含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒顆粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法，該假病毒顆粒是由MS2噬菌體外殼蛋白包裹戊型肝炎病毒RNA的一種RNA-蛋白復(fù)合體，RNA-蛋白復(fù)合體的形狀為球狀；設(shè)計(jì)并人工合成引物通過PCR的方法得到目的基因MS2，將其連接到質(zhì)粒pET-28b(+)上得到重組質(zhì)粒pET-28b/MS2/HEV重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，采用聚乙二醇法沉淀病毒樣顆粒，所得病毒樣顆粒即為含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒。本發(fā)明的假病毒顆粒可作為通用HEV基因I-IV型RT-PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，無傳染性，安全可靠、穩(wěn)定性高，具有耐核糖核酸酶的特點(diǎn)。
【專利說明】含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及戊型肝炎病毒，具體說是一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]戊型肝炎病毒Ofepatitis E virus，HEV)是經(jīng)消化道、血液傳播的一種肝炎病毒。該病毒感染譜十分廣泛，目前已證實(shí)的感染宿主除人之外，還有其它多種動物，如豬、猴、雞等。HEV有四個(gè)基因型，I型和IV型僅限于人際間傳播，III型和IV型為人畜間交叉?zhèn)鞑ィ蝗烁腥九R床患者多為輕中型肝炎，常為自限性，但孕婦患戊型肝炎病情嚴(yán)重病死率可達(dá)20%，因此，世界衛(wèi)生組織(WHO)將HEV確定為本世紀(jì)新發(fā)現(xiàn)的一種人畜共患病病原，其導(dǎo)致的全球公共衛(wèi)生安全問題日益受到各國的關(guān)注。相應(yīng)的開發(fā)各種HEV檢測技術(shù)和方法也變得十分必要和緊迫。[0003]HEV是一種直徑約為27nm的無包膜單股正鏈RNA病毒。HEV基因組全長約7.5kb，在5’和3’非編碼區(qū)之間含有三個(gè)開放閱讀框(ORF)，依次為0RF1、0RF2和0RF3。由于病毒核酸及其編碼的氨基酸在具有高度同源性的基礎(chǔ)之上有著廣泛的地理分布和一定的遺傳異質(zhì)性等特點(diǎn)，一因此，在臨床上的分子生物學(xué)檢測中常常以O(shè)RFl、0RF2和0RF3為檢測目標(biāo)基因。
[0004]以HEV核酸檢測為例，一般有以下三個(gè)主要步驟需要陽性參照:
[0005]1、從標(biāo)本中提取HEV RNA，包括:病毒外膜、核衣殼打開或破碎，核酸釋放。
[0006]2、HEV RNA 被逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。
[0007]3、cDNA與PCR反應(yīng)液和DNA多聚酶混合，在PCR儀中擴(kuò)增并得到信號。
[0008]現(xiàn)有的陽性參照，主要有下述幾種來源:患者或被感染動物陽性血清；體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)錄RNA ;質(zhì)粒或化學(xué)合成。
[0009]所有陽性參照中，最準(zhǔn)確可靠的應(yīng)該是含該HEV病毒的天然樣本(如患者或被感染動物的血液、糞便處理液、細(xì)胞培養(yǎng)液)，同質(zhì)性可充分保證其作為前述三個(gè)步驟的陽性參照，但其缺陷在于天然樣本來源有限，且存在天然病毒散播的潛在危害性。
[0010]克服天然病毒來源少且具有傳染性的缺點(diǎn)，一般可通過離體培養(yǎng)來解決，即將HEV導(dǎo)入合適的人工培養(yǎng)宿主細(xì)胞系，重組HEV顆粒即可從細(xì)胞中產(chǎn)生并分泌至培養(yǎng)上清。然而，該病毒感染譜窄感染滴度低且關(guān)鍵培養(yǎng)步驟只為少數(shù)實(shí)驗(yàn)室所擁有；另一方面，這種HEV生產(chǎn)方式可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒數(shù)量仍然較低、結(jié)構(gòu)不天然、重復(fù)性差
坐寸ο
[0011]體外轉(zhuǎn)錄的HEV RNA，因?yàn)樗c標(biāo)本中待測指標(biāo)一樣，都是RNA，因此可以作為逆轉(zhuǎn)錄的陽性參照；但是，由于其不具備病毒外殼，因此不適合作為從標(biāo)本中提取病毒RNA操作的陽性參照。
[0012]用質(zhì)粒作為陽性參照，其優(yōu)點(diǎn)是制備純化容易，但由于質(zhì)粒是閉合環(huán)狀超螺旋雙鏈形式，非單線性，不是RNA，因此它只能作為PCR參照，而無法作為RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄的參照。
[0013]至于化學(xué)合成法制備RNA陽性參照，以目前技術(shù)成本非常高，還會因?yàn)闆]有核衣殼、膜的保護(hù)而容易降解，因此到目前為止尚無實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道。
