一種對黃酮類化合物耐受性提高的大腸桿菌工程菌及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對黃酮類化合物耐受性提高的大腸桿菌工程菌及其構建方法，屬于遺傳工程領域。本發(fā)明對可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株進行改造，沉默其lamB基因獲得，提高了E.coli對黃酮類化合物的耐受性，外源添加黃酮類化合物刺激E.coli生長，相較于原始菌，工程菌的最大比生長速率相較于原始菌提高了2.14倍。
【專利說明】一種對黃酮類化合物耐受性提高的大腸桿菌工程菌及其構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對黃酮類化合物耐受性提高的大腸桿菌工程菌及其構建方法，特別是一種并通過分子手段沉默了 malK基因，從而提高了 E.coli對黃酮類化合物的耐受能力。
【背景技術】
[0002]黃酮類化合物(Flavonoids)是自然界種類最多的多酚類植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物界中，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的種類已超過8000多種。黃酮類化合物具有廣泛的藥學價值，具有較強的抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、清除自由基、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗病毒、降血糖、抗輻射和降血脂等多種生物學作用。隨著對黃酮類化合物生物活性研究的逐步深入，對其的開發(fā)利用也越來越多，對其的需求量也越來越大，近年來，黃酮類化合物的市場每年增長30%以上，在藥品和營養(yǎng)化學品領域上具有廣闊的應用前景。但天然黃酮類物質(zhì)的獲得受到時間和區(qū)域的限制，而且在植物中含量低，不利于迅速研究和臨床檢驗，并且化學結(jié)構很復雜，用化學合成法很復雜，不利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此用微生物生產(chǎn)黃酮類化合物越來越受到人們的重視。
[0003]隨著黃酮類化合物的應用范圍越來越廣，其需求量也在不斷的增大，從植物中提取有各種各樣的問題，因此，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)黃酮類化合物具有很大的應用前景。目前，黃酮類化合物生物合成的代謝途徑已經(jīng)非常清楚，黃酮類化合物的基本骨架是由3個丙二酰輔酶A(malonylCoA)和I個香豆酰輔酶A (coumaroylCoA)在查爾酮合成酶(CHS)的催化下合成的，然后其他種類的黃酮是在母核的基礎上通過羥基、甲氧基取代或烷基化等化學反應生成的。大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術完善，是生物技術生產(chǎn)平臺的首選，因此很早就有人通過改造E.coli相關代謝途徑生產(chǎn)黃酮類化合物。目前很多研究成功通過基因工程等技術手段實現(xiàn)了多種黃酮類化合物在E.coli中的合成，如柚皮素、槲皮素、白藜蘆醇等。但是黃酮類化合物本身對E.coli生長具有一定的抑制作用，主要是通過以下幾種機制:①破壞細胞壁及細胞膜的完整性，改變細胞膜滲透性，進而破壞細胞膜的功能，影響細菌的生長；②抑制核酸的合成，槲皮素，芳:黃素，五羥基黃酮等能夠抑制E.coli的DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性進而抑制DNA的合成。蘆丁能夠促進E.coli的DNA裂解，導致SOS反應發(fā)生，從而抑制菌體的生長抑制能量代謝，通過抑制ATP合酶的活力進而抑制胞內(nèi)ATP的含量，影響菌體的生長。因此利用E.coli生產(chǎn)黃酮類化合物必須要考慮黃酮類化合物對E.coli的毒性作用。
[0004]目前在國內(nèi)未有關于增加E.coli對黃酮類化合物耐受性的相關蛋白的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術問題是是找出能提高E.coli對黃酮類化合物耐受性的相關蛋白并提供一種對黃酮類化合物高耐受性的E.coli工程菌。通過將可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株中malK基因進行沉默獲得。
[0006]所述工程菌含有沉默malK基因的質(zhì)粒。
[0007]所述malK基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]所述malK基因克隆于E.coli BL21(DE3)菌株，并構建重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malK 并轉(zhuǎn)入 E.coli BL21 (DE3)中。
[0009]所述黃酮類化合物為蘆丁，柚皮素或白藜蘆醇。
[0010]本發(fā)明的提 出的基礎及前期試驗:
