用于基因治療的修飾的因子viii和因子ix基因和載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于基因治療的修飾的因子VIII和因子IX基因和載體。本發(fā)明涉及用于包含在嵌合病毒載體中的修飾和優(yōu)化因子VIII或因子IX核酸。使用這種核酸可用于血友病的治療。
【專利說明】用于基因治療的修飾的因子VI I I和因子IX基因和載體
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年6月19日、中國國家申請(qǐng)?zhí)枮?00780029324. 6、發(fā)明名 稱為"用于基因治療的修飾的因子VIII和因子IX基因和載體"申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0003] 本申請(qǐng)要求2006年6月19日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序號(hào)60/760, 465、2006年 9月1日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)序號(hào)60/824, 338和2006年9月26日提交的美國臨時(shí)專 利申請(qǐng)序號(hào)60/847, 337的優(yōu)先權(quán)；它們的內(nèi)容在此以其全文引為參考。
[0004] 發(fā)明背景 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及修飾的因子VIII (FVIII)和因子XI (FIX)基因、包含修飾基因的核 酸載體、包含修飾基因的優(yōu)化病毒衣殼，以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型血 友病的治療中使用修飾基因的方法。
[〇〇〇6] 相關(guān)技術(shù)討論
[0007] 血友病是血液不能充分凝結(jié)的血液疾病。當(dāng)血友病患者受傷時(shí)，凝血不足導(dǎo)致出 血過多。血友病是遺傳性凝血疾病，其特征為凝血不足和出血過多。幾種類型的遺傳性血 友病以受影響的凝血因子區(qū)分。A型血友病由缺乏凝血因子VIII (FVIII)引起。B型血友 病由缺乏凝血因子IX (FIX)引起。
[0008] B型血友病是X連鎖的疾病，每30000個(gè)男性中大約有1人患有這種疾病。重型B 型血友?。ㄕ?B型血友病人群的大約60%)可能致命。關(guān)節(jié)和肌肉中的自發(fā)性出血可能導(dǎo)致 永久性殘疾。
[0009] 基因治療已經(jīng)被提議作為治療模式，用于在血友病患者中補(bǔ)充缺乏的凝血因子。 但是，與基因治療的許多領(lǐng)域一樣，理論遠(yuǎn)比成功有效的應(yīng)用簡(jiǎn)單。在以前設(shè)計(jì)適合治療人 類的FVIII或FIX構(gòu)建物的嘗試中，已經(jīng)遇到了許多困難。
[0010] 例如，Manno等報(bào)道，在I期研究中向人類對(duì)象的肝臟以AAV2介導(dǎo)投送FIX，導(dǎo)致 生物活性FIX水平的表達(dá)(Manno等，Blood, (2006)，pp. )。Connelly等報(bào)道，用編碼人類 FVIII的腺病毒載體治療FVIII缺陷小鼠，導(dǎo)致生物活性人類FVIII的表達(dá)（Connelly等， Blood, Vol. 91，No. 9 (1998)，ρρ· 3273-3281)。Sarker 等報(bào)道，使用 AAV8 血清型與 FVIII 的 組合在小鼠模型中校正了血漿FVIII活性（Sarkar等，Blood, Vol. 103, No. 4 (2004)，ρρ· 125 3-1260)。
[0011] 但是，與基因治療的許多領(lǐng)域相同，理論遠(yuǎn)比成功有效的實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單。實(shí)現(xiàn)基因治療 技術(shù)的困難包括在使用病毒作為基因載體中遇到的難題。盡管因?yàn)椴《究捎糜谵D(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞， 導(dǎo)致蛋白在體內(nèi)表達(dá)，從而可有效用作基因載體，但是包被病毒粒子的蛋白可能激活身體 的免疫系統(tǒng)。
[0012] 因此，對(duì)于有效表達(dá)足夠量靶蛋白以將所需病毒載體的劑量減少到可耐受水平的 系統(tǒng)，存在著需求。
[0013] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0014] 本發(fā)明提供了修飾的因子VIII (FVIII)和因子XI (FIX)基因、包含修飾基因的 核酸載體、包含修飾基因的優(yōu)化病毒衣殼、以及在FVIII和FIX缺陷例如A型血友病和B型 血友病的治療中使用修飾基因的方法。
[0015] 一方面，本發(fā)明提供了在人類對(duì)象中治療血友病的優(yōu)化FVIII或FIX基因，其中該 優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾，增加了 CG序列并減少了順式基序。優(yōu)選優(yōu)化基因包含序列SEQ ID N0:7、12 或 15。
[0016] 另一方面，本發(fā)明提供了在人類對(duì)象中治療血友病的含有優(yōu)化FVIII或FIX基因 的嵌合病毒載體，其中優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾，增加了 CG序列并減少了順式基序。優(yōu)選嵌合 病毒載體包括旁側(cè)帶有AAV TRS例如SEQ ID N0. 2和SEQ ID N0. 9的SEQ ID N0. 7或其互 補(bǔ)序列，其中SEQ ID NO. 2的序列位于其5'末端，SEQ ID NO. 9位于其3'末端。嵌合病毒 載體可以包含SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供了在對(duì)象中治療血友病的方法，該方法包括：
[0018] a.提供至少一個(gè)重組病毒載體，其含有用于包含修飾的FVIII或FIX基因的核苷 酸序列；以及
[0019] b.在使所述FVIII或FIX核苷酸序列以在對(duì)象中產(chǎn)生治療有效量FVIII或FIX水 平進(jìn)行表達(dá)的條件下，給對(duì)象施用該重組病毒載體。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供了用修飾的FVIII或FIX基因轉(zhuǎn)導(dǎo)肌細(xì)胞或肝細(xì)胞的方法， 該方法包括將肝細(xì)胞與重組生物納米顆粒（BNP)病毒載體相接觸，該載體含有包含SEQ ID NO. 7序列的優(yōu)化FIX基因，或包含SEQ ID NO:12或15序列的優(yōu)化FVIII基因。
[0021] 基因轉(zhuǎn)移在了解疾病狀態(tài)和為疾病狀態(tài)提供治療中有顯著的潛在應(yīng)用。有許多遺 傳疾病，其中缺陷的基因是已知的并已被克隆?？偟膩碚f，上述疾病狀態(tài)可歸為兩類：缺陷 狀態(tài)，通常是酶，一般以隱性方式遺傳；以及不平衡狀態(tài)，可能涉及調(diào)控或結(jié)構(gòu)蛋白，典型以 顯性方式遺傳。對(duì)于缺陷狀態(tài)的疾病來說，基因轉(zhuǎn)移可以用于將正常的基因帶入患病組織 進(jìn)行替代治療，以及使用反義突變產(chǎn)生疾病的動(dòng)物模型。對(duì)于不平衡疾病狀態(tài)來說，基因轉(zhuǎn) 移可以用于在模型系統(tǒng)中產(chǎn)生疾病狀態(tài)，然后可以使用它來致力于抵消疾病狀態(tài)。因此，本 發(fā)明的方法允許治療遺傳疾病。在本文中使用時(shí)，通過部分或完全糾正引起疾病或使疾病 更加嚴(yán)重的缺陷或不平衡，來治療疾病狀態(tài)。
[0022] 因此，本發(fā)明的另一方面提供了治療血友病的療法，包括：基于施用優(yōu)化FVIII或 FIX基因的編碼核苷酸序列的基因治療。
[0023] 另一方面，本發(fā)明提供了含有編碼優(yōu)化FVIII或FIX基因或其片段的多核苷酸的 表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體是包含AAV2衣殼2. 5的序列（SEQ ID N0. 17)的 AVV病毒載體。
[0024] 另一方面，本發(fā)明提供了用編碼本發(fā)明的優(yōu)化FVIII或FIX肽的多核苷酸感染的 重組宿主細(xì)胞。
[0025] 另一方面，本發(fā)明考慮了制備優(yōu)化FVIII或FIX肽或其片段的方法，包括：
[0026] a.用編碼FVIII或FIX肽或其片段的多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞； 以及
[0027] b.將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞維持在足以表達(dá)肽的生物學(xué)條件下。
[0028] 另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的優(yōu)化FVIII或FIX肽或其片段在用于治療血友病 的藥物中的應(yīng)用。
