一株蠟狀芽胞桿菌及其分泌的殺線蟲蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株蠟狀芽胞桿菌(Bacillus?cereus)，其代號(hào)為CM7，用于專利程序的保藏編號(hào)為CGMCC?No.4233。該菌株的發(fā)酵液中存在一種菌體分泌的蛋白物質(zhì)能殺死線蟲，該蛋白能通過硫酸銨沉淀和柱層析分離出來，分子量大小為38.5kD，等電點(diǎn)(pI)為7.77，由376個(gè)氨基酸組成。CM7菌株能穩(wěn)定定殖在番茄等多種植物根內(nèi)并抑制根結(jié)線蟲的侵入減少結(jié)瘤，根結(jié)抑制率在90％以上。因此，該菌株制成的菌劑可以防治植物根結(jié)線蟲病。
【專利說明】一株蠟狀芽胞桿菌及其分泌的殺線蟲蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及生物防治植物寄生線蟲的技術(shù)和功能菌株的應(yīng)用，主要是一株蠟狀芽胞桿菌及其分泌的殺線蟲蛋白物質(zhì)在生物防治植物寄生線蟲的應(yīng)用，屬于農(nóng)作物防病【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]植物線蟲是植物侵染性病原之一，它們寄生在各種植物的根、莖、葉、花、芽和果實(shí)上。線蟲比其他重要病原一真菌、細(xì)菌、病毒等，具有主動(dòng)侵襲寄主和自行轉(zhuǎn)移為害的特點(diǎn)，它們對(duì)植物的危害，除吸取寄主的營(yíng)養(yǎng)和對(duì)植物的組織造成機(jī)械的損傷外，主要在于現(xiàn)場(chǎng)的分泌物和唾液等，能引起植物產(chǎn)生一系列的生理病變，從而破壞植物的正常代謝和機(jī)能，影響生長(zhǎng)和發(fā)育，致使植物的產(chǎn)量減少，品質(zhì)下降，甚至死亡和絕產(chǎn)。根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.是嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類土傳病原,可以寄生于多種農(nóng)作物,尤其是蔬菜，在熱帶和亞熱帶地區(qū)造成了嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來，隨著我國(guó)溫室蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大，蔬菜根結(jié)線蟲并的發(fā)生逐年加重，已經(jīng)成為無公害溫室蔬菜生產(chǎn)的一大障礙。多年來，國(guó)內(nèi)外不斷加強(qiáng)對(duì)根結(jié)線蟲的防治工作，包括化學(xué)殺線劑的使用、選育抗病品種和生物防治等。由于化學(xué)殺線劑的使用會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境造成污染以及破壞人體健康，而生物防治不會(huì)有此問題的產(chǎn)生，有利于環(huán)境保護(hù)、維護(hù)人類健康和維護(hù)生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)，因此生物防治植物寄生線蟲已經(jīng)成為今年來研究熱點(diǎn)。
[0003]植物內(nèi)生細(xì)菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各個(gè)組織和器官內(nèi)部、可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生的細(xì)菌。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌可以在植物體內(nèi)穩(wěn)定定殖并且自身代謝產(chǎn)物可以影響到植物，因此使其具有促生作用，生防作用，非豆科植物的固氮作用以及作為外源基因的載體等生物學(xué)作用。蔡學(xué)清等(蔡學(xué)清，林彩萍，何紅,等.內(nèi)生枯草芽孢桿菌Bs - 2對(duì)水稻苗生長(zhǎng)的效應(yīng)[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，34 (2):189—194)在研究?jī)?nèi)生枯草芽孢桿菌Bs_2菌株對(duì)水稻苗促生作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，用該菌的菌體、不同菌液含量及外分泌物對(duì)水稻苗生長(zhǎng)均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用，提高其對(duì)外界環(huán)境的抗逆性，促其生長(zhǎng)。因此植物內(nèi)生細(xì)菌作為自然界廣泛存在又能穩(wěn)定定殖的菌種資源在促生以及生防等方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]植物線蟲是植物侵染性病原之一，它們寄生在各種植物的根、莖、葉、花、芽和果實(shí)上。