對l-抗壞血酸進行微生物生產(chǎn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對L-抗壞血酸進行微生物生產(chǎn)的方法。本發(fā)明公開了一種經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其是從編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的多核苷酸獲得的，所述多核苷酸分子包含SEQ?ID?NO：1的至少20個連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。本發(fā)明還涉及以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，特別是，使用能將給定碳源轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物的靜止細胞的方法?？赏ㄟ^純化和/或分離步驟對由此得到的維生素C進行進一步的加工。
【專利說明】對L-抗壞血酸進行微生物生產(chǎn)的方法
[0001]本發(fā)明是申請日為2004年8月16日、申請?zhí)枮?00480023361.2、題為“對L-抗
壞血酸進行微生物生產(chǎn)的方法”的申請的分案申請。
[0002]本發(fā)明涉及從編碼能將L-山梨糖酮(L-sorbosone)直接轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的酶的多核苷酸獲得的(derived)多核苷酸。L-山梨糖酮脫氫酶(下文中:SNDHai)能從L-山梨糖酮直接生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)。L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai)是從屬于Gluconobacter屬和Acetobacter屬的細菌獲得的。本發(fā)明還涉及以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法。L-抗壞血酸廣泛用于制藥、食品和化妝品工業(yè)。
[0003]在過去的70年中，已通過公知的Reichstain方法從D-葡萄糖對L抗壞血酸(維生素C)進行了工業(yè)生產(chǎn)。該方法中的所有步驟都是通過化學方式進行的，只除了其中一個(從D-山梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過微生物轉(zhuǎn)化來進行。自從對L-抗壞血酸的工業(yè)生產(chǎn)的最初開始，就已將多種化學方法和技術修飾用于提高Reichstain方法的效率。對維生素C生產(chǎn)的最新進展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,5th Edition, Vol.A27(1996)，pp.547ff。近來，已在微生物或從中分離出的酶的協(xié)助下，來進行生產(chǎn)維生素C的不同步驟。
[0004]目前用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有機及無機溶劑。因此，在過去數(shù)十年中，人們已在研究用微生物轉(zhuǎn)化來制造L-抗壞血酸的其它方法，所述方法將是更加經(jīng)濟以及環(huán)保的。已報道了在多種微生物中直接對L-抗壞血酸的生產(chǎn)。 [0005]令人驚奇地，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，可用分離自G.0xydans N44-1的L-山梨糖酮脫氫酶(下文中:SNDHai),或來自屬于Gluconobacter屬和Acetobacter屬的乙酸細菌的其直向同源體(ortholog)，來進行L-山梨糖酮向L-抗壞血酸的直接轉(zhuǎn)化。用于該反應的基因被分離出，對其進行測序。通過該基因編碼的山梨糖酮脫氫酶能將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸。該酶與已知的SNDH酶不同。
[0006]術語“L-抗壞血酸”和“維生素C”在本文中可以互換使用，其可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學形式，例如未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽的形式為陰離子，同時存在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽離子，例如，鉀、鈉、銨或鈣。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過分離的晶體。另一方面，用其相應的鹽的名稱來命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸鉀、抗壞血酸鈣等。
[0007]L-山梨糖酮向維生素C的轉(zhuǎn)化表示:導致維生素C產(chǎn)生的對底物的轉(zhuǎn)化是通過SNDHai來進行的，即，底物被直接轉(zhuǎn)化為維生素C。
