采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，調(diào)節(jié)噴霧干燥機進料溫度和風速等運行參數(shù)，利用高溫使乳酸菌細胞漲破釋放胞內(nèi)乳糖酶，同時添加保護劑保護乳糖酶活性，制備乳糖酶粉劑。所述保護劑為糊精、脫脂奶粉與糊精的混合物，酶活回收率可達到80％以上。本發(fā)明利用高溫破壞細胞壁，避免了氯仿等化學試劑的使用，極大地降低了生產(chǎn)過程對環(huán)境的污染壓力，同時也避免了乳糖酶產(chǎn)品中污染有機試劑的可能性。實現(xiàn)了乳糖酶的綠色生產(chǎn)。本發(fā)明將制備粗酶液和制備酶固體粉劑兩個過程合并，極大地簡化了生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明可以適用于任何細胞胞內(nèi)酶的制備，包括細菌、真菌、動物細胞核植物細胞等。
【專利說明】采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶制劑制備【技術(shù)領域】，涉及一種采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]乳糖酶，即β -半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)，能水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。乳糖是乳和乳制品中最主要的碳水化合物，但是許多人由于缺乏乳糖酶而無法消化乳糖，同時引起胃腸道不適，如腹瀉、腸絞痛等，即表現(xiàn)為乳糖不耐癥。亞洲人口中約有70%的人患有不同程度的乳糖不耐癥?；加腥樘遣荒桶Y的兒童易表現(xiàn)為鈣吸收不良，患有軟骨病，體重低下，生長發(fā)育遲緩；老年人尤其是老年婦女易表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥狀。
[0003]利用乳糖酶水解乳糖的能力，可以有效消除人體對乳糖的不耐受癥狀，即向乳制品中添加外源乳糖酶，制成低乳糖或無乳糖乳制品。中國食品添加劑委員會已于1998年將乳糖酶列為食品添加劑新品種。目前，市售乳糖酶制劑主要是通過酵母菌和霉菌發(fā)酵獲得的，主要有口服片劑、固體粉劑和固定化酶三種類型，多為進口酶制劑，價格昂貴。利用酵母菌和霉菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶發(fā)酵周期長，酵母菌產(chǎn)生的乳糖酶為胞內(nèi)酶，最適PH值中性，適于水解牛乳中的乳糖，但對熱不穩(wěn)定，易失去活性；霉菌產(chǎn)生的乳糖酶為胞外酶，便于提取，穩(wěn)定性好，但最適pH值一般為2.5~5.4,多用于水解酸性乳清。許多細菌也能產(chǎn)生乳糖酶，來自細菌的乳糖酶為胞內(nèi)酶，最適pH中性，酶活力高，但只有少數(shù)細菌可作為乳糖酶的安全來源。乳酸菌是應用最早、最廣泛的一類細菌，并具有一定的益生功能，但關(guān)于乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的報道很少，產(chǎn)量處于較低水平，未實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]目前，工業(yè)上生產(chǎn)乳糖酶制劑的方法主要有三種，酶的固定化、透性化細胞乳糖酶以及多步分離純化制得乳糖酶制劑。這些方法操作復雜，成本高，酶活力損失嚴重。本發(fā)明的目的是提供一種制備乳酸桿菌乳糖酶的噴霧干燥方法，為工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖乳制品提供一種高活力、廉價、安全的乳糖酶制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明涉及一株產(chǎn)乳糖酶乳酸菌的分離鑒定與一種利用噴霧干燥技術(shù)制備乳糖酶的方法。本發(fā)明利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，發(fā)酵結(jié)束后向發(fā)酵液中添加一定量保護劑進行噴霧干燥，即制得乳糖酶固體酶制劑。利用本發(fā)明制備乳糖酶制劑干燥過程迅速、干燥效率高、成本低、操作簡單，目前國內(nèi)尚未見到利用噴霧干燥法制備乳糖酶制劑的報道。
[0006]技術(shù)方案如下
[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種采用噴霧干燥法制備乳糖酶的方法，本發(fā)明利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，發(fā)酵結(jié)束后向發(fā)酵液中添加一定量保護劑進行噴霧干燥，即制得乳糖酶固體酶制劑，利用本發(fā)明制備乳糖酶制劑干燥過程迅速、干燥效率高、成本低、操作簡單，目前國內(nèi)尚未見到利用噴霧干燥法制備乳糖酶制劑的報道。
