一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA及其siRNA和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA及其siRNA和應(yīng)用，該基因cDNA全長為1867bp序列如SEQ.ID.NO.3所示。在獲取了其具體的序列之后，并設(shè)計(jì)siRNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染；采用該片段敲低HEC-1-B細(xì)胞中該長非編碼RAN分子的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性下降。因此該基因的功能可能與癌細(xì)胞的增殖能力相關(guān)。采用干擾片段siRNA1535敲低基因的表達(dá)水平后，腫瘤細(xì)胞的增殖活性明顯下降，可應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
【專利說明】—種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA及其siRNA和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA及其siRNA和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮內(nèi)膜癌(endometrialeareinoma, EC)是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20~30%，是最常見的生殖道惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率均有上升趨勢。在某些歐美國家，子宮內(nèi)膜癌己經(jīng)成為婦科惡性腫瘤的首位。國內(nèi)子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率也不斷升聞。子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率的增加可能與人均壽命延長、肥胖者增多、外源性雌激素的應(yīng)用等因素有關(guān)。
[0003]通過比較基因組與蛋白質(zhì)組學(xué)研究，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌組織中存在大量基因的突變與缺失，并存在大量異于正常組織的基因表達(dá)產(chǎn)物。這些結(jié)果都揭示了在子宮內(nèi)膜癌組織中特殊的細(xì)胞代謝模式以及基因表達(dá)調(diào)控方式。[0004]人類基因組并不是由孤立的基因和大量“垃圾DNA”組成的，所謂的垃圾基因?qū)嶋H上非常少。隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)人類基因組93%的序列都能夠轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物就主要為Inc RNA。這是一系列不編碼蛋白質(zhì)，但與基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞生理過程等生物學(xué)事件相關(guān)的RNA分子。這一類分子具有特殊的表達(dá)模式，分子結(jié)構(gòu)，以及生物學(xué)功能。
[0005]研究表明人類的許多疾病都和Inc RNA的表達(dá)異常相關(guān)，如白血病、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、阿爾茨海默病和糖尿病等。近年來科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了大量的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Inc RNA。H19是最早被發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的長片段ncRNA，其丟失與過表達(dá)與肝癌和乳腺癌的腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。MALAT-1 [14]的異常表達(dá)與NSCLC (非小細(xì)胞肺癌)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在前列腺癌中DD3是一個非常靈敏的分子標(biāo)志物，DD3可以在極高的正常細(xì)胞背景中指示癌細(xì)胞的存在，因此成為前列腺癌治療與檢測的重要的分子標(biāo)志物。
[0006]然而在子宮內(nèi)膜癌中具有功能Inc RNA或Inc RNA分子標(biāo)志物卻鮮見報(bào)道。因此對子宮內(nèi)膜癌中Inc RNA分子的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物分子及新的治療靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明解決的問題在于提供一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA及其siRNA和應(yīng)用，該基因與癌細(xì)胞的增殖能力相關(guān)，針對其設(shè)計(jì)siRNA可應(yīng)用于抗腫瘤的藥物的制備。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0009]—種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA,其cDNA序列如SEQ.1D.N0.3所不。
[0010]所述其截短的、能夠作為SiRNA作用靶點(diǎn)的cDNA序列如SEQ.1D.N0.4所示。
[0011]所述其合適的siRNA作用位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示。
[0012]一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的全長cDNA序列的獲取方法，包括以下操作:
[0013]I)通過對子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中長非編碼RNA分子表達(dá)水平差異進(jìn)行分析篩選，獲得了在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)的長非編碼RNA分子信息；
[0014]2)利用 Out Primerl 和 Inner Primerl 進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增，獲得 5’ RACE 的 cDNA序列；
[0015]所述白勺 Out Primerl:agcgcctgag tgggtttcgg ；
[0016]所述的 Inner Primerl:gggggtcata ctccccgaaa gg ；
[0017]3)利用 Out Primer2 和 Inner Primer2 進(jìn)行巢式 PCR 擴(kuò)增，獲得 3’ RACE 的 cDNA序列；
[0018]所述的 Out Primer2:ttaatagatt aggcacagga tgggt ；
[0019]的 Inner Primer2:caggatgggt gtttaattct cggcaa ；
[0020]4)通過5’RACE及3’RACE序列的重疊區(qū)域拼接后，得到該長非編碼RNA分子cDNA全長序列。
[0021]一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的siRNA，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.6所
/Jn ο