[0008]克隆載體可以例如是任何質(zhì)?；蚴删wDNA或能在宿主細胞中自主復制的其它DNA序列，所述序列有如下特征:其具有一個或少量的限制性內(nèi)切酶識別位點，可在這些位點以可確定的方式對此類DNA序列進行切割，而不會導致載體的基本生物學功能的損失，還可向這些位點接合進DNa片段，以使得復制發(fā)生?？寺≥d體還可含有，例如，適用于對經(jīng)過克隆載體轉(zhuǎn)化的細胞進行標識的標記。此類標記可以提供，例如，對抗生素的抗性，例如，對四環(huán)素或氨芐青霉素的抗性。
[0009]表達載體可以是能增強被克隆進來的基因的表達的任何載體，例如在轉(zhuǎn)化進宿主之后。被克隆的基因通常處于某些控制序列的控制之下(即，與其可操作地連接)，例如啟動子序列。啟動子序列可以是組成型的或誘導型的。
[0010]核酸分子可以包括DNA和RNA。任何形式的，例如雙鏈的、單鏈的核酸以及其核苷可被用作為核酸分子。還包括在內(nèi)的有雜交體，例如，DNA-RNA雜交體、DNA-RNA-蛋白質(zhì)雜交體、RNA-蛋白質(zhì)雜交體和DNA-蛋白質(zhì)雜交體。多核苷酸可由若干堿基組成,通常至少20個核苷酸堿基。
[0011]術語“同源性(homology)”指兩條多核苷酸序列間的相似性。為確定同源性，將多核苷酸序列以使相似的區(qū)域能被比較的方式排列起來。如果需要的話，某些位置上的核苷酸可被空位置代替，以提高相似性。同源性比較可以例如通過手工或通過使用商業(yè)可獲得的計算機程序來進行。優(yōu)選地，所述程序在標準條件下運行，以獲得最大的同源性。兩條核苷酸序列之間同源性或相似性的程度被表示為“ ％同源性”。
[0012]突變可以例如是:目標核苷酸序列中單個堿基對的變化、插入或缺失，或者遺傳事件，例如遺傳元件(例如，轉(zhuǎn)座子)的插入。
[0013]將突變引入到DNA中，即，誘變可以以不同方式來進行，例如，隨機地，即，隨機誘變，其中，突變的精確位置不可預計，其可發(fā)生于微生物染色體上的任何地方，或發(fā)生于內(nèi)源質(zhì)粒上。突變還可作為例如放射、化學處理或遺傳元件的插入等因素導致的物質(zhì)損傷的結果被產(chǎn)生。
[0014]作為啟動子使用 的可以是下述任何DNA序列，所述DNA序列定位于接近某基因的起始密碼子的地方，能啟動一種或多種相鄰基因的轉(zhuǎn)錄。通常，啟動子可以定位于某基因的5’區(qū)域。啟動子可以是誘導型的或組成型的啟動子。在誘導型啟動子的情況下，轉(zhuǎn)錄速率會應答于誘導劑增加。在組成型啟動子的情況下，轉(zhuǎn)錄速率不會被例如誘導劑所調(diào)節(jié)。
[0015]術語“相同性”和相同性”指用序列分析程序(例如下文中示出的)對兩條氨基酸序列進行的比較。“ ％相同”表示對象氨基酸序列與被比較的氨基酸序列的相同氨基酸匹配的氨基酸的百分比。如果被比較的兩條氨基酸序列的任何氨基酸都沒有區(qū)別，它們就是相同的或具有100%相同性。
[0016]在一種實施方式中，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其可從編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的多核苷酸分子獲得(derivable)，并且包含SEQ ID NO:1的至少20個連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。因此，本發(fā)明提供了一種經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其是從編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的多核苷酸獲得的，并且包含SEQ IDNO:1的至少20個連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。優(yōu)選地，經(jīng)過分離的多核苷酸包含SEQ IDNO:1的至少50個或更優(yōu)選地，至少100個連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。最優(yōu)選的是包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的經(jīng)過分離的多核苷酸。進一步最優(yōu)選的實施方式是包含選自由SEQ ID NOs:11、13、15、17、19、21和26所構成的組的核苷酸序列的經(jīng)過分離的多核苷酸。經(jīng)過分離的多核苷酸可以從編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的多核苷酸獲得。SEQ ID NO:1代表了從微生物Gluconobacter oxydans N44-1中分離出的SNDHai的完整核苷酸序列。這樣的序列各部分可被用于不同的目的。例如，短的多核苷酸可被用作為引物，用于，例如對從其它生物中分離出的合適的多核苷酸進行擴增。短的多核苷酸可在大約10至大約100個堿基對(bp)的范圍內(nèi)，通常為大約14至大約50，優(yōu)選在大約17至30bp。此類短的多核苷酸序列的例子可被SEQ ID NOs:5、6、7、8、9、10、23或24所表示。較長的多核苷酸可編碼具有酶活性的多肽。例如，SNDHai具有跨膜結構域，其可能不用于酶活性。如果編碼蛋白質(zhì)的酶活性區(qū)域的多核苷酸的部分在沒有跨膜結構域的情況下表達，此種多肽可能具有充分的酶活性。