[0011]I)在E.COli穩(wěn)定期時添加黃酮類化合物刺激后收集菌體細胞，提取膜蛋白，通過蛋白質(zhì)組學的技術手段，發(fā)現(xiàn)MalK蛋白的表達量有顯著的提高。
[0012]2)提高qPCR技術驗證該蛋白在這一生理過程中的mRNA水平。
[0013]3)通過ncbi查出該基因的核苷酸序列設計引物并克隆。
[0014]4)將基因與載體連接得到重組表達載體；
[0015]5)將得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)后得到重組菌株；
[0016]6)重組菌株進行IPTG誘導后通過qPCR驗證其mRNA水平是否下降即基因是否被
沉默；
[0017]7)通過在黃酮類化合物存在的環(huán)境下生長曲線的測定，驗證該蛋白的過量表達是否提高了 E.coli對黃酮類化合物的耐受能力。
[0018]下面是本發(fā)明技術方案的具體描述:
[0019]MalK蛋白的發(fā)現(xiàn)
[0020]挑取E.coli BL21 (DE3)單菌落用LB培養(yǎng)基活化后，按I %接種量接種于25mLLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)到穩(wěn)定期(IOh)添加lg/L黃酮類化合物(蘆丁，柚皮素，白藜蘆醇)刺激3h后收集菌體細胞。按照FOCUS? Global Fractionation說明書提取膜蛋白，并用2_DClean-Up試劑盒除去蛋白樣品中的離子，最后用非干擾性蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品中的濃度，最后按照450 μ L含有800ng的濃度水化上樣，使用24cm的pH4_7的膠條進行IEF，然后平衡兩次后用13.5%的SDS-PAGE進行第二向，結(jié)束后用R250進行染色12h，脫色后用ImageScanner III儀器對膠進行拍照，獲得清楚圖像后用TOQuest進行圖譜分析，挖出差異較大的點進行脫色，酶解等步驟，然后利用MALD1-T0F/MS質(zhì)譜對肽段樣品進行蛋白質(zhì)鑒定，通過檢索Matrix Science數(shù)據(jù)庫,確定蛋白種類。
[0021]qPCR
[0022]收集菌體的方法同上，利用天根公司的RNAprep Pure Cell/Bacteria試劑盒提取菌株細胞的總RNA,利用TaKaRa公司的PrimcScript'K ! RT reagent試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 構建 cDNA 文庫，利用 TaKaRa 公司的 SYBR Premix ExTaq 試劑盒和 LightCycler480IIReal Time PCR儀器進行qPCR反應，具體程序如下:95°C預變性30s ；95°C 5s — 55°C 20s，40次循環(huán)(PCR反應)；95°C 10s — 65°C Imin — 95°C 10s (溶解曲線分析)。為保證試驗的重現(xiàn)性，每個樣品3個平行，然后取平均值作為計算的基礎。
[0023]質(zhì)粒及重組菌的構建
[0024]將從ncbi上查到的malK的基因序列設計引物進行擴增，分別連接到克隆載體PMD19-T測序，獲得正確的轉(zhuǎn)化子后進行雙酶切連接到本實驗室構建的pRSF-PTasRNA質(zhì)粒上，構建得到重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malK，將構建好的重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR驗證陽性轉(zhuǎn)化子，提取構建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL2KDE3)菌中獲得沉默了malK基因的重組菌株。
[0025]生長曲線驗證
[0026]用M9 培養(yǎng)基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 % 葡萄糖，ImM 硫酸鎂，0.5 μ g/mLthiamine-HCl)活化工程菌(加入I %的氯霉素)和原始菌，按照I %的接種量接種入分別含有l(wèi)g/L蘆丁，柚皮素或者白藜蘆醇，IPTG(0，100，200，400禮)19培養(yǎng)基中，301: 200r/min培養(yǎng)，每隔Ih測0D_，直至菌株生長到穩(wěn)定期。獲得菌株的生長曲線圖，然后根據(jù)公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生長速率圖，然后得出最大比生長速率μ_。
[0027]本發(fā)明提供的工程菌耐黃酮類化合物能力提高，外源添加黃酮類化合物刺激Ε.coli生長，相較于原始菌，工程菌的最大比生長速率相較于原始菌提高了 2.14倍。
【具體實施方式】
[0028]實施例1MalK的發(fā)現(xiàn)
