巰基化單鏈dna在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了巰基化單鏈DNA在增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增中的應(yīng)用，即：利用巰基化單鏈DNA增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增的方法：將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述適量指在20μL反應(yīng)體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小于15μM。所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件：（1）為一段與靶序列不互補(bǔ)、非同源的任意序列；（2）Tm值≥37.7℃；（3）至少一端含巰烷基基團(tuán)SH-C6H12-。本發(fā)明具有優(yōu)化擴(kuò)增的效果顯著、制備簡便、適用性廣、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)；對基因的檢測與克隆、遺傳分析、醫(yī)學(xué)診斷、基因芯片等領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價值。
【專利說明】巰基化單鏈DNA在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及巰基化單鏈DNA在增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增中的應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PloymeraseChainReaction, PCR),又稱體外酶促基因擴(kuò)增，是一種在體外模擬自然DNA復(fù)制的核酸擴(kuò)增技術(shù)，機(jī)制非常復(fù)雜，在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導(dǎo)下，在短時間內(nèi)可以將目的基因擴(kuò)增至百萬倍。該技術(shù)由K.Mullis于1983~1984年發(fā)明，在核酸序列分析中得到廣泛應(yīng)用。經(jīng)過30年的發(fā)展，PCR反應(yīng)已經(jīng)發(fā)展成一項(xiàng)成熟技術(shù)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)中失誤率較小，然而在實(shí)際應(yīng)用時總會出現(xiàn)一定程度的干擾副反應(yīng)，如堿基錯配、引物間形成二聚體等引起的擴(kuò)增等。這些副反應(yīng)輕則引起非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不高，重則可能造成擴(kuò)增失敗。
[0003]PCR反應(yīng)組分和程序的優(yōu)化是提高PCR擴(kuò)增特異性的重要途徑。多年以來，眾多研究人員對PCR反應(yīng)組分的優(yōu)化做了大量工作，如向反應(yīng)體系中加入DMS0、甘油、甜菜堿、納米金屬等可以在一定程度上改善非特異性擴(kuò)增問題。但在實(shí)際應(yīng)用中，有些效果并不是很理想，比如過多的納米金屬等會抑制聚合酶的活性，造成擴(kuò)增效率降低。
[0004]經(jīng)過對現(xiàn)有專利與文獻(xiàn)的檢索，發(fā)現(xiàn)中國專利申請CN101983241A中提到以下內(nèi)容:將修飾(包括巰基修飾 、羥基修飾)的至少部分互補(bǔ)的寡核苷酸與靶核酸的鏈雜交，可用于靶核酸的PCR擴(kuò)增，由于已證實(shí)的在羥基核堿基或巰基核堿基與靶核酸的核堿基之間可以發(fā)生更穩(wěn)定的氫鍵結(jié)合，因此可達(dá)到增強(qiáng)修飾序列與靶序列結(jié)合效率的目的。在該專利申請?zhí)岬降脑擁?xiàng)應(yīng)用中，其所述的“修飾的至少部分互補(bǔ)的寡核苷酸”實(shí)際上用作PCR反應(yīng)中的引物，對引物進(jìn)行羥基或巰基或其他基團(tuán)修飾的目的是增加引物與靶序列的結(jié)合效率，并不具備增強(qiáng)PCR特異性的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種可有效增強(qiáng)核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增的方法，該方法是通過向反應(yīng)體系中加入巰基化單鏈DNA實(shí)現(xiàn)的，其優(yōu)化擴(kuò)增的效果顯著，制備簡便，適用性廣，成本低，易操作。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]巰基化單鏈DNA在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的應(yīng)用:本發(fā)明的 申請人:通過實(shí)驗(yàn)研究證明，向PCR反應(yīng)體系中添加巰基化寡核苷酸，即巰基化單鏈DNA，可實(shí)現(xiàn)對PCR體系的優(yōu)化:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并與未添加巰基化單鏈DNA的PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未添加巰基化單鏈DNA的PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物中，出現(xiàn)了非常嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增，而添加巰基化單鏈DNA的PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物中，非特異性擴(kuò)增完全消失，特異性得到明顯改善。[0008]所述巰基化單鏈DNA，是指5’或3’端的核苷酸用巰烷基(SH-C6H12-)修飾的寡核苷酸，該寡核苷酸的Tm值需> 37.7V (Tm值使用生物學(xué)軟件01igo7.4計算)。
[0009]所述巰基化單鏈DNA，其堿基的序列無特定要求，是一段與靶序列不互補(bǔ)的隨機(jī)序列，在PCR反應(yīng)中不做為引物，也不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物鏈。
