構(gòu)建體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了構(gòu)建體及其應(yīng)用，其中該構(gòu)建體包含SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列。將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染動物細胞，能夠有效實現(xiàn)對動物細胞尤其是哺乳動物細胞線粒體基因的切割，使該細胞的線粒體喪失功能，獲得無線粒體功能的ρ0細胞株，且切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
【專利說明】構(gòu)建體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及構(gòu)建體、制備轉(zhuǎn)基因動物細胞的方法、轉(zhuǎn)基因動物細胞或其培養(yǎng)物以及使非人動物線粒體功能缺失的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]P O細胞是線粒體DNA完全缺失的細胞，真核細胞中，通過人工方法造成線粒體DNA完全缺失獲得的細胞系稱為P O細胞。PO細胞的建立有多種方法，經(jīng)典的方法是用低劑量EB (溴化乙錠)長期處理。這種化學試劑能嵌入到DNA雙鏈中通過干擾DNA聚合酶的作用影響線粒體DNA的復(fù)制造成了線粒體DNA的缺失。雖然EB更傾向于插入到線粒體雙鏈DNA中，但是不能排除它對核基因組產(chǎn)生的輕微影響，因此EB在誘導(dǎo)P O細胞過程中可能會造成核基因的誘變效應(yīng)。這種方法經(jīng)典但并不是萬能的，不是所有的細胞系都能EB處理獲得P O狀態(tài)。有些細胞系對EB有抗性，例如Hep3B細胞通過該方法就不能達到P O狀態(tài)。此外，EB是一種高致癌誘變劑，所以這種方法常被研究人員摒棄。除了 EB以外，其他的化學試劑如雙脫氧胞苷(Nelson, 1.，et al.，1997)、地特氯胺等也被用來嘗試通過干擾mtDNA的復(fù)制建立P O細胞系，但是所有的化學試劑都有他們的缺陷如造成基因突變及多種耐藥基因的表達。為此，研究人員不斷尋找更有效的方法誘導(dǎo)線粒體DNA缺失獲得P O細胞。
[0003]目前使用較多的是與酶相關(guān)的方法清除線粒體DNA，這種方法不僅縮短了誘導(dǎo)時間還提高了誘導(dǎo)效率，比藥物誘導(dǎo)更特異更安全。DNA聚合酶Y是線粒體DNA復(fù)制多種復(fù)合物之一。通過穩(wěn)定表達顯性負向線粒體特異的DNA聚合酶Y可以干擾線粒體DNA復(fù)制達到清除線粒體DNA的 目的。此外，人和鼠的mtDNA上都有多個ECORl酶切位點，人的線粒體DNA由于種族差異存在3-5個EcoRl酶切位點，小鼠有三個EcoRl酶切位點，大鼠有七個EcoRl酶切位點。Kukat等人根據(jù)這個特點找到一種溫和、可靠、省時的方法有效清除了線粒體DNA，即通過限制性內(nèi)切酶EcoRl與線粒體定位的序列結(jié)合連接到表達載體上，然后轉(zhuǎn)染細胞經(jīng)過篩選獲得了線粒體DNA缺失的細胞。但是目前用于切割線粒體DNA的方法效率較低。
[0004]因而，現(xiàn)階段，找到一種酶學上的能夠高效切割線粒體DNA，制備P O細胞的方法，
意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠高效剪切宿主細胞線粒體DNA、從而制備獲得P O細胞的構(gòu)建體。
[0006]需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列工作而完成的:
[0007]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)人類單純皰疹病毒UL12基因的有效變體UL12.5，能夠編碼核酸酶，精確特異地定位于線粒體造成線粒體DNA缺失，并且其對線粒體DNA的剪切效率非常高，能在短時間內(nèi)達到清除線粒體DNA的效果，而這種特異的核酸酶的方法也輕松解決了藥物誘導(dǎo)線粒體功能缺失所產(chǎn)生的負面效應(yīng)。
[0008]因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該構(gòu)建體包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染動物細胞，能夠有效實現(xiàn)對動物細胞尤其是哺乳動物細胞線粒體基因的切割，使該細胞的線粒體喪失功能，獲得無線粒體功能的P O細胞株，且切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種制備轉(zhuǎn)基因動物細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞；以及分離轉(zhuǎn)基因動物細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用該方法能夠有效地實現(xiàn)對動物細胞尤其是哺乳動物細胞的線粒體基因的剪切修飾，獲得無線粒體功能的P O細胞，并且，切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因動物細胞或其培養(yǎng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因動物細胞是通過前面所述制備轉(zhuǎn)基因動物細胞的方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物細胞為無線粒體功能的P O細胞，其因特異位點被剪切而發(fā)生突變，從而能夠有效作為線粒體疾病模型應(yīng)用于人類線粒體疾病發(fā)病機理以及預(yù)防和治療的研究。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種使非人動物線粒體功能缺失的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法為:使用前面所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述非人動物。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用該方法能夠有效地獲得線粒體功能缺失的轉(zhuǎn)基因動物，從而該轉(zhuǎn)基因動物能夠有效用作人類線粒體疾病發(fā)病機理以及預(yù)防和治療研究的動物模型。
[0012]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實 踐了解到。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0014]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pDsRed-Mito質(zhì)粒圖譜；