[0029] 本發(fā)明還提供了藥物組合物，其含有用于在人類對(duì)象中治療血友病的優(yōu)化FVIII 或FIX基因并與可藥用的載體組合，其中優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾，增加了 CG序列并減少了順 式基序。優(yōu)化基因可以包含序列SEQ ID N0:7、12或15。
[0030] 從下面的具體說明、附圖和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將更加顯見。
[0031] 附圖簡(jiǎn)述
[0032] 圖1顯示了體外GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)lxl09vg (病毒基因組）HPMC530, 000個(gè)細(xì)胞。
[0033] 圖2顯示了單鏈和雙鏈基因組的體外GFP劑量響應(yīng)。
[0034] 圖3顯示了原代和人類原代骨骼肌細(xì)胞系的表達(dá)水平。
[0035] 圖4顯示了感染后24小時(shí)，lxl09vg/滴度感染的APTT HPMC體外裂解物。
[0036] 圖5顯示了 hFIX體外HPMC細(xì)胞裂解物表達(dá)。
[0037] 圖 6 顯示了 R333Q 模型感染后 6 周，針對(duì) ssBNP2. 5vs. ssAAV2 (6A(1, 2 和 3))和 dsBNP2. 5vs. ssAAV2 (6B(1, 2 和 3))的 FIX 體內(nèi)數(shù)據(jù)。
[0038] 圖7顯示了在C57Blk6中使用帶有FIX轉(zhuǎn)基因的ssAAV2、dsBNP-l. 1和dsBNP2. 5 進(jìn)行門靜脈給藥的結(jié)果。
[0039] 圖8顯示了優(yōu)化hFIX的密碼子序列。
[0040] 圖9顯示了野生型vs.優(yōu)化hFIX編碼序列的體外表達(dá)。
[0041] 圖10顯示了 hFIX的表達(dá)以及Avigen病毒（4xlOnvg/kg)與AAV2dshFIX和優(yōu)化 hFIX的比較。
[0042] 圖 11 顯示了 hFIX 的表達(dá)，比較了 Avigen 病毒（8xl01Qvg/kg)與 AAV2dshFIX 和優(yōu) 化hFIX。
[0043] 圖12顯示了使用AAV1、AAV2和BNP-2. 5的體外中和抗體滴度水平。
[0044] 圖13顯示了使用AAV1、AAV2和BNP-2. 5的體內(nèi)中和抗體滴度水平。
[0045] 圖14顯示了本發(fā)明的優(yōu)選載體。
[0046] 圖15顯不了圖14的載體的序列（SEQ ID N01)，并顯不了粗斜體大與字母：左突 變ITR (SEQ ID N0:2);粗體小寫字母：TTR啟動(dòng)子（SEQ ID N0:3);正常小寫字母：填充序 列（SEQ ID N0:4);粗體下劃線小寫字母：MVM內(nèi)含子（SEQ ID N0:5);正常小寫字母：填充 序列（SEQ ID N0:6);粗斜體下劃線大寫字母：優(yōu)化hFIX cDNA (SEQ ID N0:7);粗體小寫字 母：牛激素多聚A (SEQ ID N0:8)和粗斜體大寫字母：右ITR (SEQ ID N0:9)。
[0047] 圖16顯示了相對(duì)于SEQ ID NO: 19 (未優(yōu)化）和SEQ ID NO: 12 (優(yōu)化)，歸于某種 質(zhì)量（quality)級(jí)別的序列密碼子的百分率。
[0048] 圖17顯示了 SEQ ID N0:12相對(duì)于未優(yōu)化者（SEQ ID N0:19)的密碼子質(zhì)量加強(qiáng)。
[0049] 圖18顯示了 GC含量從未優(yōu)化時(shí)（SEQ ID N0:19)的44%增加到優(yōu)化后（SEQ ID NO: 12)的 60%。
[0050] 圖19顯示了與SEQ ID NO: 15有關(guān)的密碼子質(zhì)量。
[0051] 圖20顯示了 SEQ ID N0:19的密碼子質(zhì)量圖。
[0052] 圖21顯示了修改的SEQ ID N0:15的GC含量圖，其為62%。
[0053] 圖22顯示了修改的FVIII基因 SEQ ID N0:10的核苷酸序列，包括SEQ ID N0:11、 SEQ ID N0:12 (修改的 FVIII cDNA)和 SEQ ID N0:13。
[0054] 圖23顯示了修改的FVIII基因 SEQ ID NO: 14的核苷酸序列，包括SEQ ID NO: 15 (修改的 FVIII cDNA)和 SEQ ID N0:16。
[0055] 圖24顯示了本發(fā)明的野生型FIX序列（SEQ ID NO: 18) (Blast中的質(zhì)詢行)和優(yōu) 化序列（SEQ ID N0:7) (Blast中的對(duì)象行）之間GC含量的比較。
[0056] 發(fā)明具體說明
[0057] 定義
[0058] 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中普通 專業(yè)人員通常理解的意義相同。本文使用的術(shù)語僅僅是出于描述具體實(shí)施方案的目的，并 不打算限制本發(fā)明。在本發(fā)明的說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的單數(shù)形式"a"、"an" 和"the"旨在同樣包含復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確表明不是。下列術(shù)語具有給定的意義：
[0059] "AAV Cap " 是指 AAV Cap 蛋白，VP1、VP2 和 VP3 及其類似物。
[0060] "AAV R印"是指AAV R印蛋白及其類似物。
[0061] "AAV TR"是指回文序列，包含大部分互補(bǔ)、對(duì)稱排列的序列，并包括天然AAV TRS 的類似物及其類似物。
[〇〇62] "生物學(xué)有效的"對(duì)于病毒載體的量來說，是足以導(dǎo)致靶細(xì)胞中的感染(或轉(zhuǎn)導(dǎo)）和 轉(zhuǎn)入基因表達(dá)的量。
[〇〇63] "順式基序"包括保守的序列，例如在基因組序列的末端處或附近發(fā)現(xiàn)并被識(shí)別用 于啟動(dòng)復(fù)制的序列；在內(nèi)部位置可能用于轉(zhuǎn)錄起始或終止的隱蔽的啟動(dòng)子或序列。
[〇〇64] "嵌合的"對(duì)于病毒衣殼或粒子來說，是指衣殼或粒子包含了來自不同細(xì)小病毒、 優(yōu)選為不同AAV血清型的序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授權(quán)的題為"重組細(xì) 小病毒載體及其制備方法（Recombinant parvovirus vectors and method of making)"的 美國專利6, 491，907所述，其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。特別優(yōu)選的嵌合病毒衣殼 是AAV2. 5衣殼，其具有的AAV2衣殼的序列帶有下列突變：263Q - A ;265插入T ;705N - A ; 708V -A;以及716T - N。其中表達(dá)這樣的衣殼的核苷酸序列被定義為SEQ ID NO: 17。其 它優(yōu)選的嵌合病毒衣殼描述在共同待審的PCT申請(qǐng)N〇.PCT/US07/01668中，其公開內(nèi)容在 此以其全文引為參考。
[〇〇65] "旁側(cè)的"對(duì)于旁側(cè)帶有其它元件的序列來說，表明相對(duì)于序列來說，在上游和/或 下游，即5'和/或3'，存在一個(gè)或多個(gè)旁側(cè)元件。術(shù)語"旁側(cè)的"不打算表明序列必需是緊 鄰的。例如，在編碼轉(zhuǎn)基因的核酸和旁側(cè)元件之間可以存在間插序列。序列(例如轉(zhuǎn)基因） "旁側(cè)"帶有兩個(gè)其它元件(例如TR)，表明一個(gè)元件位于序列的5'，另一個(gè)位于序列的3' ； 但是，在它們之間可以存在間插序列。
[〇〇66] "多核苷酸"是指由磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列。本文中多核苷酸以5'到3'的 方向表示。本發(fā)明的多核苷酸可以是脫氧核糖核酸（DNA)分子或核糖核酸（RNA)分子。當(dāng) 多核苷酸是DNA分子時(shí)，該分子可以是基因或cDNA分子。在本文中核苷酸堿基以單字母編 碼標(biāo)明：腺嘌呤（A)、鳥嘌呤（G)、胸腺嘧啶（T)、胞嘧啶（C)、次黃嘌呤（I)和尿嘧啶（U)。本 發(fā)明的多核苷酸可以使用本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。
[0067] 用病毒"轉(zhuǎn)導(dǎo)"細(xì)胞是指存在DNA或RNA從病毒粒子向細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
[0068] 細(xì)胞的"轉(zhuǎn)染"是指出于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的目的，將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入到細(xì)胞中。 轉(zhuǎn)染可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的各種不同方法來完成，例如轉(zhuǎn)導(dǎo)或電穿孔。
[0069] 除非另有指明，"多肽"涵蓋了肽和蛋白。
