一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因、檢測(cè)該基因的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因、檢測(cè)該基因的試劑盒及其應(yīng)用。所述的致病基因是突變的PAX6基因（Paired?box6），該P(yáng)AX6基因的第6外顯子的第323位堿基，有一個(gè)C->A的點(diǎn)突變，導(dǎo)致編碼第108位絲氨酸的遺傳密碼子（TCC）變成酪氨酸的遺傳密碼子（TAC），即發(fā)生了S108Y突變。本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)該先天性無(wú)虹膜癥致病基因的試劑盒，包括：2mM?dNTPs，10×PCR反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增引物對(duì)和雙蒸水，其中，所述的PCR擴(kuò)增引物對(duì)由引物1（SEQ?ID?NO:1所示）和引物2（SEQ?ID?NO:2）組成。本發(fā)明提供了一種新的先天性無(wú)虹膜癥的致病基因，從而為先天性無(wú)虹膜癥的基因診斷提供了新的技術(shù)手段，也為發(fā)病的分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因、檢測(cè)該基因的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種基因檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，具體地說(shuō)是涉及一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明屬于疾病檢測(cè)與診斷【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]無(wú)虹膜癥是雙眼發(fā)育性疾患，主要特征為先天性虹膜發(fā)育不良或正常虹膜的缺如，還可伴有多種眼疾，如角膜渾濁、小角膜、晶狀體脫位、白內(nèi)障、青光眼、黃斑發(fā)育不良、斜視、眼球震顫等，累及全眼球。
[0003]由于虹膜缺 損程度不同，故臨床表現(xiàn)不一，但都有畏光、皺眉及瞇眼等表現(xiàn)，視力差并可能進(jìn)行性減退。臨床上有些患眼用手電筒或在裂隙燈檢查時(shí)就可看見殘存的周邊虹膜，而有些只能在房角鏡下才能見到殘余的虹膜根部組織。較多患者早期就有周邊角膜血管翳及角膜渾濁，隨年齡增長(zhǎng)逐漸發(fā)展至角膜中央部。偶有小角膜、角膜硬化癥及角膜與晶狀體粘連的情況。晶狀體發(fā)育異常以先天性局限性晶狀體渾濁為多見，亦可有晶狀體異位或先天性缺損，發(fā)生進(jìn)行性的白內(nèi)障則可使視力明顯減退。無(wú)虹膜亦可伴有脈絡(luò)膜缺損、瞳孔殘膜、小視神經(jīng)乳頭、斜視及上瞼下垂等，如伴黃斑中心的發(fā)育不良可導(dǎo)致眼球震顫。無(wú)虹膜患者當(dāng)伴有青光眼時(shí)，殘留的虹膜則逐漸向前覆蓋到小梁網(wǎng)，一旦功能小梁被阻擋，目艮壓就會(huì)逐漸升高，青光眼的嚴(yán)重程度與房角粘連情況有關(guān)。
[0004]先天性無(wú)虹膜癥男女兩性發(fā)病相同，可以孤立發(fā)生，可以合并其它眼部發(fā)育異常，或者是遺傳性多系統(tǒng)綜合癥的一部分。約有2/3的無(wú)虹膜患者有家族史，為常染色體顯性遺傳；1/3的患者呈散發(fā)性，多為隱性遺傳。其遺傳基礎(chǔ)和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。對(duì)先天性無(wú)虹膜癥致病基因的突變檢測(cè)是了解其發(fā)病的分子機(jī)制的重要步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的先天性無(wú)虹膜癥致病基因；
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供所述先天性無(wú)虹膜癥致病基因在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用；
[0007]本發(fā)明的目的之三在于提供一種可用于上述先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)的試劑盒；
[0008]本發(fā)明的目的之四在于提供所述試劑盒在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0010]本發(fā)明的一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因，其特征在于所述的致病基因是突變的PAX6基因(Paired box6)，該P(yáng)AX6基因的第6外顯子的第323位堿基(以cDNA第一個(gè)核苷酸作為I計(jì)算)，有一個(gè)C->A的點(diǎn)突變。
[0011]該P(yáng)AX6 基因的 gDNA Gene Bank 登錄號(hào)為 NC_000011，cDNA 的 Gene Bank 登錄號(hào)為NM_001604，所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的Gene Bank登錄號(hào)為NP_001595。
[0012]突變前的PAX6基因的第6外顯子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，突變后的PAX6基因的第6外顯子的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0013]該突變導(dǎo)致編碼第108位絲氨酸的遺傳密碼子(TCC)變成酪氨酸的遺傳密碼子(TAC)，即發(fā)生了 S108Y突變。
[0014]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的先天性無(wú)虹膜癥致病基因在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的一種用于先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)的試劑盒，包括:2mM dNTPs,10XPCR反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增引物對(duì)和雙蒸水，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增引物對(duì)由引物I和引物2組成，其中，引物I的核苷酸序列為:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID N0:1所示)，引物2的核苷酸序列為AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID N0:2 所示)。
[0016]該試劑盒用于先天性無(wú)虹膜癥致病基因的擴(kuò)增,其采用Touch-down PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?
[0017]95°C預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)入第一個(gè)循環(huán)，95°C變性40秒，63°C退火復(fù)性30秒，72°C延伸lmin，之后每循環(huán)一次降低0.5°C，共進(jìn)行14個(gè)循環(huán)，之后進(jìn)入主循環(huán)，95°C變性40秒，57 °C退火復(fù)性30秒，72 °C延伸Imin，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，72 °C延伸lOmin，4°C保存，表2所示。
[0018]進(jìn)一步的，本發(fā) 明還提出了所述的一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)試劑盒在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用。
[0019]一種利用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥致病基因的方法，包括以下步驟:
[0020](I)使用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒抽提血液樣品基因組DNA ；
[0021](2)設(shè)計(jì)引物:
[0022]正向測(cè)序引物序列為:CGTAAGCTTGTCATTGTTTAATGC(SEQ ID NO:1 所示)；
[0023]反向測(cè)序引物序列為:AGAGAGGGTGGGAGGAGGTA(SEQ ID NO:2 所示)；
[0024](3 )對(duì)樣本DNA目標(biāo)片段進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增；
[0025]PCR體系如表1所示:
[0026]表1
【權(quán)利要求】
1.一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因，其特征在于所述的致病基因是突變的PAX6基因(Paired box6)，該P(yáng)AX6基因的第6外顯子的第323位堿基，有一個(gè)C_>A的點(diǎn)突變。
2.權(quán)利要求1所述的先天性無(wú)虹膜癥致病基因在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用。
3.一種用于先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:2mMdNTPs，IOXPCR反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增引物對(duì)和雙蒸水，其特征在于:所述的PCR擴(kuò)增引物對(duì)由引物I和引物2組成，其中，引物I的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒用于先天性無(wú)虹膜癥致病基因的擴(kuò)增，其采用Touch-down PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)? 950C預(yù)變性2分鐘，然后進(jìn)入第一個(gè)循環(huán)，950C變性40秒，63°C退火復(fù)性30秒，72°C延伸lmin，之后每循環(huán)一次降低0.5°C，共進(jìn)行14個(gè)循環(huán)，之后進(jìn)入主循環(huán)，95°C變性40秒，57°C退火復(fù)性30秒，72°C延伸lmin，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。
5.權(quán)利要求3或4所述的一種先天性無(wú)虹膜癥致病基因檢測(cè)試劑盒在制備診斷或檢測(cè)先天性無(wú)虹膜癥試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103937804SQ201410160988
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】張璐 申請(qǐng)人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)