一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于豬分子標記制備與應用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬IGFBP1基因內(nèi)含子基因片段作為豬木乃伊胎數(shù)性狀的分子標記。本發(fā)明通過制備得到一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示，在序列表SEQ?ID?NO:1第124bp處存在一個T/C堿基突變，該突變導致PCR-BsmFⅠ-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了該分子標記的制備方法及其在豬木乃伊胎數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析中的應用。為豬木乃伊胎數(shù)性狀標記檢測提供了新的標記資源。
【專利說明】一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及豬分子標記制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記及其應用，利用豬IGFBPl基因編碼區(qū)SNP作為豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，它包括豬IGFBPl基因編碼區(qū)序列突變位點的檢測方法與應用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬肉是我國居民日常生活中的主要肉類制品，產(chǎn)仔數(shù)與產(chǎn)活仔數(shù)是決定豬肉產(chǎn)量的重要繁殖性狀。陳克飛等研究發(fā)現(xiàn)，在中國母豬單胎產(chǎn)仔數(shù)增加I頭，將額外為相關(guān)產(chǎn)業(yè)帶來190億的利潤(陳克飛and李寧，2000)。木乃伊胎是影響產(chǎn)活仔數(shù)的關(guān)鍵因子，也是制約我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要因素。[0003]胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)是一種擁有類似胰島素分子結(jié)構(gòu)的促生長因子。它能夠介導生長激素促進胎兒生長的作用。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)能夠結(jié)合并調(diào)節(jié)IGF-1，IGFBP存在于人體不同的器官組織之中并發(fā)揮著不同的生理作用。按照發(fā)現(xiàn)時間的先后，IGFBP 家族被依次命名為 IGFBP1-6 和 IGFBPrp (Ferry Jr et al.，1999)。IGFBPs同源性很高，其中IGFBPl的作用尤為突出，它能夠運輸IGF-1與受體結(jié)合并在結(jié)合過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。IGFBPl自身也能對血管、生殖器官的發(fā)育及其疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生較大影響豬IGFBPl基因定位于18號染色體，全長5607bp，含有四個外顯子，三個內(nèi)含子。mRNA長度為837bp。IGFBPl在母體中濃度的改變是蛻膜化的重要標志，蛻膜化對于胚胎成功植入子宮內(nèi)膜非常關(guān)鍵。IGFBPl與IGF-2—起調(diào)節(jié)子宮細胞的增殖分化過程，影響著胎盤發(fā)育。兩者能在胚胎植入時期的母胎界面細胞中高表達，以實現(xiàn)胚胎滋養(yǎng)層與子宮內(nèi)膜蛻膜之間的信息交流。在妊娠早期，IGFBPl通過抑制IGF-2的活性以及限制整合素α 5 β I的作用阻止胚泡滋養(yǎng)層侵入子宮內(nèi)膜蛻膜。IGFBPl對IGF-2的調(diào)節(jié)作用需要協(xié)同Η0ΧΑ10基因和轉(zhuǎn)錄因子FKHR—起完成。而在胎盤發(fā)育過程中，IGFBPl通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的水平來完成對胎盤中IGF活性的調(diào)節(jié)以控制胎盤組織發(fā)育過程(Coppock et al.，2004) 0IGFBPI還能影響胎兒發(fā)育。Street等發(fā)現(xiàn)，胎兒出生時的體重與妊娠晚期母體血清中IGFBPl的水平呈負相關(guān)(Street et al.，2006)。IGFBPl是一種生長抑制劑，它與IGFs共同參與調(diào)節(jié)胎兒生長發(fā)育。Fang Q等通過檢測懷孕6-10周婦女血清中IGFBPl表達水平發(fā)現(xiàn)，表達水平較高的婦女分娩時出現(xiàn)畸形胎的幾率較高。這表明，母體IGFBPl表達情況與畸形胎的形成及個數(shù)存在某種聯(lián)系。IGFBPl在血清中的表達水平可以用來預測胚胎發(fā)育是否正常。在蛻膜化早期，基質(zhì)細胞中IGFBPl的異常表達能夠使胚胎絨毛滋養(yǎng)細胞侵入子宮內(nèi)膜過淺，引起母胎物質(zhì)交換減少，胚胎無法攝入必要營養(yǎng)物質(zhì)。