一種RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素βA基因的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體。RNAi干擾載體具有所述RNAi干擾片段；所述RNAi片段的序列為TGCCC?TTGCT?TTGGC?TGAGA?GGATT或CATCG?GGACG?GAGGGCAGAA?ATGAA或GCTGC?ACTTT?GAGAT?TTCCC?AAGAA或CCATC?CGTCT?CTTTC?AACAGCAGAA。本發(fā)明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體通過對(duì)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素基因進(jìn)行沉默，間接影響發(fā)情相關(guān)激素和發(fā)情性狀，有效的促使綿羊發(fā)情，解決了綿羊非繁殖季節(jié)不發(fā)情、不產(chǎn)羔的繁殖問題。
【專利說明】—種RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于調(diào)控綿羊發(fā)情與產(chǎn)羔相關(guān)性抑制素β A RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及RNAi干擾載體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新疆作為我國五大牧區(qū)之一，是擁有綿羊品種較多。綿羊季節(jié)性發(fā)情、排卵以及產(chǎn)羔的這種繁殖性狀導(dǎo)致了較長的世代間隔，使其利用率較低，是新疆綿羊工廠化，集約化養(yǎng)殖的主要難題之一。
[0003]現(xiàn)有研究主要是選擇與綿羊季節(jié)性生理變化密切相關(guān)的下丘腦-垂體-性腺軸上激素相關(guān)基因及卵巢內(nèi)各種調(diào)節(jié)因子，如褪黑激素受體、抑制素基因、催乳素受體基因等進(jìn)行相關(guān)性分析。為了進(jìn)一步探討綿羊季節(jié)性繁殖性狀和發(fā)情性狀，篩選與綿羊發(fā)情性狀相關(guān)的調(diào)控基因，本發(fā)明在前期研究中采用抑制性消減雜交的方法，選擇常年發(fā)情的湖羊，季節(jié)性發(fā)情的中國美利奴羊，構(gòu)建了湖羊和中國美利奴綿羊卵巢組織的消減cDNA文庫，成功篩選并確定抑制素βΑ為非季節(jié)繁殖的差異基因，本發(fā)明則是利用抑制素βΑ通過RNAi的方法探討該基因?qū)Πl(fā)情性狀的影響。
[0004]RNA干擾是通過內(nèi)源的或人工方法使小片段RNA在細(xì)胞內(nèi)弓丨起與之同源互補(bǔ)mRNA的降解，并致使基因沉默的一種現(xiàn)象，最終阻止目的基因表達(dá)的有效手段之一。它以其序列特異性、高效性、選擇性和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用與基因功能、疾病治療以及修復(fù)遺傳損傷等方面的研究。
[0005]抑制素是一種作用于下丘腦-垂體-性腺的重要調(diào)節(jié)激素，它的生理學(xué)作用就是選擇性的抑制垂體合成和分泌FSH，從而影響動(dòng)物卵巢、卵泡的生長發(fā)育以及產(chǎn)仔數(shù)。自上世紀(jì)30年代左右，國內(nèi)外研究者就利用各種方法對(duì)動(dòng)物的多胎性狀進(jìn)行研究，而抑制素這種即具有免疫原性，同時(shí)又與卵巢功能密切相關(guān)的基因也就順利的成為了學(xué)者的研究目標(biāo)。Morris等研究表明，用抑制素主動(dòng)免疫母牛，可顯著提高雙犢率。2006年，崔先利等用抑制素質(zhì)粒免疫黃牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組成熟卵泡個(gè)數(shù)比未處理組個(gè)數(shù)多顯著多0.54個(gè)(P〈0.05)。免疫組誘發(fā)牛排雙卵率60.71%(51/84)，也顯著高于對(duì)照組13.75%(P〈0.05)。曹曉涵、王振華等采用新疆細(xì)毛羊抑制素成熟區(qū)序列重組融合蛋白免疫小鼠，結(jié)果顯示處理組產(chǎn)生了很高的抗抑制素抗體滴度，且極顯著的提高了 FSH的含量，促進(jìn)了大鼠卵巢發(fā)育，增加了成熟以及優(yōu)勢卵泡的數(shù)量。
[0006]國內(nèi)外已有的研究證明，抑制素β A基因與動(dòng)物的產(chǎn)仔數(shù)有顯著影響，而該基因在自分泌和旁分泌的形式來調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育以及排卵的同時(shí)也促進(jìn)了動(dòng)物卵巢的發(fā)育。本發(fā)明以抑制素β A基因作為候選基因，以RNAi技術(shù)為基礎(chǔ)，通過卵巢直接注射抑制素^ARNAi載體的方法，研究該基因?qū)d羊的發(fā)情性狀的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于，提供一種用于干擾綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素β A基因的RNAi干擾片段、RNAi干擾載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的RNAi干擾片段及RNAi干擾載體可以使綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素β A基因進(jìn)行沉默，從而促進(jìn)動(dòng)物發(fā)情、繁殖，解決了綿羊非繁殖季節(jié)不發(fā)情、不產(chǎn)羔的繁殖問題。
[0008]本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種RNAi干擾片段，用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素β A基因，所述RNAi干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGCACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
[0009]進(jìn)一步地，所述RNAi干擾片段作為制備干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素β A基因的藥物的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供一種用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素β A基因，所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；所述RNAi干擾片段的序列為:TGCCCTTGCT TTGGC TGAGA GGATT或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTTGAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCTCTTTC AACAG CAGAA。
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體包括PLLU2G載體，所述PLLU2G載體與所述RNAi干擾片段連接。
[0012]進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體在促進(jìn)動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用。
[0013]進(jìn)一步地，所述RNAi干擾載體以卵巢直接注射、靜脈注射及肌肉注射中的一種方式注射至動(dòng)物體內(nèi)，用于促進(jìn)動(dòng)物繁殖。
[0014]本發(fā)明另一方 面還提供一種RNAi干擾載體的制備方法，該制備方法包括如下步驟:
[0015]步驟I，酶切PLLU2G載體；
[0016]步驟2，將RNAi干擾片段與酶切后的所述PLLU2G載體連接，得到連接產(chǎn)物；