[0017]經(jīng)過分離的多核苷酸分子通常從也編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的較長的多核苷酸序列獲得。此類多核苷酸可以例如分離自細菌。優(yōu)選地，它們是從屬于Gluconobacter屬和Acetobacter屬的細菌中分離出來的，所述細菌包括但不限于G.0xydans、G.frateuri1、G.cerinus和A.aceti。當此類多核苷酸從較長的多核苷酸序列獲得時，確定此類多核苷酸序列與SEQ ID NO:1之間的同源性是可能的。在此種情況下，優(yōu)選地，選擇具有至少100個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，將來自其它多核苷酸的相應的片斷(stretch)與其進行比較。當多核苷酸序列與可從SEQ ID NO:1獲得的相應片斷具有例如60個相同的核苷酸時(通過對100個連續(xù)的核苷酸進行比較)，那么同源性就是60%。因此，在一種實施方式中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過分離的多核苷酸，其中，所述部分核苷酸序列獲得自:對至少100個連續(xù)核苷酸進行比較時，與SEQ IDNO:1具有至少60%同源性的多核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的部分多核苷酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%的同源性，更優(yōu)選地，至少90%的同源性。為確定同源性，使用例如至少100個連續(xù)核苷酸的片斷，優(yōu)選地，至少300個連續(xù)核苷酸的片斷，更優(yōu)選地，至少500個連續(xù)核苷酸的片斷。
[0018]本發(fā)明提供了新穎的多核苷酸序列，所述序列編碼屬于乙酸細菌的微生物的L-山梨糖酮脫氫酶，所述細菌包括Gluconobacter屬和Acetobacter屬，所述的酶用于從L-山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸。所述的多核苷酸優(yōu)選編碼具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽，或者，從所述多肽獲得的(derived)或可從所述多肽獲得的(derivable)多肽，例如，通過在SEQ ID NO: 2的序列中取代、缺失、插入或添加一個或多個氨基酸獲得的，所述多肽保留有從L山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸的L-山梨糖酮脫氫酶活性。還包括在內(nèi)的有:編碼保留有從L山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸的L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的部分多肽序列的多核苷酸序列，例如，由SEQ IDNOs:12、14、16、18、20、22或27所示。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽包含選自本申請公開的多肽的氨基酸序列的、具有至少25個連續(xù)氨基酸的部分氨基酸序列。本領域技術人員了解下述事實:多肽中的某些片斷是生物學功能所必需的。但是，存在有其它區(qū)域，其中氨基酸可被插入、缺失或被其它氨基酸取代，優(yōu)選是與被代替的氨基酸相似的那些氨基酸取代。
[0020]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的重組DNA分子和/或表達載體，尤其是能在合適的宿主細胞中發(fā)揮功能的。
[0021]任何可作為外源核苷酸分子受體的細胞都可被用作為宿主細胞，例如攜帶有可復制表達載體或克隆載體的細胞，或通過公知技術對其進行過遺傳改造從而在其染色體或基因組中含有想要的基因的細胞。宿主細胞可以是原核或真核來源的，例如，細菌細胞、動物細胞(包括人的細胞)、真菌細胞(包括酵母細胞)和植物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞屬于能在體內(nèi)將L-山梨糖酮脫氫酶作為活性形式表達的細菌,更優(yōu)選地，Gluconobacter>Acetobacter、Pseudomonas (例如 P.putida)或 Escherichia 屬(例如 E.coli)的細菌。
[0022]因此，本發(fā)明的一個方面是提供如上所述的宿主細胞，其中包含具有整合到其染色體DNA上的多核苷酸的此類表達載體或此類核苷酸。此類宿主細胞然后被稱為重組宿主細胞或重組生物。
[0023]本發(fā)明還涉及制造由本發(fā)明的多核苷酸編碼的重組L-山梨糖酮脫氫酶多肽的方法。此類方法包括:例如，對如上文特別描述的本發(fā)明的任何重組生物進行培養(yǎng)。因此，本發(fā)明的一部分是通過該方法制造的重組L-山梨糖酮脫氫酶多肽。此類重組L-山梨糖酮脫氫酶，例如，可作為可溶的酶，在技術人員已知的、用于酶反應的任何標準程序中使用，通過用膜模塊或膜反應器等設備對其進行回收，或在用于固相酶反應的固體載體上對其進行固定。
[0024]本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述方法包括:在本發(fā)明的多核苷酸編碼的重組L-山梨糖酮脫氫酶多肽的協(xié)助下，將底物轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸。從能天然(即，非重組地)生產(chǎn)此類酶的微生物中分離出來的L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai)的使用(其中，分離出的SNDHai是由本發(fā)明的多核苷酸編碼的)也包括在本發(fā)明中。