在妊娠中后期，IGFBPl與IL-6表達量過高會抑制IGF-1的胰島素樣活性進而降低胚胎對外周葡萄糖的吸收和利用，這會造成胚胎營養(yǎng)攝入不足。在母豬妊娠過程中，胎盤生長停滯，胚胎攝入營養(yǎng)不足是導致木乃伊胎的重要原因。Linville等發(fā)現(xiàn)，催乳素受體基因(PRLR)等位基因A可以降低木乃伊數(shù)，這表明基因型是影響木乃伊數(shù)的因素之一(Linville et al.，2001)。而IGFBPl可以作為研究豬木乃伊胎數(shù)的候選基因。[0004]大部分繁殖性狀的遺傳結(jié)構(gòu)是非常復雜的。目前，標記輔助選擇(MAS)已作為常規(guī)選擇法的輔助手段而被廣泛應用，大大提高了繁殖性狀的改良速度。標記輔助選擇(MAS)包括隨機引物擴增多態(tài)性(RAPD)標記、微衛(wèi)星標記、PCR-RFLP標記等(趙西彪，2008)。其中PCR-RFLP因檢測不受發(fā)育階段、性別等外部條件的影響，所標記的變異數(shù)目不受限制，實用可靠而得到廣泛的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，獲得一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，克隆IGFBPl基因編碼區(qū)序列，尋找突變位點以及基因多態(tài)性的檢測方法，為豬木乃伊胎數(shù)性狀檢測提供一種分子標記和應用檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述:
[0007] 申請人:通過克隆得到一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，它包含豬(國外血緣豬大白豬和中國地方豬血緣豬陸川豬、隆林豬)IGFBPl基因757bp的序列，該分子標記的核苷酸序列如下所示:
[0008]CCAGGCTTCCACAAATGCGCCTGTGGCTACTTCAGAAGCAAAACCACAGGGCACTCTGGCCAAGCCTGAGGTTTACTATT TTCCCAGAACAGAACTGGCCTTGCCGTTGGGTCATCCCTGTCCRCCGAAACCATCAGAAGTTCCTTTAAAGGGGGAGGAG GCGGTAGTCTGGGTCAGCACAAGCATCCTGTCCTGGTCTGGTTCTGCACGAAGGGAGGCACCTGTCAGTGGCGGCAAATG CTTGGCAGAGGGGCTCATGGGCTTTTGACTTTCTGTTTTCAGAGACAAAGGACCCCGCTGCCCCAGAGACTACGTCCCCT GAGAGCACAGAGATGACCCAGGAGCAGCTCCTGGACAGTTTCCACCTGATGGCCACGTCCAGCGAAGACCTGCCCATCCT TTGGAACGCCATCAATAATTATGAGAGCATGAAGGCTCTCGAGGCCACCGACATCAAGAAGTGGAAGGTGAGGCCCCGGG GCAGGTGGACTCTTTCGCTTGGACCTGCTGGGCGGTGCTGGTCCGGTTCTGAGCCCTGGATAGAAACACGTTTCCTCCCA AAGACATCTCTCAGCTTAGCTTTGTTGAGCTTTTAACACCAGCGCTTTCAGCAGAGGAGGCTGCTGGATGGAAAGAAAAT GCAGCTTGTCCTGTGCAACTTGAGATGTATTATCTCATGTCTCTGAGCTCATCTCTAAAATCAGGGTATCGGTCTTCATA ATAAAAGTTAGCATTTTTACCATTCAGTGGCACTCCC
[0009]上述序列第124bp處的R是T或C，導致PCR-BsmF 1-RFLP多態(tài)性。
[0010] 申請人:設計了一種擴增上述基因片段和檢測該基因片段多態(tài)性的的引物對，其DNA序列如如下所示:
[0011]正向引物:CCAGGCTTCCACAAATGCG,
[0012]反向引物:GGGAGTGCCACTGAATGGTAAA。
[0013] 申請人:提供了一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記的制備方法，其特征在于下列步驟:
[0014]從大白豬、陸川豬、隆林豬耳緣組織中提取基因組DNA，在位于豬IGFBPl基因突變位點附近設計一對引物，該引物對的DNA序列如序列表SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示，對豬基因組DNA進行PCR擴增和序列測定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通過序列比對，篩查SNP，再利用SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物對進行PCR擴增，將PCR擴增獲得的片段進行BsmF I酶切分型及檢測。
[0015]本發(fā)明的分子標記可以在豬木乃伊胎數(shù)性狀標記輔助選擇中的應用。
[0016]顯然本發(fā)明設計的引物對也可以在豬木乃伊胎數(shù)性狀標記輔助選擇中的應用。[0017]本發(fā)明提供了鑒定上述序列124bp處Τ/C變異的BsmF 1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法。