[0010]進(jìn)一步地，所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件:(1)為一段與靶序列不互補(bǔ)(非同源)的任意序列；(2) Tm值≥37.7 0C ；(3)至少一端含巰烷基基團(tuán)(SH-C6H12-X
[0011 ] 所述巰基化單鏈DNA，可由生物公司依據(jù)引物合成方法合成并進(jìn)行巰基修飾，為常規(guī)方法。
[0012]所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指分子生物學(xué)中常用PCR擴(kuò)增，包括常規(guī)PCR、復(fù)雜模板PCR 等。
[0013]所述PCR體系參見各商業(yè)ExTaq聚合酶說明書。
[0014]一種利用巰基化單鏈DNA增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增的方法，如下:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述適量指在20 μ L反應(yīng)體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小于15 μ M0
[0015]比如，常用PCR擴(kuò)增程序按照現(xiàn)有技術(shù)設(shè)定如下:95°C預(yù)熱5min ;95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，35個循環(huán)；其中循環(huán)數(shù)、退火溫度、退火時間、延伸時間可根據(jù)不同PCR儀器和不同引物需要而做適當(dāng)改變，最后72°C延伸7min。
[0016]所述瓊脂糖凝膠電泳參照現(xiàn)有技術(shù)，一般包含以下步驟:
[0017](I)制備2%的瓊脂糖凝膠(含染色劑溴乙錠)；
[0018](2) PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，同時點(diǎn)分子量標(biāo)記作為對照；
[0019](3)加以4~5V/cm的電壓，電泳，30min ；
[0020](4)凝膠成像觀察并分析結(jié)果。
[0021]本發(fā)明利用巰基化單鏈DNA增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增的方法，與現(xiàn)有方法相比，具有優(yōu)化效果顯著、制備簡便、適用性廣、成本低、易操作等優(yōu)點(diǎn)。巰基化單鏈DNA穩(wěn)定性好，可在4°C長期保存不會降解或失活，使用極為方便，只需適量加入到PCR體系中即可。本發(fā)明中使用的巰基化單鏈DNA不依賴堿基序列，因此適用廣泛，可直接用于各種基因的PCR擴(kuò)增而不需要針對性設(shè)計。本發(fā)明發(fā)展的PCR擴(kuò)增方法對多種PCR體系均具有優(yōu)化作用，適用于各種PCR擴(kuò)增，對基因的檢測與克隆、遺傳分析、醫(yī)學(xué)診斷、基因芯片等領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1:實(shí)施例1中巰基化單鏈DNA對CaMV35S基因片段PCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)化擴(kuò)增效果圖。
[0023]圖2:實(shí)施例2中巰基化單鏈DNA對復(fù)雜植物基因組轉(zhuǎn)基因玉米M0N810PCR擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)化擴(kuò)增效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0025]實(shí)施例1巰基化單鏈DNA優(yōu)化擴(kuò)增CaMV35S基因片段[0026](I)PCR反應(yīng)體系的配置:
[0027]反應(yīng)體系含2XPremixExTaqlOy L，上、下游引物(l0.moir1)各IyL (序列為:F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGC, Rl:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC,如 SEQIDN0.1、2 所示)，含CaMV35S基因的DNA (為來源于轉(zhuǎn)CaMV35S基因玉米的基因組總DNA) 2 μ L，其中，PremixExTaq購自大連TaKaRa公司。
[0028]各樣品的配置如下:
[0029]常規(guī)PCR體系配置2管，編號為1、2，用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20 μ L ;
[0030]添加未巰基化單鏈DNA的體系配置2管，編號為5、6，每管分別添加未巰基化單鏈DNA至終濃度20 μ Μ,再用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20 μ L ;所述未巰基化單鏈DNA的序列為GTATGTGCCCATGTG,如 SEQIDN0.3 所示；
[0031]添加巰基化單鏈DNA的體系配置7管，編號為3、4、7、8、9、10、11，每管分別添加不同序列的巰基化單鏈DNA至終濃度20 μ Μ，再用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20 μ L ;每管所添加的巰基化單鏈DNA的序列如下:
[0032]編號3:HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0033]編號4:HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,同上；
[0034]編號7:HS-ssDNAl: HS-C6H12_CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0035]編號8:HS-ssDNA2:HS-C6H12_GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示；
[0036]編號9:HS-ssDNA3:HS-C6H12_ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示；
[0037]編號10:HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT,核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示；
[0038]編號11:HS-ssDNA5:HS-C6H12_TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示；
