoD的表達情況圖。
[0041]圖2是MAMLl基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達圖。
[0042]圖3是幾次傳代后成肌細胞的分化成肌管的圖。
[0043]圖4是二次傳代后成肌細胞分化和肌管形成圖。
[0044]圖5是不傳代直接將成肌細胞進行分化的圖。
[0045]圖6是肌球蛋白在分化的成肌細胞中表達圖。
【具體實施方式】
[0046]下面結(jié)合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。
[0047]實施例1.試劑配方和配制方法:
[0048]分散劑組成是0.2%膠原酶和0.05%分散酶，余量為PBS，pH=7.8;原代成肌細胞生長培養(yǎng)基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，5.0ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF組成；分化培養(yǎng)基由94%DMEM，5%馬血清，也可采用100%馬血清作分化培養(yǎng)基。FlO和DMEM都是商品化的培養(yǎng)基，研究者可從市場購買。
[0049]分散劑配制方法是:稱量0.2克膠原酶和0.05克分散酶，充分溶解于100毫升磷酸緩沖液PBS中，使用無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。
[0050]原代成肌細胞生長培養(yǎng)基的配制方法是:在80毫升的FlO培養(yǎng)基中加入I毫升的青霉素與鏈霉素的混合液，再加入稱量和稀釋的堿性成纖維細胞生長因子bFGF，終濃度達到2.5-5.0ng/mL，加入19-20毫升的胎牛血清，混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C。
[0051]分化培養(yǎng)基的配制方法是:將94毫升的DMEM培養(yǎng)基與I毫升的青霉素和鏈霉素混合液混勻，加入5毫升的馬血清，混勻，無菌濾膜過濾，濾液保存在4°C ;或直接采用100%馬血清作分化培養(yǎng)基。
[0052]本發(fā)明中所使用的bFGF,其濃度不能低于2.5ng/mL。
[0053] 實施例2.小鼠成肌細胞的分離:
[0054]在冰上將出生2天以內(nèi)小鼠新鮮的四肢肌肉剪碎。肌肉碎片轉(zhuǎn)移進無菌的1.5mLEppendorf管中，加入0.5mL0.2%膠原酶collagenase與0.05%分散酶dispase混合液，繼續(xù)剪碎幾分鐘。在37°C上下顛倒搖動5-10min，1000rpm離心5分鐘，去上清。組織碎片轉(zhuǎn)入加有2mL collagenase/dispase混合液的15mL離心管中，封口。在37°C上下顛倒搖動10-20min。組織碎片消化成漿糊狀。轉(zhuǎn)入15mL離心管中，使用微量進樣器吸取組織碎片朝管壁吹打幾次，以破碎團塊。在37°C再次上下顛倒搖動5-10min。將上清液轉(zhuǎn)移入15mL管中，加入ImL血清以終止酶的消化。將組織碎片過濾80 μ m無菌尼龍網(wǎng)，以除去大的組織碎片。再次轉(zhuǎn)移至另一個15mL管中，1000rpm離心5min,除去上清,使用2-4mL FlO原代成肌細胞生長培養(yǎng)基重懸沉淀，將分離到的細胞放置于35-60mm膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[0055]本發(fā)明中所使用的新生小鼠為出生2天以內(nèi)的小鼠。從I克小鼠肌肉中大約能夠分離到I X IO8個成肌細胞或衛(wèi)星細胞。本發(fā)明中所使用的bFGF，其濃度不能低于2.5ng/mL。在15mL離心管中使用膠原酶和分散酶消化肌肉碎片時應(yīng)嚴密封好管口，防治液體漏出。
[0056]通過本發(fā)明技術(shù)可以得到較純的小鼠成肌細胞，包括大量的能夠發(fā)育成為成肌細胞的衛(wèi)星細胞-顯微鏡下呈現(xiàn)為圓球形細胞，以及大量的成肌細胞-顯微鏡下呈現(xiàn)為短梭形。肌球蛋白Myosin和MyoD是成肌細胞區(qū)別于成纖維細胞特征性表達的蛋白，我們以此來鑒定成肌細胞，如圖1和圖6所示。在圖1中，發(fā)綠色熒光的細胞是高表達MyoD蛋白的小鼠成肌細胞及衛(wèi)星細胞一成肌細胞的祖先細胞。實驗中使用抗鼠MyoD的一抗及FITC標記的二抗。在圖6中，將來自野生型-WT和MAMLl轉(zhuǎn)基因型-TG小鼠的成肌細胞誘導分化三天，然后收集成肌細胞和肌管，制備總蛋白，并用Western blot和抗體進行肌球蛋白檢測，Internal loading是選定的內(nèi)參。