[0008]本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0009]一種采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，在產(chǎn)乳糖酶的乳酸菌發(fā)酵液中直接添加保護劑，加料至噴霧干燥機，通過調(diào)節(jié)噴霧干燥機運行參數(shù)，破碎乳酸菌細胞，釋放胞內(nèi)乳糖酶，噴霧得到乳糖酶固體粉劑，所述保護劑為糊精、脫脂奶粉與糊精的混合物，所述糊精加入量為:10^-20%, g/100mL，所述脫脂奶粉與糊精的混合物的加入量為15%~20%，g/100mL。
[0010]而且，所述脫脂奶粉與糊精添加比例為脫脂奶粉:糊精=3~7:1。
[0011]而且，所述噴霧干燥機運行參數(shù)為進風溫度和物料流速。
[0012]而且，所述干燥后乳糖酶固體粉劑的乳糖酶酶活回收率超過80%。
[0013]而且，所述噴霧干燥機進風溫度為125°C~135°C。
[0014]而且，所述噴霧干燥機內(nèi)物料流速為400-800mL/h。
[0015]本發(fā)明取得的優(yōu)點和有益效果是:
[0016]1、本發(fā)明采用噴霧干燥技術(shù)直接干燥乳酸桿菌乳糖酶發(fā)酵液，干燥過程迅速，干燥效率高，生產(chǎn)成本低，操作簡單，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0017]2、本發(fā)明采用脫脂奶粉和糊精共同作為干燥保護劑，干燥出來的酶制劑干燥狀況良好、粉末均勻，減少了乳糖酶因高溫而失去的酶活力，同時避免了酶制劑在旋風分離器中的黏壁現(xiàn)象，酶活回收率可達到80%以上，而且干燥的酶制劑具有較好的溶解性，更易于實際應用。
[0018]3、本發(fā)明避免了使用化學試劑，極大地降低了對環(huán)境的污染壓力，同時也避免了乳糖酶制劑中污染有機試劑的可能性，實現(xiàn)了乳糖酶的綠色生產(chǎn)。
[0019]4、本發(fā)明利用高溫破壞細胞壁，避免了氯仿等化學試劑的使用，極大地降低了生產(chǎn)過程對環(huán)境的污染壓力，同時也避免了乳糖酶產(chǎn)品中污染有機試劑的可能性。實現(xiàn)了乳糖酶的綠色生產(chǎn)。本發(fā)明將制備粗酶液和制備酶固體粉劑兩個過程合并，極大地簡化了生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率。本發(fā)明可以適用于任何細胞胞內(nèi)酶的制備，包括細菌、真菌、動物細胞核植物細胞等。

【具體實施方式】
[0020]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0021]本發(fā)明使用的菌種購買自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種具體信息如下:株乳酸桿菌名稱為羅伊氏乳桿菌MF2-2,分類名稱為Lactobacillus reuteri,保藏編號為:CICC10855，保藏日期:2014年3月21日，北京市朝陽區(qū)酒仙橋中路24號院6號樓，保藏單位:中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心
[0022]上述微生物是本發(fā)明在實施過程中的一個具體事例，本發(fā)明還可以采用其他產(chǎn)乳糖酶的微生物實現(xiàn)，本申請不做特殊限制。
[0023]所用試劑:
[0024]Z-buffer 緩沖液(IL) =NaH2PO4.H205.64g、Na2HPO4.7Η2016.68g、KC10.745g、MgSO40.246g、β -巰基乙醇 2.7mL (使用前加入)，ρΗ7.0 ；
[0025] 4mg/mLONPG (鄰硝基苯-β -D-批喃半乳糖苷)；
[0026]lmol/LNa2C03。
[0027]所使用的儀器主要包括:恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，SP-1500實驗型噴霧干燥機(上海順儀科技有限公司)；
[0028]所用培養(yǎng)基:
[0029]種子培養(yǎng)基:蛋白胨10g/L、牛肉膏8g/L、酵母浸粉4g/L、乳糖20g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸三銨 2g/L、MgSO40.2g/L、磷酸二氫鉀 2g/L、MnSO40.05g/L, Tween-80 ImL, ρΗ6.4，lX105Pa、115°C，滅菌 25min ；