[0070] "轉(zhuǎn)基因"在廣義上使用是指摻入到病毒載體中的任何用于在靶細(xì)胞中表達(dá)的異 源核苷酸序列，以及相關(guān)的表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子。本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到表 達(dá)控制序列可以根據(jù)在靶細(xì)胞中啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力來選擇。轉(zhuǎn)基因的例子是編碼治療 性多肽的核酸。
[0071] "載體"是指含有將在體外或在體內(nèi)被投送到宿主細(xì)胞中的多核苷酸的重組質(zhì)粒 或病毒。
[0072] "重組體"是指不同于自然界中普遍發(fā)現(xiàn)的遺傳實(shí)體。當(dāng)用于多核苷酸或基因時(shí)， 它是指多核苷酸是克隆、限制和/或連接步驟以及導(dǎo)致產(chǎn)生不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的多核苷 酸的構(gòu)建物的其它程序的各種不同組合的產(chǎn)物。
[0073] "基本上同源"或"基本上相似"當(dāng)指稱核酸或其片段時(shí)，表示當(dāng)將適當(dāng)?shù)暮塑账岵?入或缺失片段與另一個(gè)核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)時(shí)，在至少大約95到99%的序列中 存在核苷酸序列同一'丨生。
[0074] "重組病毒載體"是指含有一個(gè)或多個(gè)異源序列（即不是病毒來源的多核苷酸序 列）的重組多核苷酸載體。在重組細(xì)小病毒載體的情況下，重組多核苷酸旁側(cè)帶有至少一 個(gè)、優(yōu)選兩個(gè)反向末端重復(fù)序列（ITR)。
[0075] 對(duì)于載體或病毒衣殼來說，"血清型"是由基于衣殼蛋白序列和衣殼結(jié)構(gòu)的獨(dú)特的 免疫學(xué)情況定義的。
[0076] "肽"、"多肽"和"蛋白"可以互換使用，表示至少兩個(gè)氨基酸通過酰胺鍵共價(jià)連接 的序列聚合物。
[0077] "同源的"用于指稱肽時(shí)，是指兩個(gè)肽之間的氨基酸序列相似性。當(dāng)這兩種肽中的 氨基酸位置被同樣的氨基酸占據(jù)時(shí)，它們?cè)谠撐恢猛础Ｒ虼耍?基本上同源"是指氨基酸 序列很大程度上、但不是完全同源，并且它保留了與它同源的序列的大部分或所有的活性。 本文中使用的"基本上同源的"用在這里是指序列與參比肽至少50%-致、優(yōu)選至少75%、更 優(yōu)選95%同源。其它的肽序列修飾也包括在內(nèi)，例如本文公開的序列的氨基酸序列的少量 改變、缺失、取代或衍生，只要肽的活性或功能與未修飾的肽基本相同即可。氨基酸的衍生 物可以包括但不限于三氟亮氨酸、六氟亮氨酸、5, 5, 5-三氟異亮氨酸、4, 4, 4-三氟纈氨酸、 對(duì)-氟苯丙氨酸、鄰-氟酪氨酸、間-氟酪氨酸、2, 3-二氟酪氨酸、4-氟組氨酸、2-氟組氨酸、 2, 4-二氟組氨酸、氟代脯氨酸、二氟脯氨酸、4-羥基脯氨酸、硒代甲硫氨酸、碲代甲硫氨酸、 硒代半胱氨酸、硒代色氨酸、4-氨基色氨酸、5-氨基色氨酸、5-羥基色氨酸、7-氮雜色氨酸、 4_氟色氨酸、5-氟色氨酸、6-氟色氨酸、同型烯丙基甘氨酸、同型丙炔基甘氨酸、2 丁炔基甘 氨酸、順巴豆基甘氨酸、烯丙基甘氨酸、脫氫亮氨酸、脫氫脯氨酸、2-氨基-3-甲基-4-戊烯 酸、疊氮基高丙氨酸、疊氮基丙氨酸、疊氮基正亮氨酸、對(duì)-乙炔基苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基苯 丙氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-乙?；奖彼岷捅讲⑦秽彼?。重要的是，修飾的肽 將保留與未修飾的肽相關(guān)的活性或功能，修飾的肽一般將具有與未修飾序列的氨基酸序列 "基本上同源的"氨基酸序列。
[0078] 本發(fā)明提供了編碼FVIII或FIX的修飾核酸。本發(fā)明還提供了核酸構(gòu)建物，其包含 編碼FVIII或FIX的修飾核酸作為其序列的一部分。例如，本發(fā)明包括的質(zhì)粒和/或其它 載體含有修飾的FVIII或FIX序列以及其它元件例如調(diào)控元件。此外，本發(fā)明提供了包裝 的基因投送介質(zhì)，例如包含有修飾的FVIII或FIX序列的病毒衣殼。本發(fā)明還包括通過將 修飾的序列以及在細(xì)胞中啟動(dòng)表達(dá)所需的元件投送到細(xì)胞中來表達(dá)FVIII或FIX的方法。 本發(fā)明還提供了基因治療方法，其中修飾的FVIII或FIX序列作為例如載體的組分和/或 包裝成病毒基因投送載體的組分給對(duì)象對(duì)用。治療可以例如有效地在對(duì)象中增強(qiáng)凝血和/ 或治療對(duì)象中FVIII或FIX的缺乏。本發(fā)明的這些方面的每一方面將在后續(xù)的部分中進(jìn)一 步討論。
[0079] 用于表達(dá)FVIII或FIX的修飾的核酸
[0080] 本發(fā)明提供了編碼FVIII或FIX的修飾的序列。修飾的序列包括的天然FVIII或 FIX序列含有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)化性修飾。優(yōu)化性修飾的例子包括消除一個(gè)或多個(gè)順式作用基 序并導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)Kozak序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)順式作用基序被消除，并 導(dǎo)入了一個(gè)或多個(gè)Kozak序列。
[0081] 可以被消除的順式作用基序的例子包括內(nèi)部TATA-盒，chi位點(diǎn)，核糖體進(jìn)入位 點(diǎn)，富含AT和/或富含GC的序列段，ARE、INS和/或CRS序列元件，重復(fù)序列和/或RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，（隱蔽的）剪接供體和/或受體位點(diǎn)、分支點(diǎn)，以及Sail。優(yōu)選，相對(duì)于野生型因 子FVIII或FIX，提高GC含量，并除去一個(gè)或多個(gè)順式作用基序。GC含量?jī)?yōu)選比野生型基 因高至少30%到90%。此外，密碼子適應(yīng)指數(shù)優(yōu)選>75、>80、>85、>90或>95。
[0082] 修飾的FVIII或FIX序列也可以包含旁側(cè)限制性位點(diǎn)，以便于亞克隆到表達(dá)載體 中。
[0083] 本發(fā)明還包括編碼功能活性片段FIX的SEQ ID N07序列的片段。此外，本發(fā)明 包括修飾版本的SEQ ID N0:7,它編碼具有FIX凝血活性的FIX類似物。此外，本申請(qǐng)包括 FVIII的修飾的序列，包含SEQ ID N0:12和15。
[0084] 本發(fā)明包括的核酸載體含有修飾的FVIII或FIX序列以及各種不同的調(diào)控元件。 可用于基因表達(dá)的調(diào)控元件的準(zhǔn)確性質(zhì)在生物體與生物體之間變化。一般來說，它們包括 在目的細(xì)胞中指導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組成型的或被調(diào)控的。組成型啟 動(dòng)子是導(dǎo)致可操作連接的基因基本上在所有時(shí)間都表達(dá)的啟動(dòng)子。被調(diào)控的啟動(dòng)子是可以 被激活或失活的啟動(dòng)子。被調(diào)控的啟動(dòng)子包括可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，它們通常是"關(guān)閉的"但是可 以被誘導(dǎo)"打開"，以及"可抑制的"啟動(dòng)子，它們通常是"打開的"但是可以被"關(guān)閉"。已知 有許多不同的調(diào)控物，包括溫度、激素、細(xì)胞因子、重金屬和調(diào)控蛋白。區(qū)別不是絕對(duì)的；組 成型啟動(dòng)子通?？梢员徽{(diào)控到某種程度。在某些情況下，可以利用內(nèi)源途徑來提供對(duì)轉(zhuǎn)基 因表達(dá)的調(diào)控，例如使用當(dāng)病理狀況改善時(shí)被自然下調(diào)的啟動(dòng)子。
[0085] 適合的啟動(dòng)子的例子包括腺病毒啟動(dòng)子、例如腺病毒王要晚期啟動(dòng)子，異源啟動(dòng) 子例如巨細(xì)胞病毒（CMV)啟動(dòng)子，呼吸道合胞病毒啟動(dòng)子，勞氏（Rous)肉瘤病毒（RSV)啟 動(dòng)子，白蛋白啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV)啟動(dòng)子，金屬硫蛋白啟動(dòng) 子，熱休克啟動(dòng)子，α-l-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子，乙肝表面抗原啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)鐵蛋白啟動(dòng)子，載脂 蛋白Α-1啟動(dòng)子，人類FVIII啟動(dòng)子，以及人類FIX啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是組織特異性啟動(dòng) 子，例如在肝臟細(xì)胞中有活性的小鼠白蛋白啟動(dòng)子，以及運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子（TTR)。
