一株中度耐鹽海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中度耐鹽海洋芽孢桿菌（圖一）OceanobacillusrekensisPT-11T(=KCTC33144T=DSM26900T)。通過從新疆莎車縣鹽堿土分離、篩選、生理生化鑒定等工作，確定該菌株為革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.3-0.5×1.0-1.2μm，菌落呈奶油色，NaCl耐受范圍為5%-20%(最佳鹽濃度為5%-12%)，pH生長范圍為6.5-10.0(最佳pH范圍為8.0-9.0)，溫度生長范圍為15-40℃(最佳生長溫度為30-37℃)。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解吐溫-80和明膠，不能水解淀粉和纖維素。其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性?；谠摼苣褪茌^高鹽濃度，可廣泛應(yīng)用于高鹽濃度下發(fā)酵生產(chǎn)各種基因工程產(chǎn)品。
【專利說明】一株中度耐鹽海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物菌種及其應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種中度耐鹽海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中度嗜鹽菌并非分類學(xué)上的專業(yè)名詞，而是對一類最佳耐鹽濃度在3%_15%的極端微生物的統(tǒng)稱。它廣泛分布在各類高鹽環(huán)境中，如海洋、鹽湖、鹽堿地、鹽池這些自然環(huán)境及很多發(fā)酵食品中都能被發(fā)現(xiàn)。
[0003]中度嗜鹽菌因其獨(dú)特的生長環(huán)境與耐鹽機(jī)制，從而具有很多顯著的特點(diǎn):可在較高的鹽濃度下生長，降低發(fā)酵過程中染菌風(fēng)險(xiǎn)；不需要較為復(fù)雜的營養(yǎng)條件，碳氮源利用范圍廣泛；生理生化特性多樣，潛在應(yīng)用價(jià)值巨大。
[0004]在酶制劑生產(chǎn)上的應(yīng)用。工業(yè)生產(chǎn)通常需要滿足很多特殊的物化條件，然而卻常常難以與酶反應(yīng)所需的最佳條件相匹配，這就對酶的適應(yīng)條件提供了更高的要求。中度嗜鹽菌產(chǎn)生的酶恰恰具有廣泛的鹽度、溫度耐受范圍，還有容易純化的優(yōu)點(diǎn)，故而受到廣泛關(guān)注，有著良好的商業(yè)應(yīng)用前景。
[0005]基因工程和化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用。在高鹽環(huán)境下，中度嗜鹽菌常?？梢苑e累許多相容性物質(zhì)，如海藻糖，四氫嘧啶，甜菜堿，脯氨酸，羥基四氫嘧啶等。因其具有良好的滲透保護(hù)功能，受到分子基因工程與化妝品領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。其中，四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶是一種被稱為分子伴侶的穩(wěn)定 劑，它們具有在極端環(huán)境如高鹽、高溫、干燥或低溫下穩(wěn)定和保護(hù)生物大分子酶、DNA的作用。同時(shí)它們還具有防止皮膚干燥，減緩皮膚衰老的作用，是一種很好的化妝品保濕劑。
[0006]中度嗜鹽菌在其他很多方面依然表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。如抗生素等活性物質(zhì)的生產(chǎn)，新型酶如限制性內(nèi)切酶等的提取，以及乳化劑的合成等方面都有廣泛的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對國內(nèi)外有關(guān)中度耐鹽海洋芽孢桿菌的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種新的中度耐鹽海洋芽孢桿菌及其應(yīng)用，所述的中度耐鹽海洋芽孢桿菌堿性磷酸酶陰性、β -半乳糖苷酶陰性、葡萄糖醛酸酶陽性、α-葡萄糖苷酶陰性，其菌落奶油色、鹽濃度承受范圍為5至20 (%，w/v，鹽濃度對該菌生長影響曲線見圖三)，這些特征已明顯區(qū)別于其他已公開報(bào)道的其他海洋芽孢桿菌有效種。
[0008]本發(fā)明具體提供一種海洋芽抱桿菌rekensis PT-1It (=KCTC33144T=DSM 26900τ)
本發(fā)明通過以不同的溫度、PH值、鹽濃度和培養(yǎng)基為富集條件，從新疆莎車鹽湖中取樣，分離純化培養(yǎng)到多株菌，經(jīng)過多級篩選確定一株嗜鹽海洋芽孢桿菌iOceanobacillusrekensis PT-1It),命名為rehwsis海洋芽孢桿菌,該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位:韓國典型菌種保藏中心(KCTC)和德國微生物和細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(DSMZ)，保藏時(shí)間分別為2013年3月6日和2013年3月19日，保藏號分別是KCTC33144T =DSMZ 26900T，KCTC地址為韓國大田市儒城區(qū)韓國生物科學(xué)和技術(shù)研究所，郵編是305-806，DSMZ地址為德國布倫瑞克萊布尼茨研究所，郵編38124。經(jīng)微生物多相分類鑒定為海洋芽孢桿菌如&77狀 rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM 26900τ))。該菌革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.3-0.51.0-1.2 μ m,菌落呈奶油色，NaCl耐受范圍為5%-20%(最佳鹽濃度為5%_12%)，pH生長范圍為6.5-10.0(最佳pH范圍為8.0-9.0)，溫度生長范圍為15-40°C (最佳生長溫度為30_37°C )。