線蟲比其他重要病原一真菌、細(xì)菌、病毒等，具有主動(dòng)侵襲寄主和自行轉(zhuǎn)移為害的特點(diǎn)，它們對(duì)植物的危害，除吸取寄主的營(yíng)養(yǎng)和對(duì)植物的組織造成機(jī)械的損傷外，主要在于現(xiàn)場(chǎng)的分泌物和唾液等，能引起植物產(chǎn)生一系列的生理病變，從而破壞植物的正常代謝和機(jī)能，影響生長(zhǎng)和發(fā)育，致使植物的產(chǎn)量減少，品質(zhì)下降，甚至死亡和絕產(chǎn)。根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.是嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類土傳病原,可以寄生于多種農(nóng)作物,尤其是蔬菜，在熱帶和亞熱帶地區(qū)造成了嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來，隨著我國(guó)溫室蔬菜種植面積不斷擴(kuò)大，蔬菜根結(jié)線蟲并的發(fā)生逐年加重，已經(jīng)成為無公害溫室蔬菜生產(chǎn)的一大障礙。多年來，國(guó)內(nèi)外不斷加強(qiáng)對(duì)根結(jié)線蟲的防治工作，包括化學(xué)殺線劑的使用、選育抗病品種和生物防治等。由于化學(xué)殺線劑的使用會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境造成污染以及破壞人體健康，而生物防治不會(huì)有此問題的產(chǎn)生，有利于環(huán)境保護(hù)、維護(hù)人類健康和維護(hù)生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)，因此生物防治植物寄生線蟲已經(jīng)成為今年來研究熱點(diǎn)。
[0005]彭雙等(彭雙，楊茹，聞淑珍，陳雙林.殺線蟲植物內(nèi)生細(xì)菌和根際放線菌對(duì)根結(jié)線蟲的防效[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2012，,39(1):63-69)從六種植物體內(nèi)分離出112株內(nèi)生細(xì)菌，以松材線蟲為靶標(biāo)篩選到16株內(nèi)生細(xì)菌具有殺線蟲活性，其中13株內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵上清液對(duì)松材線蟲的24h殺線蟲率均達(dá)到了 100%，在番茄移栽時(shí)施入內(nèi)生細(xì)菌BCM2的固體菌劑抑制根結(jié)率達(dá)到了 83.31%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了生物防治植物寄生線蟲，減少高度農(nóng)藥的使用，本發(fā)明提供了一株能分泌殺線蟲蛋白的蠟狀芽孢桿菌，以及該菌株在生防植物根結(jié)線蟲的應(yīng)用。[0007]本發(fā)明所說的蠟狀芽胞桿菌，其代號(hào)為CM7，是蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)它的保藏編號(hào)為CGMCC N0.4233。
[0008]本發(fā)明還公開了蠟狀芽胞桿菌CM7菌體分泌的殺線蟲蛋白，該殺線蟲蛋白能在蠟狀芽胞桿菌CM7發(fā)酵液中通過常規(guī)的硫酸銨沉淀和柱層析方法分離出來，分子量和等電點(diǎn)測(cè)定采用常規(guī)的電泳技術(shù)方法，該殺線蟲目的條帶單一，共計(jì)有376個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為38.5kD,其等電點(diǎn)(pi)值為7.77，詳見附圖1。
[0009]蠟狀芽胞桿菌CM7菌株能通過沾根或傷根接種方法穩(wěn)定定殖在番茄等多種植物根內(nèi)并抑制根系結(jié)瘤，調(diào)查結(jié)瘤抑制率防效在90%以上。因此，該菌株制成的菌劑可以防治植物根結(jié)線蟲病，本發(fā)明還公開了由所述的蠟狀芽胞桿菌CM7制成的殺線蟲菌劑。。
[0010]本發(fā)明公開了上述蠟狀芽胞桿菌CM7在防治植物根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。具體的應(yīng)用方法是將蠟狀芽胞桿菌CM7通過人工接種方法在番茄等植物根內(nèi)定殖。
[0011]蠟狀芽胞桿菌CM7用于生物防治植物根結(jié)線蟲的人工接種方法:可以是在番茄等植物移栽時(shí)采用常規(guī)沾根接種或菌劑施入植物根部接種的方法。
[0012]上述方法中的蠟狀芽胞桿菌CM7用于沾根接種的菌懸液，是采用下述兩種方法制備:方法一:選用常規(guī)發(fā)酵方法繁殖菌體，去除發(fā)酵液，留下菌體用生理鹽水懸浮制成的菌懸液，含菌量用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)達(dá)到IX IO5~5.0X IO5個(gè).g-ι為CM7的菌懸液。方法二:干燥的菌劑1:100加入溫水(20-40°C )攪拌均勻5-8小時(shí)后為菌懸液。
[0013]上述方法中的干燥菌劑的制備方法是常規(guī)發(fā)酵菌體，發(fā)酵液和載體(土壤細(xì)粉或滑石粉或麥麩細(xì)粉等)4:1比例混合均勻，40°C烘干到完全干燥，該干燥菌劑在干燥條件保臧時(shí)間是1_2年。