[0086] 包裝的修飾的FVIII或FIX序列
[0087] 修飾的FVIII或FIX序列也可以提供為包裝的病毒載體的組分。一般來說，包裝 的病毒載體包括包裝在衣殼中的病毒載體。病毒載體和病毒衣殼將在隨后部分中討論。
[0088] 病毒載體
[0089] 按照本發(fā)明的方法產(chǎn)生的包裝的病毒載體的病毒載體組分包括至少一個(gè)修飾的 FVIII或FIX序列，以及用于控制修飾的FVIII或FIX序列表達(dá)的相關(guān)表達(dá)控制序列。病毒 載體可以包含足以能夠使其保持游離形式的順式作用功能，或通過包括將修飾的FVIII或 FIX序列整合到靶細(xì)胞基因組中的機(jī)制。
[0090] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒載體包含細(xì)小病毒基因組的一部分，例如刪除了 rep和 cap并替換成修飾的hFVIII或hFIX序列及其相關(guān)表達(dá)控制序列的AAV基因組。修飾的 FVIII或FIX序列通常插入到一個(gè)或兩個(gè)（即旁側(cè)帶有的）適合病毒復(fù)制的AAV TRS或TR 元件附近；Xiao等，J Virol71; 2:941-948 (1997)，以代替病毒的r印和cap 0RF。也可以包 含其它適合促進(jìn)修飾的hFVIII或hFIX序列在靶細(xì)胞中的組織特異性表達(dá)的調(diào)控序列。
[0091] 病毒載體可以是任何適合的核酸構(gòu)建物，例如DNA或RNA構(gòu)建物，可以是單鏈的、 雙鏈的或雙鏈體。
[0092] 病毒衣殼
[0093] 包裝的病毒載體的病毒衣殼組分可以是細(xì)小病毒衣殼。AAV Cap和嵌合衣殼是優(yōu) 選的。適合的細(xì)小病毒病毒衣殼組分的例子是來自細(xì)小病毒科的衣殼組分，例如自主細(xì)小 病毒或依賴病毒。例如，病毒衣殼可以是AAV衣殼(例如AAV 1、AAV2、AAV3、AAV、AAV5、AAV6、 AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12衣殼；本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員將了解，可能有其它 尚未鑒定的變異體能執(zhí)行相同或相似功能)，或可以包含來自兩種或多種AAV衣殼的組分。 完整的一套AAV Cap蛋白包括VP1、VP2和VP3。含有編碼AAV VP衣殼蛋白的核苷酸序列 的0RF可以包含少于一整套AAV Cap蛋白，或者也可以提供一整套AAV Cap蛋白。
[0094] -種或多種AAV Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括來自兩種或多種病毒、優(yōu)選為兩 種或多種AAV的AAV Cap氨基酸序列，如Rabinowitz等于2002年12月10日被授權(quán)的題 為"重組細(xì)小病毒載體及其制備方法（Recombinant parvovirus vectors and method of making)"的美國專利6, 491，907中所述，其全部公開內(nèi)容在此引為參考。例如，嵌合病毒衣 殼可以包含AAVICap蛋白或亞基以及至少一個(gè)AAV2Cap或亞基。嵌合衣殼可以，例如，包含 具有一個(gè)或多個(gè)B19Cap亞基的AAV衣殼，例如AAV Cap蛋白或亞基可以被B19Cap蛋白或 亞基代替。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，AAV衣殼的Vp3亞基可以被B19的Vp2亞基代替。 [〇〇95] 包裝的病毒載體的生產(chǎn)
[0096] 本發(fā)明包括可以被培養(yǎng)以產(chǎn)生本發(fā)明的包裝的病毒載體的包裝細(xì)胞。本發(fā)明的包 裝細(xì)胞一般包括具有異源的（1)病毒載體功能，（2)包裝功能，以及（3)輔助功能的細(xì)胞。 這些組分功能的每一種將在后面部分中討論。
[0097] 病毒載體功能
[0098] 本發(fā)明的包裝細(xì)胞包含病毒載體功能以及包裝和載體功能。病毒載體功能通常包 含一部分細(xì)小病毒基因組，例如AAV基因組，其中rep和cap被刪除并用修飾的FVIII或FIX 序列及其相關(guān)表達(dá)控制序列代替。病毒載體功能包含充分的表達(dá)控制序列，導(dǎo)致用于包裝 的病毒載體的復(fù)制。典型地，病毒載體包含一部分細(xì)小病毒基因組，例如AAV基因組，其中 rep和cap被刪除并用轉(zhuǎn)基因及其相關(guān)表達(dá)控制序列代替。轉(zhuǎn)基因一般旁側(cè)帶有兩個(gè)AAV TRS，代替被刪除的病毒r印和cap 0RF。包含了適合的表達(dá)控制序列，例如組織特異性啟動(dòng) 子和適合用于促進(jìn)轉(zhuǎn)基因在靶細(xì)胞中組織特異性表達(dá)的其它調(diào)控序列。轉(zhuǎn)基因通常是可以 表達(dá)產(chǎn)生治療性多肽或標(biāo)記物多肽的核酸序列。病毒載體可以是任何適合的核酸構(gòu)建物， 例如DNA或RNA構(gòu)建物，可以是單鏈的、雙鏈的或雙鏈體。
[0099] 病毒載體功能可以適當(dāng)?shù)靥峁殡p鏈體載體模板，如Samulski等的美國專利公 布No. 2004/0029106中所述（出于其講授關(guān)于雙鏈體載體，其全部公開內(nèi)容在此引為參考)。 雙鏈體載體是二聚的自身互補(bǔ)的（sc )多核苷酸(典型為DNA)。例如，可以選擇雙鏈體載體 的DNA，以便由鏈內(nèi)堿基配對(duì)形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。雙鏈體DNA載體的兩條鏈都可以包裝在病 毒衣殼中。雙鏈體載體提供了與雙鏈DNA病毒載體相當(dāng)?shù)墓δ?，并可以減少靶細(xì)胞合成與 通常被病毒包裹的單鏈基因組互補(bǔ)的DNA的需要。
[0100] 在病毒載體中選用的TR (可解離的和不可解離的)優(yōu)選為AAV序列，其中優(yōu)選血清 型1、2、3、4、5和6?？山怆x的AAV TRS不需具有野生型TR序列(例如，可以通過插入、缺失、 截短或錯(cuò)義突變來改變野生型序列)，只要TR介導(dǎo)所需的功能例如病毒包裝、整合和/或前 病毒拯救等即可。TR可以是用作AAV反向末端重復(fù)的合成序列，例如Samulski等的美國專 利No. 5, 478, 745中描述的"雙D序列"，其全部公開內(nèi)容以其全文引為參考。通常，但不是 必需的，TR來自同樣的細(xì)小病毒，例如兩個(gè)TR序列都來自AAV2。
[0101] 包裝功能包括衣殼組分。衣殼組分優(yōu)選來自細(xì)小病毒衣殼，例如AAV衣殼或嵌合 AAV衣殼功能。適合的細(xì)小病毒病毒衣殼組分的例子是來自細(xì)小病毒科的衣殼組分，例如自 主細(xì)小病毒或依賴病毒。例如，衣殼組分可以選自AAV衣殼，例如AAV1-AAV12,以及其它尚 未被鑒定的新衣殼或來自非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物來源的衣殼。衣殼組分可以包含來自兩個(gè)或多個(gè) AAV衣殼的組分。
[0102] 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種VP衣殼蛋白是嵌合蛋白，包含來自兩種或多 種病毒、優(yōu)選為兩種或多種AAV的氨基酸序列，如Rabinowitz等在2002年12月10日授權(quán) 的題為"重組細(xì)小病毒載體及其制備方法（Recombinant parvovirus vectors and method of making)"的美國專利6,491,907中所述，其全部公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。
[0103] 例如，嵌合病毒衣殼可以包含來自腺相關(guān)病毒（AAV)的衣殼區(qū)和來自B19病毒的 至少一個(gè)衣殼區(qū)。嵌合衣殼可以，例如，包含具有一個(gè)或多個(gè)B19衣殼亞單位的AAV衣殼，例 如AAV衣殼亞單位可以被B19衣殼亞單位代替。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，AAV衣殼的VP1、 VP2或VP3亞單位可以被B19的VP1、VP2或VP3亞單位替換。在另一個(gè)例子中，嵌合衣殼 可以包含2型AAV衣殼，其中2型VP1亞單位已經(jīng)被來自1、3、4、5或6型AAV衣殼、優(yōu)選3、 4或5型衣殼的VP1亞單位替換?；蛘撸逗系募?xì)小病毒具有2型AAV衣殼，其中2型VP2 亞單位已經(jīng)被來自1、3、4、5或6型AAV衣殼、優(yōu)選3、4或5型衣殼的VP2亞單位替換。同 樣地，優(yōu)選的細(xì)小病毒中來自1、3、4、5或6型AAV (更優(yōu)選3、4或5型）的VP3亞單位取代 了 2型AAV衣殼的VP3亞單位的嵌合。作為另一種可選方案，其中兩個(gè)2型AAV亞單位被 來自不同血清型AAV (例如1、3、4、5或6型AAV)的亞單位取代的嵌合細(xì)小病毒是優(yōu)選的。 在本實(shí)施方案的示例性嵌合細(xì)小病毒中，2型AAV衣殼的VP1和VP2、或VP1和VP3、或VP2 和VP3亞單位被不同血清型AAV (例如1、3、4、5或6型AAV)的相應(yīng)亞單位取代。同樣地， 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合細(xì)小病毒具有1、3、4、5或6型AAV衣殼(優(yōu)選2、3或5型衣 殼)，其中一個(gè)或兩個(gè)亞單位已經(jīng)被來自不同血清型AAV的亞單位所取代，如上面對(duì)于2型 AAV的描述。