[0014]人工假病毒是將目的RNA病毒基因的特定片斷克隆至含有噬菌體基因的表達(dá)載體上，通過誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生被噬菌體衣殼蛋白包被的RNA片斷，這種新的RNA質(zhì)控制備技術(shù)又稱裝甲 RNA (Armored RNA)技術(shù)(Pasloske B Lj et al.Armored RNA technology forproduction of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards[J].J ClinMicrobiol, 1998, 36(12):3590-3594)。該技術(shù)解決了傳統(tǒng)RNA質(zhì)控品存在的諸多弊端問題(要么穩(wěn)定性差、要么存在生物安全隱患、要么達(dá)不到監(jiān)測核酸提取及反轉(zhuǎn)錄全過程的目的等。
[0015]目前構(gòu)建假病毒顆粒的常用假病毒載體主要由可以編碼MS2噬菌體外殼蛋白的基因序列和具有高效表達(dá)的表達(dá)載體組成。MS2噬菌體是單鏈正性RNA病毒，基因組全長3569堿基對，編碼成熟酶蛋白、包膜蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等四種蛋白質(zhì)分子。一個(gè)噬菌體病毒顆粒是由180包膜蛋白單體、一分子成熟酶蛋白，包裹一分子基因組RNA組成的正二十面體(賈盤興.噬菌體分子生物學(xué)-基本知識和技能[M].北京:科學(xué)出版社，2001,2-5) 0在MS2噬菌體外殼蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)外殼蛋白與噬菌體復(fù)制酶5’端19堿基莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發(fā)噬菌體外殼的組裝，同時(shí)又將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內(nèi)。研究人員發(fā)現(xiàn)在包裝位點(diǎn)后引入非噬菌體基因序列也可以引發(fā)包裝。因此，如果將外源基因克隆于MS2噬菌體外殼蛋白基因編碼序列下游，并在其下游插入終止子，轉(zhuǎn)錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的外源基因RNA轉(zhuǎn)錄本，誘導(dǎo)表達(dá)過程中噬菌體外殼蛋白得以表達(dá)并組裝成蛋白外殼，并將攜帶有外源基因的噬菌體基因組包裹到包膜內(nèi)，構(gòu)成噬菌體病毒樣顆粒。由于單獨(dú)表達(dá)的外殼蛋白組裝過程不成熟，不能得到耐RNase的病毒包膜，研究者將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因編碼序列以及其基因組部分包含基因調(diào)節(jié)元件序列的5’非編碼序列相應(yīng)的cDNA序列都連接到表達(dá)載體啟動子下游，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)得到成熟酶蛋白和外殼蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA的協(xié)同作用下，外殼蛋白可組裝為成熟的假病毒顆粒外殼，并具有耐RNase作用的特性(Walker Peach C R, et al.Ribonuclease resistant RNA controls(Armored RNA)forreverse transcription—PCR, branched DNA, and genotyping assays for hepatitis Cvirus [J], Clin Chem, 1999，45(12):2079-2085)。所以利用裝甲 RNA (Armored RNA)技術(shù)所制備的人工假病毒在應(yīng)用于核酸檢測試劑陽性對照或核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]基于上述不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒及其制備方法。
[0017]本發(fā)明的目的是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的:
[0018]1、一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒，如序列表SEQ ID N0.1所示；
[0019]2、一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，具體制備步驟如下:
[0020](l)pET_28b/MS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建[0021](l)pET_28b/MS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0022](1.1)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增MS2噬菌體的MS2基因的引物對，
[0023]上引物Pri_MS2F:如序列表Seq ID N0.2所示，
[0024]下引物Pr1-MS2R:如序列表Seq ID N0.3所示；
[0025]然后通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出MS2基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.4所示；
[0026](1.2)采用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別雙酶切MS2基因和質(zhì)粒pET-28b (+)，純化后進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；