[0039]添加巰基化單鏈DNA的優(yōu)化體系配置6管，編號12、13、14、15、16、17，Tm值分別為12.90C，30.30C，37.7V，47.4°C，53°C，59.1°C ;具體Tm值及所添加的巰基化單鏈DNA序列如下:
[0040]編號12:12.90C ；HS-C6H12-GTATGTGC,核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示；
[0041]編號13:30.30C ;HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示；
[0042]編號14:37.70C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示；
[0043]編號15:47.40C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0044]編號16:53°C ;HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示；
[0045]編號17:59.10C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG,核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所 /Jn ο
[0046](2)利用PCR技術(shù)對模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 5min ；95 °C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)；72°C 7min。
[0047](3)對擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0048]擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其中，各泳道所對應(yīng)的樣品如下:
[0049]M:分子量標(biāo)記(北京天根公司MarkerI,自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)；
[0050]1-2:常規(guī) PCR 體系；[0051 ] 3-4:添加巰基化單鏈DNA的優(yōu)化改進(jìn)體系；
[0052]5-6:添加未巰基化單鏈DNA的對照體系；
[0053]7-11:分別添加 HS-ssDNA1、HS-ssDNA2、HS-ssDNA3、HS-ssDNA4、HS-ssDNA5 的巰基化單鏈DNA優(yōu)化改進(jìn)體系；
[0054]12-17:分別添加巰基化單鏈 DNATm 值為 12.9°C,30.3°C, 37.7°C,47.4°C，53°C，59.1°C的優(yōu)化改進(jìn)體系。
[0055]該擴(kuò)增的目的基因片段為195bp，由圖1可見，在常規(guī)PCR中出現(xiàn)了嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)為2條非特異性條帶(大小約為450bp和550bp，泳道1_2)，加入Tm≥37.7V的隨機(jī)巰基化單鏈DNA的PCR體系非特異性擴(kuò)增完全消失(泳道3-4，7-11，14-17)，而加入未巰基化單鏈DNA和Tm 值< 37.7 V的巰基化單鏈DNA的對照體系非特異性擴(kuò)增依然存在(泳道 5-6，12-13)。
[0056]實(shí)施例2巰基化單鏈DNA優(yōu)化擴(kuò)增復(fù)雜植物基因組轉(zhuǎn)基因玉米M0N810
[0057](I) PCR反應(yīng)體系的配置:
[0058]反應(yīng)體系含2 XPrem ixExTaqlO μ L，上、下游引物(10 μ molL-1)各 I μ L (Fl:CAAGTGTGCCCACCACAGC, Rl:GCAAGCAAATTCGGAAATGAA，如 SEQIDN0.14、15 所示)，轉(zhuǎn)基因玉米M0N810基因組DNA2 μ L，其中，PremixExTaq購自大連TaKaRa公司。
[0059]各樣品的配置如下:
[0060]常規(guī)PCR體系配置3管，編號為1、2、3，用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20μ L ;
[0061]添加巰基化單鏈DNA的體系配置3管，編號為4、5、6，每管分別添加序列不同的巰基化單鏈DNA至終濃度為20 μ Μ，再用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20 μ L ;所述巰基化單鏈DNA的序列如下:
[0062]編號4:HS-ssDNAl: HS-C6H12_CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0063]編號5:HS-ssDNA2:HS-C6H12_GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示；
[0064]編號6:HS-ssDNA3:HS-C6H12_ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示；
[0065]添加未巰基化單鏈DNA的體系配置I管，編號為7，添加未巰基化單鏈DNA至終濃度為20 μ M，再用雙蒸水補(bǔ)足至總體積20 μ L ;所述未巰基化單鏈DNA的序列為:CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示；
[0066]添加巰基化單鏈DNA的優(yōu)化體系配置6管，編號8_13，分別添加巰基化單鏈DNATm值為12.9。。，30.3。。，37.7。。，47.4。。，53。。，59.1。。;具體Tm值及所添加的巰基化單鏈DNA序列如下:
[0067]編號8:12.90C ；HS-C6H12-GTATGTGC,核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示；
[0068]編號9:30.30C ；HS-C6H12-GTATGTGCCC,核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示；
[0069]編號10:37.70C ;HS-C6H12_GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示；
[0070]編號11:47.40C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG,核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示；
