一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其制備方法
【專利摘要】一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其制備方法，屬于基因工程及疫苗學【技術領域】。該疫苗抗原含有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。該制備方法包括熱激蛋白基因的克??；質粒pETDnaK的構建；質粒pETDnaK的誘導表達。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：1、安全無毒。避免發(fā)生弱毒疫苗的返祖現象，以及使用滅活疫苗大量多次免疫可能對水體造成的污染。2、高保護率。本發(fā)明的重組亞單位疫苗AHDnaK對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率可達81.8%。3、操作簡便。與價廉的商業(yè)佐劑弗氏佐劑混合后即可用于注射。
【專利說明】一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其制備方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程及疫苗學【技術領域】，具體涉及一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]嗜水氣單胞菌屬于弧菌科，氣單胞菌屬，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，具有高粘附力的嗜水氣單胞菌株可產生毒性很強的外毒素。嗜水氣單胞菌侵入水生動物后，在腸道內增殖，再進入肝臟、腎臟及其它組織，引起這些器官及血液病變，導致水生動物中爆發(fā)敗血癥等嚴重流行性疾病。
[0003]目前對其防治，仍主要依賴傳統(tǒng)藥物。在養(yǎng)殖魚類中新型抗嗜水氣單胞菌病疫苗的開發(fā)是近些年的研究熱點，但主要集中于全菌滅活疫苗和減毒活疫苗。上述兩種疫苗制備方法簡便，但是滅活疫苗在水產養(yǎng)殖動物中的使用需要大劑量、多次免疫接種，而減毒活疫苗的儲藏和運輸條件極高，有效期較短，且存在返毒風險，因此它們均可能引起較大的毒副反應。養(yǎng)殖龜鱉相關病害的疫苗開發(fā)遠落后于魚類，市場上并無實際可用的易長期保存、高效疫苗來防治中華鱉弧菌病害。在動物飼料中添加一些可誘發(fā)自身免疫的天然化合物以增強水產養(yǎng)殖動物自身免疫能力是預防相關致病菌感染的一條切實可行的途徑。亞單位疫苗即由具免疫活性的致病菌蛋白所制成的疫苗。亞單位疫苗通常僅含一種或者幾種致病菌蛋白質，因而能消除許多無關抗原所誘發(fā)的抗體，減少疫苗帶來的副反應以及因疫苗引起的其它疾病，開發(fā)新型高效的亞單位疫苗是預防致病菌感染的發(fā)展趨勢之一。
【發(fā)明內容】

[0004]針對現有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗及其制備方法的技術方案。
[0005]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特征在于該疫苗抗原含有SEQID N0.1所示的氨基酸序列。
[0006]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特征在于所述的疫苗為含有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的重組質粒pETDnaK轉化大腸桿菌BL21(DE3)中獲得的重組蛋白。
[0007]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
O熱激蛋白基因的克隆:以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用AH DnaK Fl和AHDnaK Rl為引物進行PCR擴增，將PCR產物純化后與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨芐青霉素、40 μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時后篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK Fl序列如SEQ ID N0.2所示，所述的引物AH DnaK Rl 序列如 SEQ ID N0.3 所示；2)質粒pETDnaK的構建:使用快速限制性內切酶SmaI酶切質粒pEASYDnaK，37°C水浴中孵育5分鐘后加入去磷酸化酶繼續(xù)孵育15分鐘后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基后37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pETDnaK ；
3)質粒pETDnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/pETDnaK，將BL21/ pETDnaK于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜培養(yǎng)；而后轉接至新鮮LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)至OD_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時后，收集菌體，并裂解離心收集上清,采用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得具有序列表SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
[0008]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟 I)中 PCR 條件為:94°C 5min 預變性模板 DNA，然后 94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，5 個循環(huán)后調整為 94°C 30s, 68°C lmin,72°C lmin，25 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。
[0009]所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗在制備預防和治療中華鱉對嗜水氣單胞菌的侵染疫苗制劑中的應用。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
1、安全無毒。避免發(fā)生弱毒疫苗的返祖現象，以及使用滅活疫苗大量多次免疫可能對水體造成的污染。
[0011]2、高保護率。本發(fā)明的重組亞單位疫苗AH DnaK對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率可達81.8%ο
[0012]3、操作簡便。與價廉的商業(yè)佐劑弗氏佐劑混合后即可用于注射。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:his親和層析柱回收獲得的重組蛋白DnaK的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果(泳道2)。泳道1，分子量標準。
【具體實施方式】
[0014]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
[0015]實施例1
重組亞單位疫苗AH DnaK的制備
