一種伯克氏菌株、其有機(jī)磷酯水解酶和基因及其在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鑒定為伯克氏屬(Burkholderia?jiangsuensis)的菌株ECU1088，其保藏號(hào)為CGMCC?No.9028；該菌種表達(dá)的有機(jī)磷酯水解酶及其基因，含有該基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其重組酶及其制備方法，以及利用該有機(jī)磷酯水解酶或重組有機(jī)磷酯水解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的方法。本發(fā)明的有益效果在于：利用本發(fā)明提供的伯克氏菌株及其重組有機(jī)磷酯水解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥具有催化效果好、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等顯著優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種伯克氏菌株、其有機(jī)磷酯水解酶和基因及其在有機(jī)磷農(nóng)藥降解中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】,具體涉及一株伯克氏屬新種菌株Burkholderiajiangsuensis E⑶1088，其保藏號(hào)為CGMCC9028，該伯克氏新菌株表達(dá)的有機(jī)磷酯水解酶及其基因，含有該基因的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，及其重組酶的制備方法，還涉及有機(jī)磷酯水解酶或其重組酶作為催化劑降解有機(jī)磷農(nóng)藥的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]有機(jī)磷農(nóng)藥是乙酰膽堿酯酶的抑制劑，對(duì)人體具有較高毒性，威脅人類(lèi)健康。農(nóng)藥殘留是大量施用農(nóng)藥后的必然現(xiàn)象，如果超過(guò)最大殘留限量，會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生不良影響，或通過(guò)食物鏈對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中的生物造成毒害。農(nóng)藥的發(fā)明和使用雖然大大提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量和效益，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們生活水平的提高，農(nóng)藥殘留對(duì)環(huán)境及人類(lèi)健康造成的負(fù)面影響日益顯露出來(lái)。
[0003]大量研究表明，土壤微生物對(duì)環(huán)境中的農(nóng)藥降解起著重要作用，篩選農(nóng)藥降解菌株無(wú)疑是控制農(nóng)藥殘留量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境及人類(lèi)健康的有效手段，有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌主要是從有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤、水體或污泥等環(huán)境中直接分離篩選或經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)獲得。目前已報(bào)道的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌主要為真菌和細(xì)菌，崔中利等人首次從Pseudomonas sp.M6的基因文庫(kù)中克隆了一種新的有機(jī)磷酯水解酶基因mpd(Appl.Environ.Microbiol.，67:4922-4925)，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基對(duì)硫磷的活力僅為 0.96U/ml,而后，人們分別從 Pseudomonas, Bacillus, Stenotrophomonas 等種屬的微生物中克隆出mpd基因 ，得到MPH酶。武漢病毒所周寧一等人從Pseudomonassp.WBC-3中克隆出mpd基因，得到MPH酶，其粗酶液催化甲基對(duì)硫磷的比活力為12.7U/mg (Biochem Biophys Res Commun.，334:1107-1114),純酶液為 50.5U/mg (Research inMicrobiology.，158:143-149)，目前研究報(bào)道的重組有機(jī)磷酯水解酶催化活力還有待提高，且降解菌株的多樣性和新穎性也有待豐富。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題就是豐富降解菌株的多樣性，并從中挖掘新的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一是:
[0006]1.本發(fā)明提供了一株伯克氏新菌株 Burkholderia jiangsuensis CGMCC9028,是發(fā)明人從浙江、江蘇、上海、陜西等地區(qū)的150多份有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤樣品中，經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩及分離純化，得到的產(chǎn)有機(jī)磷酯水解酶的新菌株。
[0007]2.篩選菌株所用的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)使用的培養(yǎng)基，本發(fā)明所述培養(yǎng)基優(yōu)選配方為:
[0008](I)富集培養(yǎng)基(MSM)配方:(NH4) 2S041.0g.l-1，K2HPO40.8g.l-1，KH2PO40.2g.l-1，MgS040.2g ?L-1, CaSO40.08g ?L-1, FeSO4 *7H200.005g.L-1，Na2MoO4 *2H200.0033g ?L-1,用自來(lái)水配制，pH7.0，第一輪添加終濃度為25mg.L-1的甲基對(duì)硫磷(MP)，每一輪逐步增加MP的濃度，直至底物濃度達(dá)到200mg.L-1 ；