[0071]編號12:53°C ;HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示；
[0072]編號13:59.10C ；HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG,核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所
/Jn ο
[0073](2)利用PCR技術(shù)對模板分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 5min ；95 °C 30s，58°C 30s, 72°C 30s，35 個循環(huán)；72°C 7min。[0074](3)對擴(kuò)增后的DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0075]擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，其中，各泳道所對應(yīng)的樣品如下:
[0076]M:分子量標(biāo)記(北京天根公司MarkerI,自下至上分別為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp)；
[0077]1-3:常規(guī) PCR 體系；
[0078]2:加入Tm=O0C的隨機(jī)非同源巰基化單鏈DNA的優(yōu)化改進(jìn)體系(GTATGT)；
[0079]4-6:分別為添加HS-ssDNAl、HS_ssDNA2、HS_ssDNA3的巰基化單鏈DNA優(yōu)化改進(jìn)體系；
[0080]7:添加序列為CATACGCTCCAGACC的未巰基化單鏈DNA的對照體系；
[0081 ] 8-13:分別添加巰基化單鏈 DNATm 值為 12.9 °C，30.3 °C，37.7 °C，47.4 °C，53 °C，59.1°C的優(yōu)化改進(jìn)體系。
[0082] 該擴(kuò)增的目的基因片段為106bp，由圖2可見，在常規(guī)PCR中出現(xiàn)了嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)為2條非特異性條帶(200bp上下，泳道1-3)，加入Tm≥37.7°C的隨機(jī)巰基化單鏈DNA的PCR體系非特異性擴(kuò)增完全消失(泳道4-6，10-13)，而加入未巰基化單鏈DNA和1'111值< 37.7°C的巰 基化單鏈DNA的對照體系非特異性擴(kuò)增依然存在(泳道7_9)。
【權(quán)利要求】
1.巰基化單鏈DNA在增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述巰基化單鏈DNA，滿足以下條件:(I)為一段與靶序列不互補(bǔ)、非同源的任意序列；(2) Tm值> 37.7°C; (3)至少一端含巰烷基基團(tuán) SH-C6H12-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:具體應(yīng)用方法為:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述適量指在20 μ L反應(yīng)體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小于15 μ Mo
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述巰基化單鏈DNA包括但不限于以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGT GCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
5.一種利用巰基化單鏈DNA增強(qiáng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異性擴(kuò)增的方法，其特征在于:將適量巰基化單鏈DNA加入PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述適量指在20 μ L反應(yīng)體系中巰基化單鏈DNA的終濃度不小于15 μ M0
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述巰基化單鏈DNA包括但不限于以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
7.巰基化單鏈DNA，其特征在于:所述巰基化單鏈DNA滿足以下條件:(I)為一段與靶序列不互補(bǔ)、非同源的任意序列；(2)Tm值≤37.7°C; (3)至少一端含巰烷基基團(tuán)SH_C6H12-。
8.權(quán)利要求7所述的巰基化單鏈DNA，其特征在于:所述巰基化單鏈DNA包括但不限于以下序列: HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.3 所示； HS-ssDNA1:HS-C6H12-CATACGCTCCAGACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.4 所示； HS-ssDNA2:HS-C6H12-GCCCTCTACTCCACC，核苷酸序列如 SEQIDN0.5 所示； HS-ssDNA3:HS-C6H12-ACAGCCTCACTGGAA，核苷酸序列如 SEQIDN0.6 所示； HS-ssDNA4:HS-C6H12-TGACTCCATCATCTGTT，核苷酸序列如 SEQIDN0.7 所示； HS-ssDNA5:HS-C6H12-TAGGACAATCCGTATCT，核苷酸序列如 SEQIDN0.8 所示； HS-C6H12-GTATGTGC，核苷酸序列如 SEQIDN0.9 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCC，核苷酸序列如 SEQIDN0.10 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCAT，核苷酸序列如 SEQIDN0.11 所示； HS-C6H12-GTATGTGCCCATGTGTTG，核苷酸序列如 SEQIDN0.12 所示； HS-C6H12-GTATGTGC CCATGTGTTGCG，核苷酸序列如 SEQIDN0.13 所示。
【文檔編號】C12N15/11GK103993005SQ201410157936
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】路興波, 張廣遠(yuǎn), 孫紅煒, 李凡, 楊淑珂, 高瑞, 徐曉輝 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所