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解吐溫-80和明膠，不能水解淀粉和纖維素。其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性。細(xì)胞主要脂肪酸為anteisO-C15:0和iso_C15:0，主要呼吸醌為MK-7，細(xì)胞壁肽聚糖類型主要為內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，主要極性脂為磷脂酰甘油(PG)。DNA (G+C)含量為36.7 mol%。能利用碳源:糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、四唑紫、D-蜜三糖、1%乳酸鈉、D-絲氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、二甲胺四環(huán)素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、L-絲氨酸、果膠、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、奎尼酸、D-乳酸甲酯、L-乳酸、L-蘋果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化鋰、吐溫-40、Y -氨基丁酸、α -羥基丁酸、β -羥基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、氨曲南、丁酸鈉；不能利用碳源:D_纖維二糖、龍膽二糖、萬古霉素、四唑藍(lán)、a -D-乳糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰_β -D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神經(jīng)氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-匍萄糖、D-巖操糖、L-巖操糖、L-鼠李糖、肌苷、梭鏈孢酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天門冬氨酸D-絲氨酸醋竹桃霉素利福霉素二甲胺四環(huán)素明膠氨基乙酰-L-脯氨酸L-丙氨酸L-精氨酸L-天門冬氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、林可霉素、鹽酸胍、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸內(nèi)酯、粘酸、D-葡糖二酸、P-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、檸檬酸、α-氧代戊二酸、D-蘋果酸、亞碲酸鉀、α-氧代丁酸甲酸和溴酸鈉。
[0009]對該菌株rekens is ΡΤ_11τ的形態(tài)觀察、生理生化及培養(yǎng)特性和化學(xué)分類均按照《放線菌系統(tǒng)學(xué)——方法、原理與實(shí)踐》進(jìn)行。其中碳源利用情況采用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，采用高效液相法來測定該菌的醌組分和細(xì)胞內(nèi)GC含量，使用2.5%戊二醛固定該菌后，在掃描電鏡下觀察該菌的形貌(圖一)，參考菌株為Oceanobacillus profundus CL-MP28T(DSM 18246τ) > OrnithinibacillusbavariensisWSBC 24001T、用于和測試菌株 PT-1l 比較。
[0010]本發(fā)明通過DNA的提取，16S rDNA的PCR及測序，同時(shí)根據(jù)在NCBI山上比對結(jié)果和進(jìn)化樹的構(gòu)建，進(jìn)一步對該菌的分類地位進(jìn)行判斷。
[0011]米用Sanger 法對rekensis ΡΤ_11τ 的 16S rDNA 測序結(jié)果如下(該序列已在NCBI登記，登錄號為HQ620695)，全長共1592bp:
GACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCG
GGAAGCAAGTGATCACCCTTCGGGGTGTGAACTTGTGGAACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTG
CCTGTAAGATCGGGATAACTCGCGGAAACGTGAGCTAATACCGGATAATACTTTTTAACTCCTGTTGGAAAGTTAAA
AGACGGCATCTCGCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCG
ACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAA
ACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTA
ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCTCGCAGGC
GGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAGGACTTGAGTACAGAA
GAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCT
GGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC
GATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTAC
GGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAAC
GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAG
GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAG
TTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCAT
CATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGAACAAAGGGAAGCTAAATCGCGAGGTCAAGCAA
ATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTG TAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGG
ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTGGTAACACCCGA
AGTCGGTGAGGTAACCTTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACTGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAG
CCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAGCTTGGTACCCGGGAATCTCTA
基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖二，從圖上可以看出海洋芽孢桿菌OceanobaciIlus rekensis PT-1It 與海洋芽抱桿菌的一個(gè)有效種 Oceanobacillusprofundus CL_MP28T (DSM 18246τ)聚為一個(gè)分支，該海洋芽抱桿菌
親緣性最近的菌株profundus CL_MP28T (DSM 18246τ)的
16S rDNA相似度為97.267%，結(jié)合表型、生理生化和基因型比較數(shù)據(jù)，表明海洋芽孢桿菌OceanobaciIlus rekensis 為海洋芽抱桿菌屬 Oceanobacillus 的一個(gè)新種。
[0012] 基于該菌嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，NaCl耐受范圍為5%_20%(最佳鹽濃度為5%-12%)，pH生長范圍為6.5-10.0(最佳pH范圍為8.0-9.0)，溫度生長范圍為15-400C (最佳生長溫度為30-37°C)。氧化酶和過氧化氫酶陽性，具有硝酸還原能力，可以水解吐溫-80和明膠，同時(shí)可利用如下碳源發(fā)酵等特性，因此本發(fā)明提供的海洋芽孢桿菌Oceanobacillus rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM 26900t)可廣泛的應(yīng)用在各類基因工程產(chǎn)品的高鹽濃度發(fā)酵中。(可利用的碳源:糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖、四唑紫、D-蜜三糖、1%乳酸鈉、D-絲氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、二甲胺四環(huán)素、L-丙氨酸、L-左旋谷氨酸、L-絲氨酸、果膠、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡羅酰胺、奎尼酸、D-乳酸甲酯、L-乳酸、L-蘋果酸、溴代丁二酸、萘啶酮酸、氧化鋰、吐溫-40、Y-氨基丁酸、α-羥基丁酸、β_羥基丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、氨曲南、丁酸鈉；不能利用碳源:D-纖維二糖、龍膽二糖、萬古霉素、四唑藍(lán)、a -D-乳糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-葡萄糖苷、D-水楊苷、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、N-乙酰-β -D-甘露糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-神經(jīng)氨酸、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、3-甲基-葡萄糖、D-巖藻糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、肌苷、梭鏈孢酸、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、肌醇、甘油、D-葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-6-磷酸、D-天門冬氨酸D-絲氨酸醋竹桃霉素利福霉素二甲胺四環(huán)素明膠氨基乙酰-L-脯氨酸L-丙氨酸L-精氨酸L-天門冬氨酸、L-組氨酸、L-焦谷氨酸、林可霉素、鹽酸胍、硫酸四癸鈉、D-半乳糖醛酸、L-半乳糖酸內(nèi)酯、粘酸、D-葡糖二酸、P-羥基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、檸檬酸、α -氧代戊二酸、D-蘋果酸、亞碲酸鉀、 氧代丁酸甲酸和溴酸鈉。)
通過實(shí)施本發(fā)明的具體技術(shù)指標(biāo)，可達(dá)到以下預(yù)期效果。
[0013]本發(fā)明的海洋芽抱桿菌rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM26900τ)可在較高鹽濃度下正常生長，硝酸鹽還原陽性，能夠水解Tween 80和使明膠液化，可廣泛應(yīng)用在酯酶生產(chǎn)和各種基因工程產(chǎn)品高鹽濃度下發(fā)酵領(lǐng)域。
[0014]下面舉實(shí)施例說明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例
【專利附圖】