[0014]上述方法中的蠟狀芽胞桿菌CM7用于菌劑施入植物根部接種的方法是:干燥菌劑拌入細(xì)土，比例是1:50，番茄等植物移栽時(shí)施入根部，每株植物用量30-50克。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是CM7菌株殺線蟲蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中:樣品I是柱層析時(shí)收集殺線蟲活性最高的第一管，樣品2是第二管，樣品3是第三管，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白濃度降低。
[0016]圖2:植物內(nèi)生細(xì)菌CM7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0017]本發(fā)明所說的蠟狀芽胞桿菌CM7，于2010年10月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，分類命名為蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)，它的保藏編號(hào)為CGMCCN0.4233。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:具殺線蟲活性植物內(nèi)生細(xì)菌的篩選和定殖測(cè)定
[0019]取植物材料流水清洗表面，用0.1 %升汞浸泡lmin，無菌水清洗5次后于1%NaClO中浸泡5min，再用無菌水清洗5次，轉(zhuǎn)移至無菌組織勻漿器中搗碎，加入IOmL無菌水，靜置5min后取上層汁液梯度稀釋，各稀釋度取0.1mL分別涂布NA平板，28°C培養(yǎng)I~7d，挑取形態(tài)不同的單菌落純化保存。取0.1mL最后一次漂洗消毒材料的無菌水，涂平板，驗(yàn)證消毒是否徹底。從六種植物體內(nèi)分離出112株植物內(nèi)生細(xì)菌，其中有64株可以在黃瓜無菌苗中穩(wěn)定定殖，接種7d定殖量均能達(dá)到IXlO5Cfu/株，其中CM7菌株能達(dá)到2X IO6Cfu/株，對(duì)照處理苗中未檢測(cè)到細(xì)菌。從這64株內(nèi)生細(xì)菌中篩選到16株對(duì)松材線蟲具有殺線蟲活性，其中CM7菌株的發(fā)酵上清液對(duì)松材線蟲的24h殺線蟲率達(dá)到了 100%。
[0020]取飽滿的黃瓜種 子清水浸泡2h，表面消毒(方法同上)，放到裝有IOmL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的帶蓋試管中，25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，取子葉展開生長(zhǎng)狀況良好的試管苗，將0D600 = 0.5±0.02 (約107cell/mL)的待測(cè)菌株菌液用傷根法穿刺接種到試管苗莖基部，0.2mL/株，每菌處理3株黃瓜無菌苗，無菌水處理為空白對(duì)照。置25°C光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，取出整株苗按照上述方法分離內(nèi)生細(xì)菌，并統(tǒng)計(jì)內(nèi)生細(xì)菌定殖數(shù)量。CM7菌株可以在黃瓜無菌苗中穩(wěn)定定殖，接種7d定殖量均能達(dá)到2 X IO6Cfu/株，對(duì)照處理苗中未檢測(cè)到細(xì)菌。
[0021]實(shí)施例2:CM7菌株的鑒定
[0022]CM7菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定方法按常規(guī)方法進(jìn)行(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社，2001.)。菌株CM7態(tài)特征和生理生化特性見表1:菌落圓形，邊緣缺刻，表面光滑干燥有光澤(似蠟)，無粘性，不透明，淡黃色，在LB液體培養(yǎng)基中呈混濁，不形成菌膜。
[0023]表1:殺線蟲活性植物內(nèi)生細(xì)菌CM7的形態(tài)特征和生理生化特性
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一株蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus) CM7，它的保藏編號(hào)為CGMCC N0.4233 ；
2.一種由權(quán)利要求1所述的蠟狀芽胞桿菌CM7菌體分泌的殺線蟲蛋白，其特征在于該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.權(quán)利要求1所述的蠟狀芽胞桿菌CM7在防治植物根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，是將蠟狀芽胞桿菌CM7通過人工接種方法在植物根內(nèi)定殖。
5.一種由權(quán)利要求1所述的 蠟狀芽胞桿菌CM7制成的殺線蟲菌劑。
【文檔編號(hào)】C12R1/085GK103937720SQ201410164404
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月22日
【發(fā)明者】閆淑珍, 陳雅麗, 胡海靜, 陳雙林 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)