[0017]其中，所述RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCGGGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTCAACAG CAGAA ；
[0018]步驟3，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽性克隆菌液；
[0019]步驟4，送陽性克隆菌液進(jìn)行測序鑒定，并將測序結(jié)果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的菌液進(jìn)行擴(kuò)增；
[0020]步驟5，從所述擴(kuò)增的菌液中提取RNAi干擾載體。
[0021 ] 進(jìn)一步地，所述步驟3中的篩選方法為AMP抗性篩選和藍(lán)白斑篩選。
[0022]進(jìn)一步地，所述步驟3還包括將所述陽性克隆菌液置于含抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并做菌落PCR鑒定。
[0023]借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn):
[0024]本發(fā)明提供的RNAi干擾片段以及RNAi干擾載體可以對(duì)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素β A基因進(jìn)行干擾，使其沉默；通過對(duì)抑制素β A基因的干擾，間接地影響綿羊發(fā)情相關(guān)激素和發(fā)情形狀的改變，在非繁殖季節(jié)有效的促進(jìn)綿羊發(fā)情，從而解決了綿羊非繁殖季節(jié)不發(fā)情、不產(chǎn)羔的繁殖問題。
[0025]另外，本發(fā)明以卵巢直接注射的方式注射至綿羊卵巢，不會(huì)對(duì)綿羊的健康和卵巢功能產(chǎn)生影響，而且操作方便、簡單、快捷，成本低廉?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1為PLLU2G載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0027]圖2為綿羊卵巢顆粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)染RNAi干擾載體后在電子顯微鏡下的示意圖；
[0028]圖3為綿羊卵巢顆粒細(xì)胞在轉(zhuǎn)染RNAi干擾載體后在的熒光效果圖；
[0029]圖4分別為綿羊卵巢顆粒細(xì)胞中在轉(zhuǎn)染PLLU2G-shRNAl、PLLU2G_shRNA2、PLLU2G-shRNA3、PLLU2G_shRNA4后的抑制素β A基因mRNA表達(dá)量的示意圖；
[0030]圖5為干擾組以及對(duì)照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的INHBA水平的示意圖；
[0031]圖6為干擾組以及對(duì)照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的FSH水平的示意圖；
[0032]圖7為干擾組以及對(duì)照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的LH水平的示意圖；
[0033]圖8為干擾組以及對(duì)照組的綿羊在以卵巢直接注射的方式注射干擾載體后的血清中的E2A平的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)`成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，結(jié)合較佳實(shí)施例詳細(xì)說明如下。
[0035]實(shí)施例1
[0036]設(shè)計(jì)并合成用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素β A基因的RNAi干擾片段。具體如下:
[0037]根據(jù)抑制素β A 基因(靶基因 INHBA (GenBank:NW_004080167.1))的 mRNA 序列設(shè)計(jì)RNAi干擾片段，并通過合成公司合成出四對(duì)shRNAi干擾片段。該四對(duì)RNAi干擾片段分別為shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。該四對(duì)shRNAi干擾片段的序列以及用于干擾擾抑制素β A基因的mRNA序列的區(qū)域如表1所不。
[0038]表1
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種RNAi干擾片段，用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素βΑ基因，其特征在于,所述 RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGGCAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
2.權(quán)利要求1所述的RNAi干擾片段作為制備干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中抑制素βΑ基因的藥物的應(yīng)用。
3.—種RNAi干擾載體，用于干擾動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞中的抑制素βΑ基因，其特征在于，所述RNAi干擾載體具有RNAi干擾片段；所述RNAi干擾片段的序列為:TGCCC TTGCT TTGGCTGAGA GGATT 或 CATCG GGACG GAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或CCATC CGTCT CTTTC AACAG CAGAA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體包括PLLU2G載體，所述PLLU2G載體與所述RNAi干擾片段連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體在促進(jìn)動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的RNAi干擾載體，其特征在于，所述RNAi干擾載體以卵巢直接注射、靜脈注射及肌肉注射中的一種方式注射至動(dòng)物體內(nèi)，用于促進(jìn)動(dòng)物繁殖。
7.—種RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1，酶切PLLU2G載體； 步驟2，將RNAi干擾片段與酶切后的所述PLLU2G載體連接，得到連接產(chǎn)物； 其中，所述 RNAi 干擾片段的序列為 TGCCC TTGCT TTGGC TGAGA GGATT 或 CATCG GGACGGAGGG CAGAA ATGAA 或 GCTGC ACTTT GAGAT TTCCC AAGAA 或 CCATC CGTCT CTTTC AACAGCAGAA ； 步驟3，將所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，并篩選出陽性克隆菌液； 步驟4，送陽性克隆菌液進(jìn)行測序鑒定，并將測序結(jié)果與所述RNAi干擾片段序列完全一致的菌液進(jìn)行擴(kuò)增； 步驟5，從所述擴(kuò)增的菌液中提取RNAi干擾載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述步驟3中的篩選方法為AMP抗性篩選和藍(lán)白斑篩選。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述 的RNAi干擾載體的制備方法，其特征在于，所述步驟3還包括將所述陽性克隆菌液置于含抗的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并做菌落PCR鑒定。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103882024SQ201410160430
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】趙宗勝, 楊華, 賈斌, 陳寶麒, 林杉, 田占偉 申請(qǐng)人:石河子大學(xué)