【附圖說明】:圖1是掃描電子顯微鏡20000倍下菌株P(guān)T-1l的形貌。圖2是基于16SrDNA序列構(gòu)建的PT-1l和相關(guān)菌種系統(tǒng)發(fā)育樹。圖3是PT-1l在不同鹽濃度下的生長狀況。圖 4 是 Biolog 結(jié)果其中 I 至 4 為屬 Oceanobacillus 的 profundus、PT_ll、iheynsis、bavariensis。圖 5 是酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果 l、Oceanobacillus profundus DSM 18246T ;2、PT_11。圖 6 是其他特征數(shù)據(jù) 1、ΡΤ-11 ;2、Ornithinibacillus bavariensis 3、Oceanobacillusprofundus
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例一:海洋芽抱桿菌Oceanobacillus rekensis的篩選和分離 樣品采集與菌株篩選分離
樣品采集于新疆維吾爾族自治區(qū)莎車縣。樣品來自多個(gè)區(qū)域，分布于東經(jīng)76° 1 57"至77° 46' 30"、北緯37° 27' 30"至39° 15"之間。用無菌玻璃瓶收取距表層5-lOcm 土壤 ，經(jīng)風(fēng)干，研磨，過篩，置于4°C保存，用于后續(xù)分離。篩選培養(yǎng)基選用苯酚富集培養(yǎng)基(PT)，腐殖酸富集培養(yǎng)基(HVA)，鑰酸鈉富集培養(yǎng)基(HNA)和高鹽富集培養(yǎng)基(YCSS)，純化培養(yǎng)基選用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB+10% NaCl)，通過接種不同的富集培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行篩選。將Ig 土樣加入裝有25ml液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在28°C下振蕩培養(yǎng)7天。然后用移液槍吸取富集液，作10倍梯度稀釋，取200 μ I 10-廣10-4倍數(shù)稀釋液分別涂布到對應(yīng)培養(yǎng)基平板上，置于28°C下繼續(xù)培養(yǎng)一周。觀察生長狀況與形態(tài)特征，將長出的菌落轉(zhuǎn)接至TSB固體培養(yǎng)基，經(jīng)多次劃線，再挑取單菌落轉(zhuǎn)接至TSB斜面培養(yǎng)基，置于4°C作短期保藏。同時(shí)取新鮮菌液混合25%濃度甘油，置于-80°C作長期保藏。(所有培養(yǎng)基配方見下表)
苯酚富集培養(yǎng)基(PT):酪蛋白胨7.58，氯化鈉10(^，酵母浸出物1(^，苯酚69(^1 ,MS混合液 I unit，無菌水 1000ml，ρΗ8.2-8.5。
[0016]腐殖酸富集培養(yǎng)基(HVA):腐殖酸Ig,氯化鈉150g , MS混合液I unit,無菌水1000ml ，pH8.2-8.5。
[0017]鑰酸鈉富集培養(yǎng)基(HNA):酪蛋白胨7.5g，氯化鈉150g，酵母浸出物IOg ,MS混合液 I unit,無菌水 1000ml , ρΗ8.2-8.5。
[0018]高鹽富集培養(yǎng)基(YCSS):酪蛋白胨7.5g，氯化鈉250g，酵母浸出物10g，MS混合液 I unit,無菌水 1000ml , ρΗ8.2-8.5。
[0019]MS混合液:濃度為0.05g/L相容性物質(zhì)(甜菜堿，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨酸鹽)混合液1.5ml ;濃度為0.05g/L氨基酸(天冬氨酸，組氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，纈氨酸，亮氨酸，酪氨酸，谷氨酸)混合液15ml ;濃度為0.025mg/L維生素(VBl，VB2, VB12, VB6, VH,VM, VPP)混合液 0.25ml ο[0020]胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB+10% NaCl):胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCl 100g，瓊脂粉 18g，蒸餾水 1000ml, ρΗ8.0-8.2。
[0021]菌株描述:
革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.3-0.51.0-1.2 μ m，菌落呈奶油色，NaCl耐受范圍為5%-20%(最佳鹽濃度為5%_12%)，pH生長范圍為6.5-10.0 (最佳pH范圍為8.0-9.0)，溫度生長范圍為15-40°C (最佳生長溫度為30_37°C )。氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解吐溫-80和明膠，不能水解淀粉和纖維素。其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性。細(xì)胞主要脂肪酸為anteisO-C15:0和iso_C15:0，主要呼吸醌為MK-7，細(xì)胞壁肽聚糖類型主要為內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，主要極性脂為磷脂酰甘油(PG)。DNA (G+C)含量為36.7 mol%。
[0022]實(shí)施例二:海洋芽孢桿菌Oceanobacillus rekensis的多相分類鑒定