[0057]實施例3.小鼠成肌細胞的維持和保存:
[0058]分離到的小鼠成肌細胞可以直接加90%胎牛血清和10%二甲基亞砜DMSO組成的細胞凍存液凍存細胞在液氮中，也可以直接進行肌管分化。待成肌細胞豐度達到70%時進行誘導分化。
[0059]細胞豐度超過80%后，成肌細胞分化能力減弱，豐度超過95%后，細胞基本上不能形成肌管。細胞豐度低于40%時，細胞數(shù)量偏少，也不利于分化。
[0060]實施例4小鼠成肌細胞的分化: [0061]4.1當成肌細胞生長到40%豐度時，將生長培養(yǎng)基換成由95-98%DMEM，2-5%馬血清，1%青霉素和鏈霉素組成的分化培養(yǎng)基。每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成。一般，誘導分化24小時后就有小的肌管形成，大約90%以上培養(yǎng)的細胞能夠分化成肌管。
[0062]4.2當成肌細胞生長到80%豐度時，將生長培養(yǎng)基換成100%馬血清組成的分化培養(yǎng)基。每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成。一般，誘導分化24小時后就有小的肌管形成，大約90%以上培養(yǎng)的細胞能夠分化成肌管。
[0063]馬血清能夠誘導成肌細胞分化并形成肌管。實驗中發(fā)現(xiàn)圓而小的衛(wèi)星細胞對新生小鼠成肌細胞分化和形成肌管是必需的，如圖3，4和5所示。如果沒有衛(wèi)星細胞，成肌細胞將繼續(xù)增殖并轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，它們不會分化和形成肌管。在正確的條件下，幾乎90%培養(yǎng)的成肌細胞能夠分化并形成肌管如圖5所示。如圖4所示，在將生長培養(yǎng)基換成含有2-5%馬血清的分化培養(yǎng)基一天后，野生型小鼠成肌細胞在培養(yǎng)皿中只形成幾個小的肌管，但是MAMLl轉(zhuǎn)基因小鼠的成肌細胞卻能形成更多的肌管。兩天后，有MAMLl轉(zhuǎn)基因成肌細胞形成的肌管變得更長和更粗壯了。三天后，其中有些肌管延伸得特別長。四天后，由野生型成肌細胞形成的肌管開始萎縮降解，那些由MAMLl轉(zhuǎn)基因成肌細胞形成的肌管也開始萎縮，但是較為溫和，并且它們能夠持續(xù)維持存在超過五天，然后才降解。
[0064]成肌細胞的分化對肌肉的形成是非常重要的。雖然已有文獻報道分離，培養(yǎng)和分化小鼠和雞的成肌細胞，但是其中的方法很難遵循，不能獲得我們所想要的理想實驗結(jié)果。如果只有幾個成肌細胞，即使它們在含有2-5%馬血清的分化培養(yǎng)基中也不會形成肌管。成肌細胞增殖非?？?，可以很高豐度存在，但這阻礙了成肌細胞形成肌管。特別是，在經(jīng)過幾輪傳代和長時間培養(yǎng)后，成肌細胞會喪失在體外形成肌管的能力。成纖維細胞對成肌細胞分化是有幫助的，而衛(wèi)星細胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)榉只芰芎玫某杉〖毎?br> [0065]實施例5MAML1轉(zhuǎn)基因小鼠腿部肌肉成肌細胞經(jīng)馬血清誘導形成肌管
[0066]5.1實驗動物，抗體和其它試劑
[0067]野生型和MAMLl轉(zhuǎn)基因的C57BL/6小鼠系由本研究室飼養(yǎng)。抗肌動蛋白(β-actin)抗體、抗肌球蛋白(Myosin)抗體和馬血清購自Sigma公司。FlO培養(yǎng)基、bFGF、蛋白酶K和RNase H購自Invitrogen公司。DMEM購自Cellgro公司，而胎牛血清,青霉素和鏈霉素購自HyClone公司，膠原酶(collagenase)、分散酶(dispase)和層粘蛋白(Iaminin)購自Gibco公司，膠原(collagen)購自Upstate公司。
[0068]5.2基因鑒定
[0069]剪取0.5cm的4周齡或新生的野生型或MAMLl轉(zhuǎn)基因小鼠尾巴，放入含有0.3mLDNA 消化緩沖液(50mM Tris-HCl ρΗ8.0, IOOmM EDTA ρΗ8.0, IOOmM NaCl 和 1%SDS)和 2 μ L蛋白酶K (20mg/mL,終濃度為0.5mg/mL)的Eppendorf管中，用封口膜封住，在50_55°C孵育過夜。然后在細胞裂解物中加入1.5μ L RNase H (0.5mg/mL，不含有DNA酶)，上下顛倒離心管5次，高速離心幾秒，然后放在37°C孵育15-60min。采用常規(guī)的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)方法提取基因組DNA，測量DNA濃度后使用PCR來鑒定MAMLl基因的表達。