[0015]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pMXs-Flag質(zhì)粒圖譜；
[0016]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRLenti質(zhì)粒圖譜；
[0017]圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，UL12.5-DsRed清除線粒體DNA效果的檢測結(jié)果圖，其中，
[0018]圖4A顯示了 UL12.5基因與紅色熒光蛋白DsRed融合結(jié)果示意圖，
[0019]圖4B顯不了 UL12.5-DsRed與線粒體染料Mito-tracker green共定位檢測結(jié)果(Zesis LSM710，100X)，
[0020]圖4C顯示了 Q-PCR檢測MEF細胞中感染UL12.5基因不同天數(shù)后mtDNA的含量的
結(jié)果，
[0021]圖4D顯示了 Q-PCR檢測MEF細胞中UL12.5基因?qū)€粒體DNA轉(zhuǎn)錄水平的影響的實驗結(jié)果；
[0022]圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，轉(zhuǎn)基因細胞的線粒體功能缺失情況檢測結(jié)果，其中，[0023]圖5A顯示了用TMRM方法檢測正常MEF細胞中的線粒體功能的結(jié)果(ZesisLSM710,100X)，
[0024]圖5B顯示了 BQ-PCR檢測MEF細胞中感染UL12.5-GFP基因不同天數(shù)后mtRNA的含量的結(jié)果，
[0025]圖5C顯示了用TMRM方法檢測UL12.5感染MEF細胞6天后的線粒體功能的結(jié)果(Zesis LSM710,100X)； [0026]圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，慢病毒感染UL12.5陽性iPS克隆篩選結(jié)果圖，其中，
[0027]圖6A顯示了慢病毒感染iPS克隆得到的UL12.5-DsRed陽性克隆(Zesis LSM710，10X)，
[0028]圖6B顯示了 Q-PCR檢測挑取的3株高表達UL12.5-DsRed的iPS克隆mtDNA水平的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0029]下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0030]構(gòu)建體
[0031]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例,該構(gòu)建體包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染動物細胞，能夠有效實現(xiàn)對動物細胞尤其是哺乳動物細胞線粒體基因的切割，使該細胞的線粒體喪失功能，獲得無線粒體功能的P O細胞株，且切割效率高、安全高效、重復(fù)性好。
[0032]其中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體呈選自質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒以及病毒的至少一種的形式，優(yōu)選質(zhì)粒的形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其特征在于，進一步包括啟動子，所述啟動子與SEQID NO:1所示的核苷酸序列可操縱地連接， 優(yōu)選所述啟動子為CMV啟動子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其特征在于，進一步包括篩選標記， 任選地，所述篩選標記為熒光蛋白基因，優(yōu)選GFP，RFP, DsRed, YFP, CFP, BFP和Cherry基因的至少之一， 任選地，所述篩選標記為藥物抗性基因，優(yōu)選新霉素抗性基因和氨芐青霉素抗性基因的至少一種， 任選地，所述篩選標記為選自His和Flag標簽的至少一種。
5.一種制備轉(zhuǎn)基因動物細胞的方法，其特征在于，包括: 使用權(quán)利要求1-4任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞；以及 分離轉(zhuǎn)基因動物細胞， 任選地，所述轉(zhuǎn)基因動物細胞來源于哺乳動物，優(yōu)選小鼠。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，利用選自電轉(zhuǎn)、PEI轉(zhuǎn)、鈣轉(zhuǎn)、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒感染的至少一種方法進行所述轉(zhuǎn)化。
7.—種轉(zhuǎn)基因動物細胞或其培養(yǎng)物，其中所述轉(zhuǎn)基因動物細胞是通過權(quán)利要求5或6所述的方法獲得的。
8.一種使非人動物線粒體功能缺失的方法，其特征在于， 使用權(quán)利要求1-4任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述非人動物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 使用權(quán)利要求1-4任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化非人動物細胞； 分離轉(zhuǎn)基因動物細胞； 將所述轉(zhuǎn)基因動物細胞引入所述非人動物的懷孕個體的囊胚； 使所述懷孕個體生產(chǎn)，以便獲得嵌合體動物；以及 將所述嵌合體動物進行雜交繁育，以便獲得轉(zhuǎn)基因動物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 使用權(quán)利要求1-4任一項所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述非人動物細胞； 分離轉(zhuǎn)基因動物細胞； 提取所述轉(zhuǎn)基因動物細胞的細胞核； 將所述細胞核引入所述非人動物的無核卵母細胞中，以便獲得融合卵母細胞；以及 將所述融合卵母細胞在適宜的條件下進行培養(yǎng)，以便獲得非人轉(zhuǎn)基因動物， 任選地,所述非人動物為哺乳動物，優(yōu)選小鼠， 任選地，所述無核卵母細胞是通過手工克隆方法去除卵子中的遺傳物質(zhì)而獲得的。
【文檔編號】C12N5/10GK103966246SQ201410166516
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】劉興國, 楊亮, 龍琪, 胡忠國 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院