[0022]所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的siRNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0023]所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA作為作用靶點(diǎn)在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0025]本發(fā)明提供的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA，是通過長非編碼RNA芯片技術(shù)對3組子宮內(nèi)膜癌及其鄰近癌旁組織中差異表達(dá)的長非編碼RNA進(jìn)行了分析篩選，獲得了在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)長非編碼RNA分子。在獲取了其具體的序列之后，并設(shè)計(jì)siRNA序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染；采用該片段敲低HEC-1-B細(xì)胞中該長非編碼RAN分子的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性下降。因此該基因的功能可能與癌細(xì)胞的增殖能力相關(guān)。 [0026]本發(fā)明提供的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的siRNA,其設(shè)計(jì)起始位點(diǎn)為1535nt，對長非編碼RNA表達(dá)的干擾敲低效果達(dá)到了 50%以上，采用干擾片段siRNA1535敲低基因的表達(dá)水平后，腫瘤細(xì)胞的增殖活性明顯下降，可應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為5’ RACE瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；
[0028]圖2為3’ RACE瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；
[0029]圖3為全長截短片段瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；
[0030]圖4為ORF Finder序列分析比對結(jié)果；
[0031]圖5為siRNA敲低效率結(jié)果；
[0032]圖6為siRNA作用下子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞增殖活性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0034]本發(fā)明通過對子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中長非編碼RNA分子表達(dá)水平差異進(jìn)行分析篩選，獲得了在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)的長非編碼RNA分子信息。根據(jù)UCSC中公布的該分子的部分序列設(shè)計(jì)實(shí)施5’ RACE及3’ RACE的巢式PCR引物，獲得了長非編碼RNA分子5’及3’末端的序列信息。并通過5’ RACE及3’ RACE序列的重疊區(qū)域拼接后，得到該長非編碼RNA分子cDNA全長序列?；谌LcDNA序列設(shè)計(jì)引物，獲得了全長的截短序列。并根據(jù)全長的截短序列信息設(shè)計(jì)篩選出有效的siRNA片段。采用該片段敲低了長非編碼RNA分子在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1-B中的表達(dá)水平，使癌細(xì)胞的增殖活性降低。
[0035]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)施。
[0036]1、標(biāo)本采集
[0037]于術(shù)中采集子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織標(biāo)本，生理鹽水清洗后保存于液氮或-80°C超低溫冰箱中。
[0038]組織標(biāo) 本于2010年6月-2011年3月，在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院手術(shù)室，由翟文采集。
[0039]2、芯片分析
[0040]選取3對子宮內(nèi)膜癌與癌旁組織標(biāo)本Trizol冰浴勻漿，干冰運(yùn)輸。由上?？党缮锕咎崛NA并進(jìn)行芯片雜交檢測，數(shù)據(jù)分析并提供報(bào)告。
[0041]具體采用了 Arraystar公司的IncRNA芯片，該芯片覆蓋所有來自Refseq，UCSCKnown Gene, NRED,RNAdb,H-1nvDB,Fantom3等權(quán)威數(shù)據(jù)庫注釋為IncRNA的轉(zhuǎn)錄本,并在此基礎(chǔ)上收錄了相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的IncRNA，是目前覆蓋最為全面的IncRNA芯片。利用IncRNA芯片篩選標(biāo)本中存在差異表達(dá)的IncRNA。
[0042]根據(jù)芯片分析及標(biāo)本驗(yàn)證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一個在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)的長非編碼RNA分子(其對應(yīng)芯片當(dāng)中的位置信息為chr1: - 28777638~-28782082)，其分析結(jié)果腫瘤組 vs 對照組:fold change>3 ;p_value〈0.05,稱其為 EUlncRNAl。
[0043]3、引物設(shè)計(jì)
[0044]根據(jù)位置信息為chrl在UCSC(Mar.2006)中查找該長非編碼RNAEUlncRNAl的部分序列信息，并根據(jù)獲取的序列信息采用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)了 EUlncRNAl的5’RACE及3’ RACE巢式PCR引物。具體如表1所示。
[0045]表15 ’ RACE 及 3 ’ RACE 巢式 PCR 弓丨物
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA，其特征在于，其cDNA序列如SEQ.1D.N0.3所示。
2.如權(quán)利要求1所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA，其特征在于，其截短的、能夠作為siRNA作用靶點(diǎn)的cDNA序列如SEQ.1D.N0.4所示。
3.如權(quán)利要求1所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA，其特征在于，其合適的siRNA作用位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.5所示。
4.一種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的全長cDNA序列的獲取方法,其特征在于，包括以下操作: 1)通過對子宮內(nèi)膜癌及癌旁組織中長非編碼RNA分子表達(dá)水平差異進(jìn)行分析篩選，獲得了在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)的長非編碼RNA分子信息；2)利用OutPrimerl和Inner Primerl進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得5’ RACE的cDNA序列；
所述的 Out Primerl:agcgcctgag tgggtttcgg ；
所述的 Inner Primerl:gggggtcata ctccccgaaa gg ；3)利用OutPrime r2和Inner Primer2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，獲得3’ RACE的cDNA序列；
所述的 Out Primer2:ttaatagatt aggcacagga tgggt ；
所述的 Inner Primer2:caggatgggt gtttaattct cggcaa ； 4)通過5’RACE及3’ RACE序列的重疊區(qū)域拼接后，得到該長非編碼RNA分子cDNA全長序列。
5.—種與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的siRNA,其特征在于，其核苷酸序列如SEQ.1D.N0.6 所示。
6.權(quán)利要求5所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA的siRNA在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1或2所述的與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的長非編碼RNA作為作用靶點(diǎn)在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/10GK103937798SQ201410166296
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月23日
【發(fā)明者】陳葳, 李旭, 翟文, 薛梅, 吳文婧 申請人:西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院