對該菌株OceamAmciIlus rekensis PT-1It的形態(tài)觀察、生理生化及培養(yǎng)特性和化學(xué)分類均按照《放線菌系統(tǒng)學(xué)——方法、原理與實(shí)踐》進(jìn)行。其中碳源利用情況采用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，采用高效液相法來測定該菌的醌組分和細(xì)胞內(nèi)GC含量，脂肪酸成分測定采用美國MIDI公司SheiOlock全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析，酶學(xué)特性采用 API Tm'1^熱備簽定，參考舊株為 Oceanobacillusprofimdus CL-MP28T (DSM 18246τ)、Oceanobacillusiheynsis>Ornithinibadllusbavariensis WSBC 24001τ,碳源利用情況米用Biolog全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)測定。結(jié)果見圖4、5和6.從酶活結(jié)果來看，該菌株P(guān)T-1l與親緣性最近對照模式菌 OceanobaciIlusprofundusDSM 18246τ有4種酶活性不同；在碳源利用方面，共有13種情況不同；模式菌株GC含量明前高于測試菌株P(guān)T-1I，結(jié)合進(jìn)化樹數(shù)據(jù)，判斷該株菌為海洋芽孢桿菌屬的一個(gè)新種。
[0023]實(shí)施例三:16S rDNA測序及進(jìn)化樹構(gòu)建
采用SDS法提取細(xì)菌總DNA，通過PCR法擴(kuò)增菌株16S rRNA基因序列，DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。到GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫將各菌株測得的16S rRNA基因部分序列提交注冊獲得序列號。再在NCBI (NationalCenter for Biotechnology Information)上進(jìn)行BLAST比對，找到親緣關(guān)系最近的菌株。通過BioEdit將親緣性最近的相應(yīng)菌株進(jìn)行序列比對，然后在軟件MEGA 5.0上分別使用Neighbor-Joinin(N-J)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)化樹bootstrap為1000。PCR相應(yīng)引物、反應(yīng)體系、條件如下:引物 PA8: 5’ -CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 PB1:5’ -CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，反應(yīng)體系(25 μ I 體系):Mg2+ 2.5 μ IjPA8
2.5 μ IjPB1 2.5 μ l，dNTP 0.75 μ 1,Η20 14 μ l，Taq 酶 0.25 μ 1，反應(yīng)條件 95°C預(yù)變性 5min,94°C變性45s，50°C退火45s，延伸lmin，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72°C保溫lOmin。構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖二
實(shí)施例四:海洋芽抱桿菌 Oceanobacillus rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM26900τ)的應(yīng)用
用試管配制明膠液化培養(yǎng)基，121°C滅菌20min，將菌株穿刺接種，在30°C恒溫箱中靜置培養(yǎng)30天，分別在5，10,20,30天觀察記錄明膠液化程度。觀察前將試管冷卻20-30min或用自來水沖洗30min,可以更清晰的觀察到液化程度。結(jié)果分析莎車芽孢桿菌HNA-14T=CICC 1055#可使明膠液化。[0024]實(shí)施例五:海洋芽抱桿菌6fc<9a/7oAaci77w5.rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM26900T)的應(yīng)用
硝酸鹽還原:滴加格里斯氏試劑Α，B到待測細(xì)菌培養(yǎng)液中，若變紅色，則為硝酸鹽還原陽性，若不變色，滴加二苯胺試劑后，仍不呈藍(lán)色，則為硝酸鹽還原陰性。結(jié)果顯示測試菌株P(guān)T-1l顯紅色，所以為硝酸鹽還原陽性。
[0025]實(shí)施例六:海洋芽抱桿菌rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM26900τ)的應(yīng)用
酯酶活性:將測試菌株P(guān)T-1l接種到含有1%的Tween 80的TSA培養(yǎng)基上，觀察是否有暈圈出現(xiàn)，若出現(xiàn)則為陽 性，若否，則為陰性。結(jié)果顯示有暈圈出現(xiàn)，證明該菌株有酯酶活性。
【權(quán)利要求】
1.一種中度耐鹽海洋芽抱桿菌 6fc<9a/7oAaci77w5.rekensis PT-1It (=KCTC 33144t=DSM26900τ)。
2.如權(quán)利要求1所述的中度耐鹽海洋芽孢桿菌rekensisPT-1It(=KCTC 33144T=DSM 26900τ)，其特征是革蘭氏陽性菌，嚴(yán)格好氧，產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性，細(xì)胞大小為0.3-0.5X1.0-1.2 μ m，菌落呈奶油色，NaCl耐受范圍為5%_20%(最佳鹽濃度為5%-12%)，pH生長范圍為6.5-10.0 (最佳pH范圍為8.0-9.0)，溫度生長范圍為15-40°C (最佳生長溫度為30-37°C )，氧化酶和過氧化氫酶陽性，脲酶陰性，具有硝酸還原能力，可以水解吐溫-80和明膠，不能水解淀粉和纖維素，其生長過程中不產(chǎn)生H2S和吲哚，M.R.和V.P.實(shí)驗(yàn)陰性，細(xì)胞主要脂肪酸為anteisO-C15:0和iso-C15:0，主要呼吸醌為MK-7，細(xì)胞壁肽聚糖類型主要為內(nèi)消旋二氨基庚二酸(meso-DAP)，主要極性脂為磷脂酰甘油(PG)，DNA (G+C)含量為 36.7 mol%。
【文檔編號】C12N1/20GK103952347SQ201410162876
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】田永強(qiáng), 劉波, 田杰偉 申請人:四川大學(xué)