[0027](1.3)將步驟(1.2)所 得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒于_20°C保存；
[0028](2) pET-28b/MS2/NV 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0029](2.1)人工合成戊型肝炎病毒HEV 0RF2/3基因片段的PCR擴(kuò)增引物對，
[0030]上引物Pr1-0RF2/3F:如序列表 SEQ ID N0.5 所示，
[0031]下引物Pr1-0RF2/3R:如序列表 SEQ ID N0.6 所示，
[0032]然后通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出部分0RF2/3基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.7所示；
[0033](2.2)采用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII分別雙酶切0RF2/3基因克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-28b/MS2，純化后進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；
[0034](2.3)將步驟(2.2)所制備的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)DH5 α，提取質(zhì)粒并進(jìn)行單雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28b/MS2/HEV ；
[0035](3)誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0036]將步驟⑵中鑒定正確的重組質(zhì)粒pET_28b/MS2/HEV的陽性菌落，接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600值為0.5-1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5h，離心收集菌體；重懸于適量TE溶液中，加入溶菌酶至終濃度為10mg/L，混勻后37°C水浴作用30min，離心去除沉淀，向上清液中加入核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶I至終濃度均為lmg/L，37°C水浴作用lh。然后采用聚乙二醇沉淀法濃縮病毒樣顆粒物，即為本發(fā)明含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒，將其溶解于TE緩沖液中，4°C保存；
[0037]3、如上所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，所述的MS2基因?yàn)榭杀磉_(dá)的MS2噬菌體成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因及部分裂解蛋白和復(fù)制酶的基因編碼序列。
[0038]4、如上所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，所述的HEV基因片段的序列為HEV G1-4型最保守的0RF2區(qū)與0RF3區(qū)交疊的5225-5510堿基處，如序列表SEQ ID N0.6所示。
[0039]5、如上所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，所述的HEV基因片段的序列為HEV G1-4型最保守的0RF2區(qū)與0RF3交疊的5225-5510堿基，并于其尾部人工設(shè)計(jì)引入了 24個(gè)T堿基，轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生的PolyA可作為通用引物Oligo (dT)的特異互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
[0040]6、如上所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒是由MS2噬菌體個(gè)殼蛋白包裹肝炎病毒RNA的一種RNA-蛋白復(fù)合體；其內(nèi)含有HEV基因G1-4型0RF2保守序列區(qū)RNA序列，該RNA-蛋白復(fù)合體具有耐核糖核酸酶的特性。
[0041]本發(fā)明提供的假病毒載體pET_28b/MS2/HEV在用于制備HEV假病毒顆粒具有如下特點(diǎn):
[0042]1、通用性好，為HEV基因型1-1V的核酸共同保守區(qū)、即0RF2與0RF3的交疊部分，因此，該HEV假病毒顆?？稍跈z測基因型1-1V的HEV時(shí)作為通用的陽性質(zhì)控參照；另外，HEV假病毒顆粒包裹的HEV基因序列尾部人工引入的24個(gè)Poly-A多聚腺苷酸尾，可以模擬RNA病毒cDNA合成時(shí)Oligo(dT)引物的特異互補(bǔ)結(jié)合區(qū)，因此，當(dāng)以O(shè)ligo (dT)引物進(jìn)行RNA病毒反轉(zhuǎn)錄時(shí)具有很好的通用性。
[0043]2、穩(wěn)定性好，耐核酸酶、易保存。由于HEV 0RF2基因組RNA包裹在假病毒的外殼蛋白之內(nèi)，所以可以抵抗外界核酸酶的作用，不易被降解。在室溫條件下可以保存一個(gè)月，低溫條件下保存時(shí)間更長，解決了 RNA質(zhì)控品在使用過程中的穩(wěn)定性問題。