[0104] 包裝的病毒載體一般包含修飾的FVIII或FIX序列和旁側(cè)帶有TR元件的表達(dá)控 制序列，足以導(dǎo)致載體DNA的包裝以及隨后修飾的FVIII或FIX序列在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)。 病毒載體的功能可以，例如，作為質(zhì)粒或擴(kuò)增子的組分提供給細(xì)胞。病毒載體功能可以在細(xì) 胞系內(nèi)存在于染色體外，和/或可以整合到細(xì)胞的染色體DNA中。
[0105] 將帶有病毒載體功能的核苷酸序列導(dǎo)入用于復(fù)制和包裝的細(xì)胞宿主中的任何方 法都可以使用，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質(zhì)體、以及脂 質(zhì)體與核定位信號(hào)的組合。在病毒載體功能通過用病毒載體轉(zhuǎn)染來提供的實(shí)施方案中，可 以使用產(chǎn)生病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[〇1〇6] 包裝功能
[0107] 包裝功能包括病毒載體復(fù)制和包裝的基因。因此，例如，如果需要，包裝功能可以 包括病毒基因表達(dá)、病毒載體復(fù)制、病毒載體從整合狀態(tài)的拯救、病毒基因表達(dá)、以及將病 毒載體包裝到病毒粒子中所必需的功能。包裝功能可以使用遺傳構(gòu)建物例如質(zhì)?；驍U(kuò)增 子，與包裝細(xì)胞一起或分開提供。包裝功能可以在包裝細(xì)胞內(nèi)存在于染色體外，但優(yōu)選整合 到細(xì)胞的染色體DNA中。例子包括編碼AAV Rep和Cap蛋白的基因。
[0108] 輔助功能
[0109] 輔助功能包括建立包裝細(xì)胞的活性感染所需的輔助病毒元件，包裝細(xì)胞的活性感 染是啟動(dòng)病毒載體的包裝所需的。例子包括源自于腺病毒、桿狀病毒和/或皰疹病毒的、足 以導(dǎo)致病毒載體包裝的功能。例如，腺病毒輔助功能典型包括腺病毒組分Ela、Elb、E2a、E4 和VA RNA。包裝功能可以通過用所需病毒感染包裝細(xì)胞來提供。包裝功能可以使用遺傳構(gòu) 建物例如質(zhì)粒或擴(kuò)增子，與包裝細(xì)胞一起或分開提供。包裝功能可以在包裝細(xì)胞內(nèi)存在于 染色體外，但優(yōu)選整合到細(xì)胞的染色體DNA中。
[〇11〇] 可以使用任何適合的輔助病毒功能。例如，當(dāng)包裝細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞時(shí)，桿狀病毒可 以用作輔助病毒。在AAV包裝方法中，皰疹病毒也可以用作輔助病毒。編碼AAV Rep蛋白 的雜合皰疹病毒可以有利地促進(jìn)可以更具規(guī)模的AAV載體生產(chǎn)計(jì)劃。
[0111] 將帶有輔助功能的核苷酸序列導(dǎo)入用于復(fù)制和包裝的細(xì)胞宿主的任何方法都可 以使用，包括但不限于電穿孔、磷酸鈣沉淀、微注射、陽離子或陰離子脂質(zhì)體、以及脂質(zhì)體與 核定位信號(hào)的組合。在輔助功能通過使用病毒載體轉(zhuǎn)染或使用輔助病毒感染來提供的實(shí)施 方案中，可以使用產(chǎn)生病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。
[0112] 包裝細(xì)胞
[0113] 本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的任何適合的允許細(xì)胞或包裝細(xì)胞都可用于生產(chǎn)包裝的病毒載 體。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞?？捎糜谠诒景l(fā)明的實(shí)踐中生產(chǎn)包裝細(xì)胞的細(xì)胞例子包 括，例如，人類細(xì)胞系，例如VERO、WI38、MRC5、A549、293細(xì)胞、B-50或任何其它的HeLa細(xì) 胞、!1印62、53〇8-2、!111!17以及！11'1080 細(xì)胞系。
[0114] 優(yōu)選用作包裝細(xì)胞的細(xì)胞系是昆蟲細(xì)胞系。允許AAV復(fù)制并可以在培養(yǎng)中維 持的任何昆蟲細(xì)胞都可用于本發(fā)明。例子包括草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)例如 Sf9或Sf21細(xì)胞系，果蠅屬物種（Drosophila spp.)的細(xì)胞系，或蚊子的細(xì)胞系，例如白 紋伊蚊（Aedes albopictus)衍生的細(xì)胞系。優(yōu)選的細(xì)胞系是草地夜蛾Sf9細(xì)胞系。下 面的參考文獻(xiàn)出于它們講授使用昆蟲細(xì)胞表達(dá)異源多肽、將核酸導(dǎo)入這種細(xì)胞的方法、以 及將這種細(xì)胞維持在培養(yǎng)中的方法的考慮而合并在此：Methods in Molecular Biology, 《分子生物學(xué)方法》，Richard 主編，Humana Press, NJ(1995) ;0'Reilly 等，Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual,《桿狀病毒表達(dá)載體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，Oxford Univ. Press (1994) ;Samulski 等，J.Vir. 63:3822-8(1989) ;Kajigaya 等，Proc. Natl Acad. Sci.USA88:4646-50 (1991) ;Ruffing 等，J.Vir. 66:6922-30 (1992) ;Kimbauer 等， Vir. 219:37-44(1996) ;Zhao 等，Vir. 272:382-93(2000);以及 Samulski 等，美國專利 No. 6, 204, 059。
[0115] 在生產(chǎn)過程中，包裝細(xì)胞一般包含一種或多種病毒載體功能以及輔助功能和包裝 功能，足以導(dǎo)致病毒載體的復(fù)制和包裝。這些各種不同的功能可以使用遺傳構(gòu)建物例如質(zhì) 粒或擴(kuò)增子，與包裝細(xì)胞一起或分開提供，并且它們可以在包裝細(xì)胞內(nèi)存在于染色體外，或 整合到細(xì)胞的染色體中。
[0116] 可以提供其中已經(jīng)引入了任何一種或多種所述功能的細(xì)胞，例如具有引入到染色 體外或整合到細(xì)胞染色體DNA中的一種或多種載體功能的細(xì)胞系，具有引入到染色體外或 整合到細(xì)胞染色體DNA中的一種或多種包裝功能的細(xì)胞系，或具有引入到染色體外或整合 到細(xì)胞染色體DNA中的輔助功能的細(xì)胞系。
[0117] 治療方法
[0118] 修飾的FVIII或FIX基因可用于與FVIII或FIX相關(guān)疾病、例如A型或B型血友 病的基因治療。由于FVIII或FIX基因的調(diào)控區(qū)和/或編碼序列中的一個(gè)或多個(gè)突變，造 成FVIII或FIX表達(dá)不合適，例如具有不正確的氨基酸序列、或在錯(cuò)誤的組織中或在錯(cuò)誤的 時(shí)間表達(dá)、低表達(dá)或過表達(dá)，因此個(gè)體可能需要基因治療。修飾的FVIII或FIX基因可用作 基因療法，以在需要增強(qiáng)凝血的對(duì)象中增強(qiáng)凝血。
[0119] 本發(fā)明的載體的靶細(xì)胞是能夠表達(dá)具有FVIII或FIX活性的多肽的細(xì)胞，例如 哺乳動(dòng)物的肝臟系統(tǒng)的細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、以及其它具有適合的細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行前體加工以產(chǎn) 生具有FVIII或FIX活性的蛋白的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞是在體外培養(yǎng)的正常細(xì) 胞。靶細(xì)胞可以是，例如，人類細(xì)胞或其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞，特別是非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或嚙齒 目（小鼠、大鼠、兔和倉鼠)、食肉目（貓和狗）和偶蹄目（牛、豬、綿羊、山羊和馬）的哺乳動(dòng)物。 任何細(xì)胞類型都可以作為靶。在某些情況下，除了肌細(xì)胞之外的任何細(xì)胞類型都可以作為 靶。