1.1熱激蛋白基因的克隆 :以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用引物AH DnaKFl (5，- CCCGGGCATATGGGTAAAATCATCGGTATTGA -3’，該序列如 SEQ ID N0.2 所示，劃線堿基為 Sma I 酶切位點)和 AH DnaK Rl (5，- CCCGGGCTCGAGCTTCTTGTCGTCTTTCACTTC -3’，該序列如SEQ ID N0.3所示，劃線堿基為Sma I酶切位點)為引物進行PCR擴增，PCR條件為:94°C 5min預變性模板DNA，然后94°C 30s, 55°C lmin，72°C lmin，5個循環(huán)后調整為94°C 30s, 68°C lmin, 72 °C lmin，25個循環(huán)后72 °C延伸IOmin ;將PCR產物純化后與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨節(jié)青霉素、40μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基_β _D_硫代批喃半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時后篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASY DnaK。
[0016]1.2質粒pET DnaK的構建:使用快速限制性內切酶Sma I酶切質粒pEASY DnaK,37°C水浴中孵育5分鐘后加入去磷酸化酶繼續(xù)孵育15分鐘后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pET DnaK0
[0017]1.3質粒pET DnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，使用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/ pETDnaK,將BL21/ pETDnaK于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜培養(yǎng)；而后轉接至新鮮LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)至0D_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時后，收集菌體，并裂解離心收集上清，采用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
[0018]對亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK經測序分析，證實其為具有序列表SEQ ID N0.1所述的氨基酸序列的抗原蛋白。
[0019]實施例2
重組亞單位疫苗DnaK的免疫應用 2.1注射疫苗準備
取AH DnaK蛋白與弗氏完全佐劑混合，獲得終濃度為100 μ g/ml的AH DnaK蛋白疫苗注射液，所述PBS組成成分按重量百分比計:0.8%NaCl，0.02%KC1,0.358%Na2HP04.12H20, 0.024% NaH2PO4,其余為水。
[0020]2.2重組亞單位疫苗AH DnaK的免疫應用。將60只中華鱉(每只重約IOg)隨機分為兩組，每組30只，分別命名為A組和B組。A組每只中華鱉分別腹腔注射100 μ I上述2.1的疫苗注射液，B組每只中華鱉分別腹腔注射100 μ I上述2.1的PBS緩沖液。21天后進行第二次免疫注射，A組的每只中華鱉分別腹腔注射100μ I的疫苗注射液，B組每只中華鱉分別腹腔注射100 μ I的PBS緩沖液。
[0021]2.3嗜水氣單胞菌懸液的制備。在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)嗜水氣單胞菌至0D600為
0.8，4°C條件下5000轉離心力離心10分鐘，收集菌體，將其使用PBS緩沖液重新懸浮至終濃度為 5X107CFU/ml。
[0022]2.4重組亞單位疫苗AH DnaK針對嗜水氣單胞菌的免疫保護效應檢測。在上述2.2第二次免疫注射后一周，用上述2.3中的嗜水氣單胞菌懸液腹腔注射上述2.2中的兩組中華鱉，每只100 μ I的注射量。觀察每組中華鱉的死亡情況，14天后，統(tǒng)計各組中華鱉的死亡數目:Α組，2只；Β組，11只。采用下述公式計算相對成活率(RPS):
RPS=IOOX (1-免疫組中華鱉的總死亡百分比/D對照組中華鱉的總死亡百分比)
由此得出重組亞單位疫苗AH DnaK針對嗜水氣單胞菌的免疫保護效率(以RPS計)為81.8%。該結果表明，按照上述方法所制備和應用的AH DnaK是一種高效的保護性抗原，能夠顯著提高中華鱉對抗嗜水氣單胞菌的感染能力。
【權利要求】
1.一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特征在于該疫苗抗原含有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗，其特征在于所述的疫苗為含有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的重組質粒pETDnaK轉化大腸桿菌BL21 (DE3)中獲得的重組蛋白。
3.如權利要求1或2所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O熱激蛋白基因的克隆:以嗜水氣單胞菌基因組DNA為模板，使用AH DnaK Fl和AHDnaK Rl為引物進行PCR擴增，將PCR產物純化后與載體pEASY-Simple-Tl室溫連接10分鐘，將混合液轉化至大腸桿菌DH5 α中，在含有100 μ g /ml氨芐青霉素、40 μ g/ml X-Gal和24 μ g/ml異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16小時后篩選陽性克隆，獲得重組質粒pEASYDnaK，所述的引物AH DnaK Fl序列如SEQ ID N0.2所示，所述的引物AH DnaK Rl 序列如 SEQ ID N0.3 所示； 2)質粒pETDnaK的構建:使用快速限制性內切酶SmaI酶切質粒pEASYDnaK，37°C水浴中孵育5分鐘后加入去磷酸化酶繼續(xù)孵育15分鐘后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳回收熱激蛋白DnaK基因片段，將其插入pET259質粒Swa I多克隆位點處，轉化至大腸桿菌DH5 α中，使用含有50 μ g/ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基后37°C篩選陽性克隆，獲得重組質粒pETDnaK ； 3)質粒pETDnaK的誘導表達:將步驟2)所得質粒pETDnaK轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用含有50 μ g/ml 卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基37°C篩選陽性克隆，獲得轉化子BL21/pETDnaK，將BL21/ pETDnaK于含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜培養(yǎng)；而后轉接至新鮮LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)至OD_為0.6，加入終濃度為ImM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，繼續(xù)培養(yǎng)4個小時后，收集菌體，并裂解離心收集上清,采用his親和層析柱純化重組蛋白，即可獲得具有序列表SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的亞單位疫苗重組蛋白AH DnaK。
4.如權利要求3所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗的制備方法，其特征在于所述的步驟I)中PCR條件為:94°C 5min預變性模板DNA，然后94°C 30s, 55°C lmin，72°Clmin，5 個循環(huán)后調整為 94°C 30s, 68°C lmin,72°C lmin，25 個循環(huán)后 72°C延伸 lOmin。
5.如權利要求1所述的一種嗜水氣單胞菌熱激蛋白亞單位疫苗在制備預防和治療中華鱉對嗜水氣單胞菌的侵染疫苗制劑中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK104001164SQ201410164721
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權日:2014年4月23日
【發(fā)明者】黨偉, 陸洪良, 高原, 杜衛(wèi)國 申請人:杭州師范大學