[0018]進一步本發(fā)明提供了利用BsmF 1-RFLP方法確定的不同基因型個體與木乃伊胎數(shù)性狀間的關(guān)聯(lián)分析。
[0019]更詳細的發(fā)明方案見《【具體實施方式】》所述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]序列表SEQ ID N0:1是本發(fā)明擴增的國外血緣豬種“大白豬”和中國地方血緣豬種“陸川豬”、“隆林豬”的核苷酸序列，序列長度為757bp，在該序列的124bp處存在一個T/
C等位基因突變。
[0021]序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明制備SEQ ID NO:1特異基因片段所用的正向引物，也是實施豬Τ/C變異BsmF 1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的正向引物。
[0022]序列表SEQ ID NO: 3是制備SEQ ID NO:1特異基因片段所用的反向引物，也是實施豬Τ/C變異BsmF 1-RFLP (限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性)基因型分型方法的反向引物。 [0023]圖1:為本發(fā)明三個豬種IGFBPl基因序列測序結(jié)果和SNP位點。
[0024]圖2:為本發(fā)明豬IGFBPl基因擴增所得目的片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。瓊脂糖凝膠濃度為2%，圖中標記:M泳道為DNA Marker DL2000，泳道I為序列表SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示引物在不同豬種中的擴增片段，片段大小為757bp。
[0025]圖3:為豬IGFBPl基因BsmF 1-RFLP檢測結(jié)果。瓊脂糖凝膠濃度為3%，圖中標記:M泳道為DNA Marker DL2000, CC基因型片段大小分別為457bp、176bp和124bp, TT基因型片段大小分別為457bp、300bp，而雜合基因型TC片段大小分別457bp、300bp、176bp和124bp。
[0026]圖4:為本發(fā)明擴增的豬的核苷酸序列(即本發(fā)明制備的分子標記)，在該序列的124bp處存在一個等位基因突變(圖4所示序列中的124bp處的R是T或C)。
【具體實施方式】
[0027]實施例1:1GFBPl基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立
[0028]豬IGFBPl基因序列擴增
[0029](I)采集耳組織樣
[0030]選擇一個國外血緣豬種(大白豬)和兩個中國地方豬血緣豬種(陸川豬、隆林豬，上述品種來自翔豬基因公司西江泰和豬場)為試驗材料，采取豬的耳緣組織；
[0031](2)基因組DNA提取
[0032]從豬的耳緣組織中提取豬的基因組DNA，DNA樣品全部采用北京天根生化技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因組DNA試劑盒(TIANamp Genomic DNA KU，按該試劑盒說明書進行操作)提取。
[0033]⑶引物設計
[0034]根據(jù)豬IGFBPl基因(登錄號Gene ID: 397270)突變位點附近序列，設計一對特異引物。其中
【權(quán)利要求】
1.一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記，其核苷酸序列如下所示:
2.一種擴增如權(quán)利要求所述分子標記的引物對，其DNA序列如如下所示: 正向引物:CCAGGCTTCCACAAATGCG， 反向引物:GGGAGTGCCACTGAATGGTAAA。
3.一種與豬木乃伊胎數(shù)性狀相關(guān)的分子標記的制備方法，其特征在于下列步驟: 從大白豬、陸川豬、隆林豬耳緣組織中提取基因組DNA，在位于豬IGFBPl基因突變位點附近設計一對引物，該引物對的DNA序列如序列表SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示，對豬基因組DNA進行PCR擴增和序列測定，得到如序列表SEQ ID NO:1所示的基因片段，通過序列比對，篩查SNP，再利用SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物對進行PCR擴增，將PCR擴增獲得的片段進行BsmF I酶切分型及檢測。
4.權(quán)利要求1所述的分子標記在豬木乃伊胎數(shù)性狀選擇中的應用。
5.權(quán)利要求2所述的引物對在豬木乃伊胎數(shù)性狀選擇中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103923912SQ201410163553
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月20日
【發(fā)明者】趙書紅, 陳尚上, 林瑞意, 朱猛進, 李新云, 曹建華, 李長春, 余梅 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學