[0120] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在可藥用載體和/或其它醫(yī)藥用、藥劑、載 體、佐劑、稀釋劑等中含有本發(fā)明載體的藥物組合物，所述載體包含F(xiàn)VIII或FIX的修飾基 因。對(duì)于注射來說，載體通常是液體。對(duì)于其它給藥方法來說，載體可以是固體或液體。對(duì) 于吸入給藥來說，載體將是可吸入的，并優(yōu)選是固體或液體微粒的形式。對(duì)于注射介質(zhì)來 說，優(yōu)選使用含有可用于注射溶液的添加劑例如穩(wěn)定劑、鹽或鹽水和/或緩沖液的水。
[0121] 示例性的可藥用載體包括無菌無熱原的水和無菌無熱原的磷酸鹽緩沖液。生理可 接受的載體包括可藥用載體?？伤幱幂d體不是生物學(xué)或其它方面有害的載體，即材料可以 施用于對(duì)象，而引起的有害生物學(xué)效應(yīng)不會(huì)超過材料的有利生物學(xué)效應(yīng)。
[0122] 藥物組合物可以用于，例如，細(xì)胞的離體（ex vivo)轉(zhuǎn)染，或?qū)⒉《据d體或細(xì)胞直 接給對(duì)象施用。
[0123] 含有FVIII或FIX的修飾基因的重組病毒載體優(yōu)選以生物學(xué)有效量施用于細(xì)胞。 如果病毒載體在體內(nèi)施用于細(xì)胞(例如按照下面的描述將病毒施用于對(duì)象)，則病毒載體的 生物學(xué)有效量是足以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)的量。
[0124] 用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞優(yōu)選以"治療有效量"與藥物載體組合施用于對(duì)象。本技 術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，治療效果不必須是完全的或治愈性的，只要給對(duì)象提供某 些益處即可。
[0125] 施用于對(duì)象的細(xì)胞劑量將根據(jù)對(duì)象的年齡、病癥和物種、細(xì)胞類型、細(xì)胞所表達(dá)的 核酸、給藥方式等變化。通常，每劑施用至少大約1〇 2到1〇8、優(yōu)選大約1〇3到1〇8個(gè)細(xì)胞。優(yōu) 選細(xì)胞以治療有效量施用。
[0126] 本發(fā)明的另一方面是以含有修飾基因的載體體內(nèi)治療對(duì)象的方法。將載體施用于 需要它的人類對(duì)象或動(dòng)物，可以通過本【技術(shù)領(lǐng)域】已知的任何施用病毒載體的方法。
[0127] 示例性的施用方式包括直腸、經(jīng)粘膜、局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外(例如靜脈內(nèi)、皮 下、真皮內(nèi)、肌內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)）給藥等，以及組織或器官直接注射，可選為鞘內(nèi)、直接肌內(nèi)、心室 內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。注射劑可以常規(guī)形式制備，作為液體溶液或懸浮液、 適合在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式，或作為乳液?；蛘?，人們可以以局部而不是 全身性方式施用病毒，例如儲(chǔ)存或緩釋制劑。
[0128] 在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，含有修飾的FVIII或FIX基因的本發(fā)明載體通過肌內(nèi)給 藥，更優(yōu)選通過肌肉注射或通過局部給藥。本文公開的載體可以通過任何適合的方法施用 于對(duì)象的肺部，但是優(yōu)選通過施用供對(duì)象吸入的含有本發(fā)明細(xì)小病毒載體的可吸入顆粒氣 溶膠懸浮劑來給藥?？晌腩w粒可以是液體或固體。含有本發(fā)明細(xì)小病毒載體的液體顆粒 的氣溶膠可以通過任何適合的方式產(chǎn)生，例如使用本【技術(shù)領(lǐng)域】的專業(yè)人員已知的壓力驅(qū)動(dòng) 的氣溶膠噴霧器或超聲波噴霧器。參見例如美國專利No. 4, 501，729。
[0129] 帶有修飾的FVIII或FIX基因的本發(fā)明病毒載體的劑量取決于給藥方式、待治療 的疾病或病癥、個(gè)體對(duì)象的狀況、具體的病毒載體、以及要投送的基因，并且可以以常規(guī)方 式確定。用于獲得治療效果的示例性劑量是病毒滴度為至少大約1〇 5、1〇6、1〇7、1〇8、1〇9、10' 10 11、1012、1013、1014、1015轉(zhuǎn)導(dǎo)單位或更高，優(yōu)選大約10 8-1013轉(zhuǎn)導(dǎo)單位，更優(yōu)選為1012轉(zhuǎn)導(dǎo)單 位。
[0130] 修飾的FVIII或FIX基因可以作為有適合在靶細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控元件的DNA分子 組分施用給藥。修飾的FVIII或FIX基因可以作為病毒質(zhì)粒、例如rAAV載體的組分給藥。 病毒粒子可以作為病毒粒子單獨(dú)給藥，或者體內(nèi)直接投送到門脈系統(tǒng),或者離體治療，離體 治療包括將載體病毒粒子體外施用于來自接受治療的動(dòng)物的細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞引回 到供體中。 實(shí)施例
[0131] 該嚙齒類動(dòng)物可行性研究的結(jié)果，證實(shí)了雙鏈載體以及比使用AAV2的人類臨床 實(shí)驗(yàn)中確立的安全劑量低10到100倍的劑量進(jìn)行的肝臟介導(dǎo)的FIX基因治療的優(yōu)越性。
[0132] AAV2和BNP2. 5感染原代人類骨骼肌
[0133] 圖1顯示了使用包含AAV2的不同載體和具有SEQ ID N0. 17中顯示的序列的嵌合 病毒載體BNP2. 5體外GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)lxl09vg HPMC530, 000個(gè)細(xì)胞。免疫熒光測(cè)試原代人類骨 骼肌細(xì)胞的vWF/因子IX、平滑肌α -肌動(dòng)蛋白和橫紋肌肌球蛋白以確保純度（即分別為陰 性、陰性和陽性)。只有對(duì)細(xì)菌、真菌、支原體、HIV DNA以及乙肝和丙肝DNA均為陰性的細(xì) 胞才被考慮用于載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些細(xì)胞在第二次傳代分離后在trans-well組織培養(yǎng)條件中 建立起來，以促進(jìn)橫紋肌的良好分化。將60%到80%匯合的細(xì)胞單層用從每個(gè)細(xì)胞MOI為 1到100/細(xì)胞(總共lxlO4)的漸增劑量和GFP報(bào)告轉(zhuǎn)基因進(jìn)行感染（圖1)。
[0134] 圖2顯示了單鏈vs.雙鏈基因組的體外GFP劑量反應(yīng)。隨時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)胞，并將與 對(duì)照比較的陽性百分率制表。將這些GFP結(jié)果與作為陽性對(duì)照的在同樣條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代 小鼠骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行比較。這里標(biāo)出的陽性轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖2)顯示出人類骨骼肌細(xì)胞允許病毒感 染。
[0135] 從原代人類骨骼肌分泌載體表達(dá)的轉(zhuǎn)基因
[0136] 這些研究的關(guān)鍵是確定人類FIX轉(zhuǎn)基因是否能夠從原代人類骨骼肌分泌的能力。 使用了兩種方法來確定在施用載體后人類FIX轉(zhuǎn)基因是否成功地從靶細(xì)胞分泌。ELISA用 于確定FIX抗原的總量，活化部分凝血酶時(shí)間（APTT)用于確定功能活性。在轉(zhuǎn)化的組織培 養(yǎng)細(xì)胞中，F(xiàn)IX峰表達(dá)被確定出現(xiàn)在載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)。每24小時(shí)取出細(xì)胞培養(yǎng)基并分 析FIX，直到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)達(dá)到平臺(tái)。
[0137] 對(duì)原代小鼠和人類原代骨骼肌細(xì)胞系上清液中的表達(dá)水平進(jìn)行了比較（圖3)，并 測(cè)量了轉(zhuǎn)基因的功能活性（圖4)。這些陽性結(jié)果支持了人類骨骼肌可以分泌載體衍生的 FIX轉(zhuǎn)基因的結(jié)論。
[0138] 圖4顯示了在感染后24小時(shí)lxl09vg/滴度感染的APTT HPMC體外裂解物。BNP2. 5 從原代人類骨骼肌表達(dá)高出2倍的分泌的FIX水平。
[0139] 圖5顯示了 hFIX體外HPMC細(xì)胞裂解物表達(dá)。每24小時(shí)使用ELISA評(píng)估BNP2. 5， 檢測(cè)上述的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后人類骨骼肌的人類FIX轉(zhuǎn)基因的表達(dá)增加（圖5)。這些陽性結(jié)果顯 示出人類骨骼肌可以分泌載體衍生的FIX轉(zhuǎn)基因，并且在人類和小鼠原代細(xì)胞中BNP2. 5都 比AAV2更有效。