[0029]用接種針在Ε.coli BL21(DE3)平板上挑取單菌落接種于25mL LB培養(yǎng)基，活化12h。按照I %的接種量分別接種于4瓶25mL LB培養(yǎng)基，置于37°C搖床(200rpm)培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，其中三瓶分別添加25 μ L用DMSO溶解的濃度為0.lg/L的蘆丁，柚皮素和白藜蘆醇(終濃度為lg/L)，另外一瓶添加25 μ L DMSO作為對照，培養(yǎng)3h后8000rpm低溫離心收集菌體，用去離子水洗3次后按照FOCUS? Global Fractionation說明書提取膜蛋白，并用2-D Clean-Up試劑盒 除去蛋白樣品中的離子,最后用非干擾性蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品中的濃度，最后按照450 μ L含有800ng的濃度水化上樣，使用24cm的pH4_7的膠條進行IEF，然后平衡兩次后用13.5%的SDS-PAGE進行第二向，結(jié)束后用R250進行染色12h，脫色后用ImageScanner III儀器對膠進行拍照，獲得清楚圖像后用TOQuest進行圖譜分析，其中一個膠點在有蘆丁，柚皮素和白藜蘆醇的樣品中相較于對照組均有2倍以上的下調(diào)，將此點挖出進行脫色，脫水，酶解等步驟，然后利用MALD1-T0F/MS質(zhì)譜對肽段樣品進行蛋白質(zhì)鑒定，通過檢索MatrixScience數(shù)據(jù)庫得出此點是E.coli屬的MalK蛋白。
[0030]實施例2耐黃酮類化合物工程菌的構建
[0031]將從ncbi上查到的malK的基因前140bp和上游的40bp設計引物進行擴增，分別連接到克隆載體PMD19-T測序，獲得正確的轉(zhuǎn)化子后進行雙酶切連接到質(zhì)粒pRSF-PTasRNA上，構建得到重組質(zhì)粒pRSF-PTasRNA-malK，將構建好的表達載體轉(zhuǎn)化到E.coli JM109,涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固體培養(yǎng)基加20g/L瓊脂，121°C滅菌15min)，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，得到正確的單菌落進行發(fā)酵提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布到含有氯霉素的LB培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化后平板上的轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，得到正確的單菌落即為重組菌株，也即獲得高耐受黃酮類化合物的E.coli BL2KDE3)工程菌。
[0032]實施例3高耐受黃酮類化合物E.coli BL21 (DE3)工程菌生長曲線測定
[0033]挑取工程菌和含有空質(zhì)粒pRSF-PTasRNA的E.coli BL21 (DE3)單菌落接種到含有I %卡那霉素的M9培養(yǎng)基(13.3g/L M9CA Broth, 0.2 %葡萄糖，ImM硫酸鎂，0.5 μ g/mL thiamine-HCl)中活化IOh后，按I %接種量接入含有I %卡那霉素，lg/L黃酮類化合物(蘆丁，柚皮素，白藜蘆醇)，以及不同濃度的IPTG(0，100, 200, 400 μ Μ)的Μ9培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)，每隔Ih測一次OD6tltl直至菌株生長到穩(wěn)定期。根據(jù)公式μ = dx/x*dt算出菌株的比生長速率圖，然后得出最大比生長速率μ_，發(fā)現(xiàn)在有l(wèi)g/L蘆丁的環(huán)境中工程菌的^ max為0.42，而原始菌株的為0.23，生長速率提升了 1.83倍；在lg/L的柚皮素環(huán)境中工程菌的μ max為0.40，而原始菌株的為0.22，生長速率提升了 1.82倍；在lg/L的白藜蘆醇環(huán)境中工程菌的umax為0.30，而原始菌株的為0.14，生長速率提升了 2.14倍。
[0034]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種對黃酮類化合物耐受性提高的大腸桿菌工程菌，其特征在對可用于黃酮生產(chǎn)的大腸桿菌生產(chǎn)菌株進行改造，沉默其malK基因。
2.權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述malK基因核苷酸序列及其上游序列如SEQ ID N0.1 所示。
3.權利要求1所述的工程菌，其特征在于所述黃酮類化合物為蘆丁，柚皮素或白藜蘆醇。
4.權利要求1所述的工程菌的構建方法，其特征在于包括如下步驟: 1)根據(jù)所查E.coli BL2 1(DE3)中malK基因的前140bp和上游的30bp序列設計引物進行克隆； 2)將基因與載體連接得到重組表達載體； 3)將得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化E.coli后得到重組菌株。
5.權利要求1所述工程菌在黃酮類化合物生產(chǎn)中的應用。
【文檔編號】C12P17/06GK103923860SQ201410169130
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權日:2014年4月24日
【發(fā)明者】陳堅, 周景文, 王奎, 李江華, 堵國成 申請人:江南大學