[0030]發(fā)酵培養(yǎng)基:乳清粉12.5g/L、酵母浸粉4.5g/L、(NH4) H2P042.5g/L、乙酸鈉5g/L、MgSO40.2g/L、MnSO40.05g/L、吐溫-80 ImL, ρΗ6.4，I X 15PaU 15°C，滅菌 25min。
[0031]實驗方法:
[0032]1、羅伊氏乳桿菌MF2-2活化后，以I %的接種量接種至種子培養(yǎng)基中，35°C靜置培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)12h，二級種子培養(yǎng)10h，然后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0033]2、乳糖酶活力的測定:取ImL發(fā)酵液至試管中，加入3mL Z-buffer緩沖液，混勻后加入80 μ L氯仿、80 μ L甲苯或氯仿和10% SDS各80 μ L，充分振蕩，加入800 μ L濃度為4mg/mL的ONPG (鄰硝基苯β -D-吡喃半乳糖苷)，放入37°C水浴鍋中開始計時，溶液變成黃色時，加入ImLlmoVLNa2CO3終止反應，12000r/min離心3min,取上清液測定0D42。。
[0034]3、中性乳糖酶活力單位(Neutral Lactase Activity Unit, NLU),其定義為:以I μ mol/min 的速率釋放 ONP 的酶量。計算公式:NLU/g = (OD420 X f XV) / (4.5254Xt Xm)。其中:f:測定OD42tl時的稀釋倍數(shù)；V:反應體積mL ；4.5254:在420nm處I μ mol/mL的ONP的吸光度，即ONP標準曲線的斜率；t:反應時間min ；m =ImL培養(yǎng)液中菌體干重:0.002g。
[0035]4、噴霧干燥技術(shù)制備乳糖酶粉劑:向發(fā)酵液中加入10%~20% (g/100mL)糊精，或同時加入脫脂奶粉和糊精，添加比例為3:1~7:1，共添加15%~20% (g/1OOmL)。調(diào)整噴霧干燥機的運行參數(shù)，如設置進風溫度為125°C~135°C，物料流速為400mL/h，在此條件下進行噴霧干燥。
[0036]實施例1
[0037]采用化學法破壁處理發(fā)酵液，步驟和說明如下:
[0038]采用不同的細胞破碎方式處理羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液，測定其乳糖酶活力，結(jié)果見表1?；瘜W方法破碎細胞的效率明顯高于物理方法，其中只加入氯仿細胞破碎效果最好，酶活力最高，可達到768.7NLU/g。物理方法破碎細胞后測得的酶活力較低，說明細胞破碎不充分，乳糖酶不能全部釋放。以氯仿破壁后粗酶活力為100%，計算其它方法的破壁效率，結(jié)果如表1。高壓細胞破碎方法效率最差，只有4.2 %。結(jié)果顯示，現(xiàn)有方法無法用于乳糖酶的制備。
[0039]表1細胞破碎方式對乳糖酶活力的影響
[0040]

【權(quán)利要求】
1.一種采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:在產(chǎn)乳糖酶的乳酸菌發(fā)酵液中直接添加保護劑，加料至噴霧干燥機，通過調(diào)節(jié)噴霧干燥機運行參數(shù)，破碎乳酸菌細胞，釋放胞內(nèi)乳糖酶，噴霧得到乳糖酶固體粉劑，所述保護劑為糊精、脫脂奶粉與糊精的混合物，所述糊精加入量為:10%~20%, g/100mL,所述脫脂奶粉與糊精的混合物的加入量為15%~20%，g/100mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:所述脫脂奶粉與糊精添加比例為脫脂奶粉:糊精=3~7:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:所述噴霧干燥機運行參數(shù)為進風溫度和物料流速。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:所述干燥后乳糖酶固體粉劑的乳糖酶酶活回收率超過80%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:所述噴霧干燥機進風溫度為125°C~135°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用噴霧干燥法破碎乳酸菌細胞壁制備胞內(nèi)乳糖酶粉劑的方法，其特征在于:所 述噴霧干燥機內(nèi)物料流速為400-800mL/h。
【文檔編號】C12R1/225GK104046604SQ201410168170
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】楊洪江, 李夢菲, 朱慧明 申請人:天津科技大學