[0140] 在血友病小鼠模型R333Q中AAV2vs. BNPdsFIX的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和時(shí)程
[0141] 最近開發(fā)的B型血友病基因敲除小鼠模型（FIXK0小鼠)再現(xiàn)了人類B型血友病的 出血表型，但是因?yàn)檫@些模型不產(chǎn)生FIX，它們不能再現(xiàn)人類顯性表型。此外，用表達(dá)FIX轉(zhuǎn) 基因的載體治療這些小鼠通常導(dǎo)致發(fā)展出抗體，使得不可能進(jìn)行長(zhǎng)期效能研究。最近教堂 山（Chapel Hill)的北卡羅來納大學(xué)（University of North Carolina)開發(fā)出的人類FIX 小鼠模型R333Q-hFIX，產(chǎn)生了模擬在人類中觀察到的突變(錯(cuò)義突變)的模型。這些動(dòng)物表 達(dá)mRNA轉(zhuǎn)錄物，并在整個(gè)發(fā)育過程中可檢測(cè)到的循環(huán)人類FIX，但是FIX活性低于1%。選 擇R333Q突變是因?yàn)橐呀?jīng)有數(shù)據(jù)報(bào)道了幾位患有嚴(yán)重B型血友病的患者表現(xiàn)出該突變。此 夕卜，這些CRM+患者具有接近正常的FIX抗原水平，它們的凝血活性通常低于1%。1?333〇-1^1父 小鼠在形態(tài)上與野生型小鼠沒有區(qū)別。如果不發(fā)生受傷，它們存活得很好，并每窩產(chǎn)仔4-8 只，性別比例大約1 :1。這些動(dòng)物表現(xiàn)出與在人類中觀察到的相同的出血表型，使得它們 成為研究B型血友病缺陷的基因治療方式的理想模型。此外，人類FIX R333Q基因表達(dá)為 Alal48Thr二型現(xiàn)象中的丙氨酸形式。因?yàn)锳-1抗體與148位殘基是蘇氨酸的FIX結(jié)合良 好而與丙氨酸同種型結(jié)合弱，因此表達(dá)蘇氨酸同種型的載體容易被檢測(cè)出。
[0142] 本研究使用了 8-10周齡的動(dòng)物（圖6)，其中試驗(yàn)了三種載體劑量。R333Q小鼠 (n=5/組)和正常親代動(dòng)物C57BL6肌內(nèi)注射表達(dá)hFIX的AAV2和BNP2. 5ds(圖6)。在設(shè)計(jì)中 加入了一組BNP2. 5(ss)-FIX-CMV，以評(píng)估載體衣殼向性的重要性。按照J(rèn)in等，Bl〇〇d2004 中的描述，隨時(shí)間測(cè)量FIX蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)基因活性水平。在施用載體后每?jī)芍艿臅r(shí)間 點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，共進(jìn)行6周。APTT分析被用于測(cè)定載體投送的轉(zhuǎn)基因的活性，并與對(duì)照進(jìn)行比 較。對(duì)亞組動(dòng)物進(jìn)行了 Bethesda抑制分析,指出缺乏抗體形成。
[0143] 圖 6 顯示了 ssBNP2. 5vs. ssAAV2 (圖 6A(1, 2 和 3))和 dsBNP2. 5vs. ssAAV2 (圖 6B(1，2和3))注射后6周，R333Q模型的FIX表達(dá)體內(nèi)數(shù)據(jù)。
[0144] 測(cè)定肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)后BNP FIX的性能
[0145] 盡管這種可行性研究的最初主要焦點(diǎn)是確定BNP在骨骼肌中的轉(zhuǎn)導(dǎo)以用于FIX表 達(dá)，但顯示AAV2在肝臟中轉(zhuǎn)導(dǎo)的類似的一期臨床研究已經(jīng)產(chǎn)生了爭(zhēng)論性結(jié)果。AAV2載體在 8xl0 1(l到4xlOn/kg的劑量范圍內(nèi)是安全的，但沒有治療水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。FIX的治療水 平可以在2xl0 12/kg時(shí)獲得，但FIX轉(zhuǎn)基因表達(dá)是短暫的（4周)。盡管對(duì)于FIX蛋白在轉(zhuǎn)導(dǎo) 的肝臟中短暫的表達(dá)水平還沒有得到正式的理解，但推測(cè)提示高載體劑量可能激起對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的肝臟細(xì)胞的免疫應(yīng)答，這支持了下面的結(jié)論，即通過使用采用雙鏈載體模板的AAV載體， 本發(fā)明提供的FIX基因轉(zhuǎn)移的安全劑量（10 1°或1011劑量）同時(shí)也是有效的（10-15%的FIX 水平）（圖7)。小鼠研究使用BNP在W/C57B16小鼠體內(nèi)進(jìn)行。這些實(shí)驗(yàn)采用3個(gè)組，每組 4只動(dòng)物；測(cè)試帶有FIX轉(zhuǎn)基因的（ss)AAV2、（ds)BNP-l. 1和（ds)BNP-2. 5,通過門靜脈給藥 施用于肝臟，并監(jiān)測(cè)FIX水平四周以上。從這些實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)指出的結(jié)論是：（i) (ds)BNP 比傳統(tǒng)的ssAAV2載體明顯更為有效；（ii)肝臟中載體轉(zhuǎn)導(dǎo)和FIX表達(dá)的效率明顯改善，超 過肌肉（培養(yǎng)的原代人類肌原細(xì)胞和R333Q體內(nèi)結(jié)果均如此）；以及（iii)這些新的試劑理 想地適合用比肌肉介導(dǎo)的FIX基因轉(zhuǎn)移甚至更低的劑量來達(dá)到類似的蛋白表達(dá)水平。
[0146] 其它的肝臟數(shù)據(jù)(優(yōu)化轉(zhuǎn)基因）
[0147] C57B16小鼠中FIX可行性肝臟數(shù)據(jù)表明，施用到肝臟中的雙鏈基因轉(zhuǎn)移的安全 和有效的劑量，在以前在患者中顯示為安全但不能表達(dá)足夠hFIX的載體水平下，是治療性 的。為了進(jìn)一步詳細(xì)闡述這一點(diǎn)，我們完成了另外的研究，其中我們開發(fā)并使用了轉(zhuǎn)基因密 碼子優(yōu)化hFIX。當(dāng)將最優(yōu)密碼子選擇的計(jì)算機(jī)程序用于"野生型"hFIX基因時(shí)，我們?cè)诰?碼序列中觀察到了大量稀有密碼子（圖8)。此外，hFIX基因基因含有低GC含量（圖9)，該 特點(diǎn)已知是促進(jìn)mRNA轉(zhuǎn)換。此外，發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)負(fù)性順式作用基序，它們?cè)诓溉閯?dòng)物中可能 阻礙表達(dá)。同樣地，合成了其中密碼子選擇已經(jīng)被修改成更接近近似于哺乳動(dòng)物的最優(yōu)密 碼子偏倚性的hFIX基因。
[0148] 根據(jù)計(jì)算機(jī)分析，我們除去了負(fù)性順式作用基序(例如剪接位點(diǎn)，不想要的多聚A 信號(hào)等)，它們可能對(duì)蛋白表達(dá)有負(fù)面影響。此外，增加了 GC含量以延長(zhǎng)mRNA的半衰期（圖 8)。密碼子選擇按照智人的偏倚性改編，產(chǎn)生了高的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI)值。在這些修 改的基礎(chǔ)上，我們預(yù)測(cè)優(yōu)化基因?qū)⒃试S在哺乳動(dòng)物中更高和更穩(wěn)定的表達(dá)速率。使用帶有 優(yōu)化vs.野生型的hFIX編碼序列的AAV2,我們?cè)隗w外進(jìn)行了并行的表達(dá)分析（圖9)。根據(jù) 這些研究，顯然，當(dāng)以同樣的劑量投送時(shí)，優(yōu)化FIX基因比野生型編碼序列表達(dá)了明顯更多 的蛋白產(chǎn)物/細(xì)胞。
[0149] 密碼子優(yōu)化后，在C57BL6小鼠中進(jìn)行了肝臟介導(dǎo)的AAV2臨床實(shí)驗(yàn)載體與雙鏈和 雙鏈+密碼子優(yōu)化轉(zhuǎn)基因盒的體內(nèi)載體表達(dá)的并行比較。在較早的臨床實(shí)驗(yàn)中顯示的選用 的劑量是亞治療性但安全的UxlOUvg/kgXS-lO周齡的動(dòng)物接受單次門靜脈注射（n=4/血 清型/劑量)。當(dāng)施用臨床實(shí)驗(yàn)載體時(shí)，結(jié)果是臨床實(shí)驗(yàn)的反映，AAV2載體在所有動(dòng)物體內(nèi) 是亞治療性的。在同樣的載體劑量下，具有雙鏈盒的AAV2在注射后四周表達(dá)了治療水平的 hFIX，并將這些水平維持過16周，而具有雙鏈的優(yōu)化轉(zhuǎn)基因盒的AAV2,從第一周到16周都 表達(dá)出治療水平，與臨床實(shí)驗(yàn)載體相比hFIX ng/ml水平高達(dá)70倍（圖10、11)。
[0150] 在預(yù)先暴露于AAV的動(dòng)物中對(duì)BNP2. 5的免疫應(yīng)答
[0151] 因?yàn)锽NP2. 5帶有大部分AAV2的衣殼骨架以及少量來自AAV1的氨基酸，因此進(jìn) 行了研究以確定該嵌合載體的免疫情況是與親本供體AAV2相同、介于AAV1和AAV2之間、 還是截然不同。如果嵌合載體表現(xiàn)出與親本載體不同的免疫情況，這可能表明在預(yù)先暴露 于AAV1或AAV2的患者中施用載體沒有限制BNP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的速度。如果數(shù)據(jù)表明BNP具有 與親本載體相同的免疫情況，那么有可能與文獻(xiàn)中確立的研究相同，預(yù)先暴露于野生型AAV 將對(duì)BNP有影響。