[0044]3、極大的仿真性，在核酸制備及鑒定的全程監(jiān)控過程中，HEV假病毒顆粒的RNA-蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)與天然病毒相似，因此可以把病毒顆粒等同為病毒材料，一同經(jīng)過RNA提取、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，很好地對靶RNA病毒的檢測過程進(jìn)行了全程的質(zhì)量監(jiān)控，保證了試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。
[0045]4、安全性高，HEV假病毒顆粒子僅具有類似病毒核衣殼，包裹核酸RNA不具有傳染性，喪失了病毒的自我復(fù)制能力，所以HEV假病毒顆粒子無傳染性，不會對實(shí)驗(yàn)人員構(gòu)成傷害，也不會圣環(huán)境產(chǎn)生污染影響。
[0046]5、易于純化，由于假病毒顆粒是在原核大腸桿菌中表達(dá)其產(chǎn)物為HEV RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，在細(xì)菌體裂解時(shí)可迅速釋放到上清液中，簡單離心之后即可將菌體碎片除去，提高了假病毒顆粒的純化效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1是HEV假病毒載體pET_28b/MS2/HEV的酶切鑒定結(jié)果，
[0048]其中:1為 DNA Markerlkbp Ladder ；2 為 pET_28b/MS2/HEV 重組質(zhì)粒的單酶切結(jié)果；3 為 pET-28b/MS2/HEV 重組質(zhì)粒 Nco 1、HindIII 的雙酶切結(jié)果；4 為 pET_28b/MS2/HEV重組質(zhì)粒BamH 1、HindIII雙酶切結(jié)果；5為pET_28b/MS2/HEV重組質(zhì)粒Nco 1、BamH I雙酶切結(jié)果；6為pET-28b(+)質(zhì)粒單酶切結(jié)果。
[0049]圖2是HEV假病毒載體pET_28b/MS2/HEV結(jié)構(gòu)模式圖，從左至右的矩形框內(nèi)分別代表以Nco I/BamH I雙酶切插入到pET_28b載體中的MS2基因序列和以BamH I/HindIII雙酶切的HEV 0RF2/3保守序列加24個(gè)Poly-A尾巴。
[0050]圖3是HEV假病毒顆粒的RT-PCR鑒定結(jié)果，
[0051]其中:M為DNA MarkerlOObp Ladder ;1_7分別為IO4至101°倍稀釋的純化后HEV假病毒顆粒樣本RT-PCR檢測結(jié)果；8-9分別為ddH20為模板的RT-PCR和PCR對照檢測結(jié)果；10-16分別為IO4至101°倍稀釋的純化后HEV假病毒顆粒樣本的未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄直接PCR檢測結(jié)果。
[0052]圖4是HEV假病毒顆粒的核糖核酸酶(RNase A)抗性檢測結(jié)果，
[0053]其中:M為 DNA MarkerlOObp Ladder ； 1-4 分別為經(jīng)過 RNaseAI μ L/5 μ L/10 μ L/15 μ L處理過的HEV假病毒顆粒樣本的RT-PCR檢測結(jié)果；5為不加RNase A處理的HEV假病毒顆粒樣本RT-PCR檢測對照。
[0054]圖5是HEV假病毒顆粒對溫度的敏感性鑒定結(jié)果，
[0055]其中，M為 DNA MarkerlOObp Ladder ;1_6 道分別為每份 250 μ L 的 IO4 稀釋純化后的HEV假病毒顆粒樣本置于下如下條件:60°C /lh、37°C /10h、25°C /10d、4°C /30d、-20°C /90d 和-80°C /180d 之后進(jìn)行 RT-PCR 檢測的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0056]以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范
圍。
[0057]若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，實(shí)施例中所用的生化試劑均為市售購買得到。
[0058]實(shí)施例1HEV前假病毒載體pET_28b/MS2的構(gòu)建
[0059]1、人工合成GenBank數(shù)據(jù)庫中的MS2噬菌體基因序列(NC_001417)并通過合成的序列設(shè)計(jì)裝配蛋白和包膜蛋白基因的引物對Pr1-MS2F、Pr1-MS2R，并對其進(jìn)行人工合成。
[0060]Pr1-MS2F:5’ -GGTCCATGGCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTT-3> (下劃線表示引入的酶切位點(diǎn)為Nco I)
[0061]Pr1-MS2R:5’ -GGTGGATCCGCTGAGGGAATCGGGTTTCCATCTT-3> (下劃線表示引入的酶切位點(diǎn)為BamH I)
[0062]2、PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物連接至克隆T載體pMD18_T，構(gòu)建pMD18_T/MS2質(zhì)粒。
[0063]3、用快酶Nco I和BamH I分別雙酶切重組質(zhì)粒pMD18_T/MS2和pET28b (+)表達(dá)
載體(均為本實(shí)驗(yàn)室保存)。酶切體系如下:
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒，其特征在于，如序列表SEQ ID N0.1所示；