小鼠Maml I基因的PCR上游引物序列為5 ’ GCCACTCCCGCCACCAAA AAC3 ’，下游引物序列為5’ TTTCCGACCTCATTCTTTACA3’。人MAMLl基因的PCR上游引物(外顯子2)序列為5’CGAGCAGAACTCCCTGTTTC3’，下游引物(外顯子 4)序列為 5’ CCC TGT GAA CTG TCC AACCT3’?；蛐丸b定PCR循環(huán)是:I個循環(huán)(96°C lmin,62°C lmin,72°C 45sec)加35個循環(huán)(94°C 50sec,62°C lmin，72°C 45sec) ;72°C延長5min，終產(chǎn)物放置室溫。擴增條帶大小為MAMLl，415bp ;Mamll，534bp。
[0070]如圖2所不，Mamll表不小鼠mastermind-likel基因，MAMLl表不人類mastermind-likel基因，-表示陰性對照，+表示陽性對照，M是一個IOObp DNA marker。人類MAMLl基因插入了轉(zhuǎn)基因小鼠1，2，4，5和6的基因組中，相應(yīng)的PCR產(chǎn)物大小為415bp。內(nèi)源性的小鼠MamlI基因的PCR產(chǎn)物大小為534bp。小鼠3是個野生型，沒有插入人類MAMLl基因。人類MAMLl基因的mRNA序列有95%和小鼠的Mamll基因同源。
[0071]5.3分離和培養(yǎng)新生小鼠成肌細胞
[0072]將新生小鼠進行CO2和乙醇處理，去頭，剪取尾巴用于基因型鑒定。使用無菌的剪刀取下四肢，放入冰凍的HBBS或PBS緩沖液中。用無菌的鑷子將肌肉與皮膚和骨骼分離，更換一次HBBS或PBS緩沖液。在冰上將肌肉剪碎。肌肉碎片轉(zhuǎn)移進無菌的1.5mL Eppendorf管中，加入0.5mL0.2%colIagenase與0.05%dispase混合液，繼續(xù)剪碎幾分鐘。在37。。上下顛倒搖動5min進行酶的消化，1000rpm離心5分鐘,去上清。組織碎片轉(zhuǎn)入加有2mLcollagenase/dispase混合液的15mL離心管中，封口。在37°C上下顛倒搖動10_20min。組織碎片消化成漿糊狀后使用微量進樣器吸取組織碎片朝管壁吹打幾次，以破碎團塊。在37°C再次上下顛倒搖動5- 10min。將上清液轉(zhuǎn)移入15mL管中，加入ImL血清以終止酶的消化。將組織碎片過濾無菌的SOym尼龍網(wǎng)，以除去大的組織碎片。再次將濾液(含細胞)轉(zhuǎn)移至另一個15mL管中，1000rpm離心5min。除去上清，使用2_4mL FlO原代成肌細胞生長培養(yǎng)基重懸沉淀，將成肌細胞接種于直徑35-60mm，膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，于37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0073]5.4成肌細胞分化
[0074]當成肌細胞生長到80%豐度時，將生長培養(yǎng)基換成由95_98%DMEM，2-5%馬血清，1%青霉素和鏈霉素組成的分化培養(yǎng)基。每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成。
[0075]分離小鼠骨骼肌成肌細胞并傳代超過5次后，在2%馬血清中將其誘導分化三天，那么結(jié)果如圖3所示，只能形成少量的肌管，圖中標尺線表示40微米。
[0076]如果將野生型(WT)和MAMLl轉(zhuǎn)基因型(TG)成肌細胞兩次傳代(少于4次)后，將生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基后誘導成肌細胞分化五天，結(jié)果如圖4所示，會形成更多的肌管，圖中標尺線表示40微米。
[0077]如果從新生小鼠分離和培養(yǎng)骨骼肌成肌細胞后，直接將細胞在2%馬血清中誘導分化三天而不傳代，幾乎每一個成肌細胞和衛(wèi)星細胞都可以分化并形成肌管，并且所形成的肌管的數(shù)量是前面兩種方法的10倍以上，結(jié)果如圖5所示。WT表示野生型，TG表示MAMLl轉(zhuǎn)基因型，圖中標尺線表示40微米。[0078]5.5Western blot
[0079]分化后，使用裂解液(20mMTris-Cl，150mM NaCl，10%Glycerol，1%NP_40，0.4%NaF，IOOmM Na3V04，10 μ g/mL pepstatin，10 μ g/mL leupeptin，10 μ g/mL aprotinin，pH7.4)在冰上將成肌細胞進行裂解30min。10，OOOrpm離心10min。50 μ g總蛋白用于SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至polyvinylidene difluoride (PVDF)膜上，使用抗肌球蛋白抗體反應(yīng)，并用Pierce ECL反應(yīng)底物顯色發(fā)光，沖洗X光照片。