[0152] 這些實(shí)驗(yàn)在體外和體內(nèi)進(jìn)行。在體外實(shí)驗(yàn)中，C57B16動(dòng)物被預(yù)先暴露于AAV1、 AAV2或BNP2. 5載體。肌內(nèi)注射后4周，收集血清，將lml含有10%FBS的DMEM中密度為 lxlO5個(gè)細(xì)胞/孔的293細(xì)胞接種到24孔板中。細(xì)胞在37°C培養(yǎng)2-3小時(shí)，使其與孔粘附。 除去培養(yǎng)基，然后加入lxl〇 6個(gè)腺病毒dl309粒子，終體積為200 μ 1/孔。將細(xì)胞在37°C繼 續(xù)溫育1小時(shí)，然后清洗兩次。將AAV-GFP載體（lxlO8個(gè)粒子）與用PBS連續(xù)稀釋的人類 血清在4°C溫育2小時(shí)，總體積為25 μ 1 (12. 5 μ 1連續(xù)稀釋的血清樣品加上12. 5 μ 1含有 lxlO8個(gè)粒子的AAV/GFP載體)。將混合物加入到細(xì)胞中，總體積為200 μ 1，并在37°C溫育過 夜。在熒光顯微鏡下對(duì)表達(dá)GFP的細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)算無血清樣品的抑制百分?jǐn)?shù)作為參比。使 用最高稀釋度計(jì)算中和抗體滴度（圖12)，GFP表達(dá)細(xì)胞的百分率比沒有血清的對(duì)照低50%。
[0153] 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)使用同樣的已經(jīng)用AAV1、AAV2和BNP2. 5致敏的C57B16小鼠來進(jìn)行。4 周后，小鼠用BNP載體肌肉內(nèi)注射進(jìn)行激惹，所述載體帶有Luc報(bào)告基因并帶有圖14中顯 示的具有圖15提出的序列的載體，并使用實(shí)時(shí)成像進(jìn)行分析（圖13)。在未接觸過抗原的動(dòng) 物中使用同樣劑量的BNP作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
[0154] 結(jié)果
[0155] 在施用劑量為lxlOnvg/kg的優(yōu)化載體后6周后，表達(dá)水平表明了 FIX表達(dá)從 組織培養(yǎng)到體內(nèi)的相對(duì)翻譯。rAAV2提供了基線并測(cè)量最低的FIX表達(dá)。BNP2. 5(ss)和 BNP2. 5 (ds)都顯示出了超過rAAV2的增加，其中單鏈BNP2. 5測(cè)量到FIX的3-6倍增加，雙 鏈BNP2. 5導(dǎo)致循環(huán)FIX的8-12倍的增加（圖6)。這里描述的工作顯示出含有FIX基因的 BNP雙鏈"BNP (ds) "載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠和牛的橫紋肌和肝細(xì)胞，導(dǎo)致FIX基因表達(dá)和蛋白分泌 到外周血中。
[0156] 開發(fā)了修飾的密碼子FVIII(hFVIII)序列和旁側(cè)序列（分別為SEQIDN0:12和15， 圖22和23)，使用計(jì)算機(jī)程序合成了其中密碼子選擇已經(jīng)被修改成更接近近似于哺乳動(dòng)物 的最優(yōu)密碼子偏倚性的hFIX基因，包括了 GC含量以及順式作用基序的優(yōu)化。
[0157] 根據(jù)計(jì)算機(jī)分析，除去了負(fù)性順式作用元件(例如剪接位點(diǎn)，不想要的多聚A信號(hào) 等)，它們可能對(duì)蛋白表達(dá)有負(fù)面影響。此外，增加了 GC含量以延長(zhǎng)mRNA半衰期。密碼子 選擇按照智人的偏倚性改編，產(chǎn)生了高的密碼子適應(yīng)指數(shù)（CAI)值。在這些修改的基礎(chǔ)上， 修飾的基因可能允許在哺乳動(dòng)物細(xì)胞、特別是人類細(xì)胞或人類來源的細(xì)胞中更高和更穩(wěn)定 的表達(dá)速度。
[0158] 對(duì)于SEQ ID NO: 10來說，圖16的柱形圖顯不了序列密碼子的百分?jǐn)?shù)，它們屬于某 個(gè)質(zhì)量級(jí)別中。在所需表達(dá)系統(tǒng)中給定氨基酸的最常用密碼子的質(zhì)量值被設(shè)定為100,剩余 的密碼子相應(yīng)分級(jí)（也參見 Sharp, P.E, Li, W.H·，Nucleic Acids Res. 15 (3) ,1987)。圖 17 顯示了急劇增加的密碼子質(zhì)量。圖18顯示了 GC含量從44% (野生型基因 SEQ ID NO: 19) 增加到66%用于優(yōu)化（SEQ ID NO. 12)。
[0159] 修飾的基序包括下列：
[0160]
【權(quán)利要求】
1. 用于增加 hFVIII表達(dá)的分離的優(yōu)化基因，其中所述優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾，相對(duì)于野 生型FVIII基因增加 CG序列并減少順式基序，其中優(yōu)化基因具有選自SEQ ID NO: 12,15以 及與其具有95%同源性的核苷酸序列的核苷酸序列。
2. 權(quán)利要求1的優(yōu)化基因，其中CG序列相對(duì)于野生型基因增加至少40%。
3. 權(quán)利要求1的優(yōu)化基因，其包含在病毒載體中。
4. 權(quán)利要求3的優(yōu)化基因，其中所述病毒載體是嵌合病毒載體，含有選自AAV1、AAV2、 AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 和 AAV12 衣殼的衣殼組分。
5. 權(quán)利要求4的優(yōu)化基因，其中所述嵌合病毒載體包含SEQ ID NO: 17或其互補(bǔ)序列。
6. 權(quán)利要求1的優(yōu)化基因，其中所述優(yōu)化基因旁側(cè)帶有AAV TRs。
7. 權(quán)利要求3的優(yōu)化基因，其中所述病毒載體包含SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
8. 權(quán)利要求1的分離的優(yōu)化基因在制備用于增加對(duì)象中hFVIII表達(dá)的試劑中的應(yīng)用， 其中優(yōu)化基因已經(jīng)被修飾，相對(duì)于野生型FVIII基因增加 CG序列并減少順式基序。
9. 權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中CG序列相對(duì)于野生型基因增加至少40%。
10. 權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中重組病毒載體是嵌合病毒載體。
11. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述嵌合病毒載體含有選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11 和 AAV12 衣殼的衣殼組分。
12. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中所述嵌合病毒載體包含SEQ ID NO: 17或其互補(bǔ)序列。
13. 權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中優(yōu)化基因旁側(cè)帶有AAV TRs。
14. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中重組病毒載體包含SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
15. 表達(dá)FVIII-肽的體外方法，包括： 用權(quán)利要求1的優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中優(yōu)化FVIII基因已經(jīng) 被修飾，相對(duì)于野生型FVIII基因增加 CG序列并減少順式基序；以及將轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞維 持在足以表達(dá)所述肽的生物學(xué)條件下。
16. 權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中CG序列相對(duì)于野生型多核苷酸增加至少40%。
17. 權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞是肝細(xì)胞或肌細(xì)胞。
18. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的分離的優(yōu)化基因；以及可藥用載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK104087591SQ201410158202
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2007年6月19日 優(yōu)先權(quán)日:2006年6月19日
【發(fā)明者】理查德·J·薩姆爾斯基 申請(qǐng)人:阿斯克肋匹奧生物制藥公司