一種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法，屬于核酸純化【技術(shù)領(lǐng)域】。首先向恰當(dāng)保存的組織材料中加入添加新型指示劑的酚胍鹽裂解液，之后用勻漿器將樣本粉碎均勻，加入氯仿使液體充分混勻后，離心轉(zhuǎn)移上清至新管中，加入異丙醇沉淀核糖核酸，之后用75%的乙醇洗滌沉淀，最后用無(wú)核糖核酸酶的水溶解核糖核酸。本發(fā)明方法可用于提取動(dòng)物、植物組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌以及病毒的總RNA，提取的RNA純度高，基因組殘留少，完整性好，適用于下游多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法，屬于核酸純化【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]純度高、完整性好的核糖核酸(RNA)的提取是分子生物學(xué)研究、臨床以及生物技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。目前核糖核酸(RNA)提取常用的方法有:吸附法和酚仿抽提法。吸附法多見(jiàn)于硅基質(zhì)膜吸附、離子交換樹(shù)脂以及磁珠等材料，該法使得RNA在高鹽條件下專(zhuān)一性的與吸附材料結(jié)合，蛋白等雜質(zhì)不能結(jié)合而被洗脫，鹽類(lèi)則被乙醇漂洗去除，最后用去核糖核酸酶的水將核糖核酸洗脫下來(lái)；酚仿抽提法結(jié)合高濃度異硫氰酸胍鹽類(lèi)，可達(dá)到充分裂解組織樣本并且強(qiáng)烈抑制核糖核酸酶(RNase)的目的，勻漿液分層:上層水相為核糖核酸(RNA)，中間層為脫氧核糖核酸(DNA)，下層有機(jī)相為蛋白質(zhì)，之后經(jīng)異丙醇將水相總核糖核酸沉淀下來(lái)，用75%的乙醇洗滌核糖核酸沉淀去除鹽類(lèi)即可，最后用去核糖核酸酶(RNase)的水溶解核糖核酸，所得核糖核酸完整性好，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化RNA生產(chǎn)十分有用。但是此法經(jīng)常由于操作原因?qū)⒅虚g相脫氧核糖核酸一同轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致所得核糖核酸中脫氧核糖核酸殘留較多，嚴(yán)重影響后續(xù)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)，因此，一種界相分明的新型酚胍鹽裂解液(TRIzol)的研發(fā)及其應(yīng)用對(duì)于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提出一種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法，利用含有指示劑的裂解液充分裂解組織樣本，有效抑制核糖核酸酶(RNase)的活性，其中的指示劑用于明確分離不同界相，以保證提取過(guò)程的酸性環(huán)境，從而達(dá)到RNA的最大提取得率。
[0004]本發(fā)明提出的使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法，包括以下各步驟:
[0005](I)向30-50毫克動(dòng)物組織或植物組織中加入I毫升含有指示劑的酚胍鹽裂解液，用勻漿器勻漿樣本，或液氮研磨，得到勻漿液；
[0006](2)將勻衆(zhòng)液在室溫下放置5分鐘,使得核酸與蛋白充分分尚；
[0007](3)向步驟(2)的勻漿液中加入0.2毫升氯仿，顛倒混勻15秒，使氯仿與勻漿液充分混勻，室溫下放置3分鐘，進(jìn)行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為15分鐘，使水相與有機(jī)相徹底分離；
[0008](4)經(jīng)步驟(3)離心后的溶液分為三層，上層為含有核糖核酸(RNA)的無(wú)色水相，中間層為含有脫氧核糖核酸(DNA)的白色界相，下層為含有蛋白質(zhì)的紅色有機(jī)相，將上層含有核糖核酸的無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至試管中；
[0009](5)在步驟(4)的試管中加入0.5毫升異丙醇沉淀核糖核酸(RNA)，室溫下保持10分鐘，進(jìn)行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為10分鐘；
[0010](6)將步驟(5)離心后的上清液棄掉，保留核糖核酸(RNA)沉淀，向核糖核酸沉淀中加入I毫升75%乙醇洗滌，進(jìn)行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為5分鐘；
[0011](7)棄掉步驟(6)的上清液,加入去核糖核酸酶(RNase-free)的水,用移液槍反復(fù)吹打幾次，溶解核糖核酸(RNA)。
[0012]上述方法中，所述的含有指示劑的酚胍鹽裂解液中的各組分為:
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種使用含有指示劑的酚胍鹽裂解液提取核糖核酸的方法，其特征在于該方法包括以下各步驟: (1)向30-50毫克動(dòng)物組織或植物組織中加入I毫升含有指示劑的酚胍鹽裂解液，用勻漿器勻漿樣本，或液氮研磨，得到勻漿液； (2)將勻漿液在室溫下放置5分鐘，使得核酸與蛋白充分分離； (3)向步驟(2)的勻漿液中加入0.2毫升氯仿，顛倒混勻15秒，使氯仿與勻漿液充分混勻，室溫下放置3分鐘，進(jìn)行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為15分鐘，使水相與有機(jī)相徹底分離； (4)經(jīng)步驟(3)離心后的溶液分為三層，上層為含有核糖核酸(RNA)的無(wú)色水相，中間層為含有脫氧核糖核酸(DNA)的白色界相，下層為含有蛋白質(zhì)的紅色有機(jī)相，將上層含有核糖核酸的無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至試管中； (5)在步驟(4)的試管中加入0.5毫升異丙醇沉淀核糖核酸(RNA)，室溫下保持10分鐘，進(jìn)行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為10分鐘； (6)將步驟(5)離心后的上清液棄掉，保留核糖核酸(RNA)沉淀，向核糖核酸沉淀中加入I毫升75%乙醇洗滌，進(jìn) 行離心，離心分離的轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的溫度為4攝氏度，離心時(shí)間為5分鐘； (7)棄掉步驟(6)的上清液，加入去核糖核酸酶(RNase-free)的水，用移液槍反復(fù)吹打幾次，溶解核糖核酸(RNA)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的含有指示劑的酚胍鹽裂解液中的各組分為:異巰氰酸K90~110克 異硫氰酸鑛3O~40 3?苯酚400-550毫升甘汕50-70毫升 無(wú)水KS酸納8~ IO克指示劑10~20毫克 上述組分按量稱(chēng)重后，用冰醋酸調(diào)PH值至4-5，定容至1000毫升，所述的指示劑為中性紅、甲基紅中的任何一種。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103952399SQ201410158138
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】崔黎, 俞萍, 李曉晨, 孫克非 申請(qǐng)人:天根生化科技（北京）有限公司