[0080]肌球蛋白是肌肉發(fā)生的一個標志物。如果將來自野生型(WT)和MAMLl轉(zhuǎn)基因型(TG)小鼠的成肌細胞誘導分化三天，然后收集成肌細胞和肌管，制備總蛋白，并用Westernblot和抗體進行肌球蛋白檢測，結(jié)果如圖6所示。在由野生型和MAMLl轉(zhuǎn)基因小鼠分離的成肌細胞形成的肌管中，MAMLl轉(zhuǎn)基因成肌細胞會表達更多的肌球蛋白。在第一天的肌球蛋白表達量是最多的，之后，蛋白表達量開始下降。這些結(jié)果也與表達MAMLl的C2C12細胞系得到的結(jié)果一致(Shen H，Genes Dev，2006，20 (6):675-688)。
[0081]上述應(yīng)用實例結(jié)果顯示，本發(fā)明所得到的小鼠成肌細胞可以形成很好的肌管，達到肌肉細胞發(fā)育研究和篩選藥物的要求。
[0082]參考文獻(References)
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【權(quán)利要求】
1.一種小鼠成肌細胞的制備方法，該方法包括下列步驟: A)將剛離體、并剪碎的小鼠腿部肌肉按體積比1:2加入分散劑，在37°C顛倒搖動5-10min, 1000rpm離心5min,去上清,得組織碎片； B)組織碎片中按體積比1:2加入分散劑，在37°C上下顛倒搖動5-10min成漿糊狀，按體積比1:10加入血清以終止酶消化； C)過濾80μ m無菌尼龍網(wǎng)，去除大的組織碎片，濾液1000rpm離心5min,去上清,得沉淀； D)沉淀置膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，加原代成肌細胞生長培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； E)當成肌細胞生長到40-80%豐度時，去生長培養(yǎng)基，加分化培養(yǎng)基，每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成； 其中，分散劑組成是0.2%膠原酶和0.05%分散酶，余量為PBS，pH=7.5-7.8;原代成肌細胞生長培養(yǎng)基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，2.5-5.0ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF組成；分化培養(yǎng)基由94-97%DMEM，2-5%馬血清，1%青霉素與鏈霉素組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的獲得方法，該方法包括下列步驟: A )將剛離體、并剪碎的小鼠腿部肌肉按體積比1: 2加入分散劑，在3 7 °C顛倒搖動5-10min, 1000rpm離心5min,去上清,得組織碎片； B)組織碎片中按體積比1:2加入分散劑，在37°C上下顛倒搖動5-10min成漿糊狀，按體積比1:10加入血清以終止酶消化； C)過濾80μ m無菌尼龍網(wǎng)，去除大的組織碎片，濾液1000rpm離心5min,去上清,得沉淀； D)沉淀置膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿中，加原代成肌細胞生長培養(yǎng)基，在37°C，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； E)當成肌細胞生長到80%豐度時，去生長培養(yǎng)基，加分化培養(yǎng)基，每天更換分化培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)成肌細胞，直至肌管被誘導形成； 其中，分散劑組成是0.2%膠原酶和0.05%分散酶，余量為PBS，pH=7.8;原代成肌細胞生長培養(yǎng)基由80%F10，19%FBS, 1%青霉素和鏈霉素，和5.0ng/mL堿性成纖維細胞生長因子bFGF組成；分化培養(yǎng)基 100%馬血清。 3)權(quán)利要求1或2制備的成肌細胞在研究肌管形成及肌肉發(fā)育細胞、分子機理方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N5/073GK103881966SQ201410157261
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】劉文斌, 張曉東, 杜潤蕾, 陳艷 申請人:武漢大學