2.一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，具體制備步驟如下: (1)pET-28b/MS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 (1.1)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增MS2噬菌體的MS2基因的引物對， 上引物Pr1-MS2F:如序列表Seq ID N0.2所示， 下引物Pr1-MS2R:如序列表Seq ID N0.3所示； 然后通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出MS2基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.4所示； (1.2)采用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I分別雙酶切MS2基因和質(zhì)粒pET_28b (+)，純化后進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物； (1.3)將步驟(1.2)所得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒于_20°C保存； (2)pET-28b/MS2/NV重組質(zhì)粒的構(gòu)建 (2.1)人工合成戊型肝炎病毒HEV 0RF2/3基因片段的PCR擴(kuò)增引物對， 上引物Pr1-0RF2/3F:如序列表SEQ ID N0.5所示， 下引物Pr1-0RF2/3R:如序列表SEQ ID N0.6所示， 然后通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出部分0RF2/3基因并克隆，如序列表SEQ ID N0.7所示；(2.2)采用限制性內(nèi)切酶BamH I和HindIII分別雙酶切0RF2/3基因克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pET-28b/MS2，純化后進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物； (2.3)將步驟(2.2)所制備的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)DH5ci，提取質(zhì)粒并進(jìn)行單雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-28b/MS2/HEV ； (3)誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將步驟⑵中鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-28b/MS2/HEV的陽性菌落，接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600值為0.5-1.0時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5h，離心收集菌體；重懸于適量TE溶液中，加入溶菌酶至終濃度為10mg/L，混勻后37°C水浴作用30min，離心去除沉淀，向上清液中加入核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶I至終濃度均為lmg/L，37°C水浴作用lh。然后采用聚乙二醇沉淀法濃縮病毒樣顆粒物，即為本發(fā)明含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒，將其溶解于TE緩沖液中，4°C保存。
3.如權(quán)利要求2所述的一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于:所述的MS2基因?yàn)榭杀磉_(dá)的MS2噬菌體成熟酶蛋白和包膜蛋白的基因及部分裂解蛋白和復(fù)制酶的基因編碼序列。
4.如權(quán)利要求2所述的一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于:所述的HEV基因片段的序列為HEV G1-4型最保守的0RF2區(qū)與0RF3區(qū)交疊的5225-5510堿基處，如序列表SEQ ID N0.6所示。
5.如權(quán)利要求2所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，所述的HEV基因片段的序列為HEV G1-4型最保守的0RF2區(qū)與0RF3交疊的5225-5510堿基，并于其尾部人工設(shè)計(jì)引入了 24個(gè)T堿基，轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生的Poly A作為通用引物Oligo(dT)的特異互補(bǔ)結(jié)合區(qū)。
6.如權(quán)利要求2所述一種含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒的制備方法，其特征在于，含戊型肝炎病毒RNA片段的假病毒顆粒是由MS2噬菌體個(gè)殼蛋白包裹肝炎病毒RNA的一種RNA-蛋白復(fù)合體；其內(nèi)含有HEV基因G1-4型0RF2保守序列區(qū)RNA序列，該RNA-蛋白復(fù)合體具有 耐核糖核酸酶的特性。
【文檔編號】C12N7/04GK103923887SQ201410168941
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月16日
【發(fā)明者】高慎陽, 查恩輝, 周鐵忠, 李丹丹, 董筱萍 申請人:遼寧醫(yī)學(xué)院