[0009](2)豐富培養(yǎng)基(PY)配方:蛋白胨10.0g.L-\酵母膏5.0g ?L-1，氯化鈉5.0g ?L-1，用自來(lái)水配制，ΡΗ7.0 ;
[0010]3.本發(fā)明所述菌株的篩選方法包括以下步驟:
[0011](I)富集培養(yǎng):從浙江、江蘇、上海、陜西等地不同環(huán)境中采取土壤樣品。取Ig 土樣加入到5mL第一輪富集培養(yǎng)基中，30°C，180rpm培養(yǎng)3天后，按5 %的接種量轉(zhuǎn)接到5mL第二輪富集培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)3d，不斷傳代，至MP濃度為200mg.L-1 ；
[0012](2)純種分離:富集培養(yǎng)后，取400 μ I樣品加入二倍體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，分離萃取液，待二氯甲烷揮發(fā)完全后，加入20μ I乙腈，然后用薄板層析法定性檢測(cè)底物是否有減少或是否有產(chǎn)物生成，將有明顯底物減少或產(chǎn)物生成的富集培養(yǎng)液取樣劃線(xiàn)于含有200mg/L底物的MSM培養(yǎng)基固體平板上，30°C下倒置培養(yǎng)。置于30°C恒溫養(yǎng)箱中培養(yǎng)I~2d，觀察菌落的生長(zhǎng)速率和水解圈的大小，初步判斷其降解能力，選擇水解圈大的，根據(jù)菌落顏色、大小、形態(tài)進(jìn)行單菌落的分離，分離后的單菌落于-20 V保藏用于初篩。
[0013](3)菌株初篩:挑取少量平板分離得到的單菌落，接入裝有5mL底物終濃度為SOOmg.r1的PY培養(yǎng)基的試管(15X150mm)中，于30°C，180rpm恒溫通風(fēng)培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結(jié)束后取400 μ I培養(yǎng)液加入二倍體積的二氯甲烷進(jìn)行萃取，12，OOOrpm離心2min，棄上層水相，下層有機(jī)相待二氯甲烷揮發(fā)完全后，加入20μ I乙腈重新溶解。采用薄板層析法定性檢測(cè)各菌株的活性大小，根據(jù)底物斑點(diǎn)是否明顯變淡或消失，淘汰沒(méi)有活性或者活性相對(duì)較低的菌株，將活性高的菌株 取一定體積的菌液分裝至事先滅菌的菌種保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的無(wú)菌甘油，置于_20°C保藏用于復(fù)篩。
[0014](4)菌株復(fù)篩:將初篩得到的活性較高的菌株接種到裝有5ml PY培養(yǎng)基的試管中，于30°C，180rpm培養(yǎng)24h，至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD6tltl約為0.6-0.8，將菌液于8000rpm，離心5min，用無(wú)菌水洗滌兩次，加入無(wú)菌水調(diào)整0D_ = 1.0即為種子液，分別以I %的接種量接入裝有5ml豐富培養(yǎng)基PY的試管中，添加底物MP終濃度為200mg.L-1，于30°C，180rpm恒溫通風(fēng)下反應(yīng)。定時(shí)取樣，取200μ I反應(yīng)液加入二倍體積的二氯甲烷萃取產(chǎn)物和底物，待有機(jī)相完全揮發(fā)后，加入200 μ I乙腈重新溶解，濾膜過(guò)濾后，即可通過(guò)高效液相色譜測(cè)定底物的降解速率。根據(jù)降解速率的檢測(cè)結(jié)果，淘汰性能較差的菌株，催化性能較好的菌株取一定體積的種子液分裝至事先滅菌的菌種保存管，以1:1 (v/v)的量加入50%的無(wú)菌甘油，置于-70°C保藏用于進(jìn)一步研究。復(fù)篩菌株降解效果如表1所示。
[0015]表1.復(fù)篩菌株對(duì)MP降解狀況
[0016]
【權(quán)利要求】
1.一株伯克氏屬(Burkholderia jiangsuensis)菌株 EQJ1088,其保藏號(hào)為CGMCC9028。
2.如權(quán)利要求1所述的伯克氏屬(Burkholderiajiangsuensis)菌株EQJ1088,其特征在于，所述伯克氏菌株表達(dá)有機(jī)磷酯水解酶。
3.如權(quán)利要求2所述的有機(jī)磷酯水解酶，其特征在于，所述有機(jī)磷酯水解酶是具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
4.一種有機(jī)磷酯水解酶的編碼基因，其特征在于，其是如下(I)或(2)的核酸: (1)如序列表中SEQID N0.1所示的核酸； (2)編碼具有SEQID N0.2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
5.一種重組表達(dá)載體，其包含如權(quán)利要求4所述的有機(jī)磷酯水解酶的編碼基因。
6.一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其包含如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體。
7.—種重組有機(jī)磷酯水解酶的制備方法，所述方法包括:培養(yǎng)如權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，獲得重組表達(dá)的有機(jī)磷酯水解酶或含有機(jī)磷酯水解酶的重組生物細(xì)胞。
8.用如權(quán)利要求2所述的有機(jī)磷酯水解酶或如權(quán)利要求7所述方法獲得的重組表達(dá)的有機(jī)磷酯水解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的方法。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述有機(jī)磷農(nóng)藥包括甲基對(duì)硫磷、甲胺磷、毒死蜱、三唑磷、氧樂(lè)果、敵敵畏和二嗪磷。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103952354SQ201410169274
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】許建和, 柳絮云, 李春秀, 羅曉晶, 潘江 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)