[0025]能通過本發(fā)明的多核苷酸編碼的SNDHai轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的碳源可以作為底物使用。優(yōu)選的底物選自L-山梨糖、D-山梨糖醇和L-山梨糖酮。
[0026]在本發(fā)明的一種實施方式中，用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法包括將L-山梨糖或D-山梨糖醇轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸，該過程在能將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為L-山梨糖酮或能將D-山梨糖醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖酮的宿主細胞中進行。
[0027]在另一種實施方式中，用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法包括:在由本發(fā)明的多核苷酸編碼的重組SNDHai的協(xié)助下，將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸。從能天然(即，非重組地)生產(chǎn)此類酶的微生物中分離出來的L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai)的使用(其中，分離出的SNDHai是由本發(fā)明的多核苷酸編碼的)也可用于此類方法。
[0028]本發(fā)明提供了編碼酶(L-山梨糖酮脫氫酶SNDHai或其部分)的經(jīng)過分離的核酸分子。對經(jīng)過分離的核酸分子進行操作的方法和技術是本領域內(nèi)公知的。用于分離、純化和克隆核酸分子的方法，以及描述了對真核和原核宿主的使用及其中核酸和蛋白質(zhì)表達的方法和技術是技術人員已知的。
[0029]本發(fā)明的多肽的功能性衍生物也可以是本發(fā)明的一部分，對它的定義基于通過本發(fā)明的氨基酸序列的一個或多個氨基酸殘基的添加、插入、缺失和/或取代產(chǎn)生的氨基酸序列，其中，用本領域已知的或本文中特別描述過的試驗進行測量時，此類衍生物優(yōu)選地仍具有L-山梨糖酮脫氫酶活性。此類功能性衍生物可以通過本領域已知的化學肽合成或基于如本文公開的DNA的重組技術、通過本領域范圍內(nèi)已知的方法來制造。通常不會改變此類分子活性的蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸取代是已知的。
[0030]在本發(fā)明的特定的實施方式中，目標保守取代按照如下所述發(fā)生:作為示例性的取代，Ala 到 Val/Leu/Ile、Arg 到 Lys/Gln/Asn、Asn 到 Gln/His/Lys/Arg> Asp 到 Glu、Cys到 Ser> Gln 到 AsruGl u 到 Asp、Gly 到 Pro/Ala、His 到 Asn/Gln/Lys/Arg、He 到 Leu/Val/Met/Ala/Phe/norLeu、Lys 到 Arg/Gln/Asn、Met 到 Leu/Phe/Ile、Phe 到 Leu/Vallle/Ala/Tyr> Pro 到 Ala、Ser 到 Thr、Thr 到 Ser、Trp 到 Tyr/Phe、Tyr 到 Trp/Phe/Thr/Ser 和 Val到 Ile/Leu/Met/Phe/Ala/norLeu 是合理的。作為優(yōu)選的例子，Ala 到 Val、Arg 到 Lys、Asn到 GlruAsp 到 Glu>Cys 到 Ser>Gln 到 AsruGlu 到 Asp、Gly 到 Ala、His 到 Arg、Ile 到 Leu>Leu 到 lie、Lys 到 Arg、Met 到 Leu、Phe 到 Leu、Pro 到 Ala、Ser 到 Thr、Thr 到 Ser、Trp 到Tyr、Tyr到Phe和Val到Leu是合理的。如果此類取代導致生物活性的變化，那么，被上文所述的示例性取代所命名的更多實質(zhì)性的改變將被引入，產(chǎn)物將被篩選。
[0031]除非特別指明，本文中通過對DNA分子進行測序來確定的所有核苷酸序列都是用自動 DNA 測序儀(例如 Applied Biosystems PRISM310genetic analyzer 的型號)測定的。因此，如本領域所已知的，對由該自動方法所測定的任何DNA序列而言，本文所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。典型地，通過自動方法測出的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少大約90%同源，更典型地，至少大約95%至至少大約99.9%同源。通過其它方法，包括本領域內(nèi)公知的人工DNA測序方法，可對實際序列進行更為精確的測定。也如本領域所已知的，較之實際序列，測得的核苷酸序列中的單個插入或缺失將會導致核苷酸序列翻譯中的框移，使得:從此類插入或缺失的點開始，通過測得的核苷酸序列編碼的預計氨基酸序列完全不同于被測序的DNA分子實際編碼的氨基酸序列。
[0032]在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性(如序列表所公開的，SEQ ID NO:2)的多肽的多核苷酸及其互補鏈，或包括這些序列、DNA序列或其片段的那些，以及能在標準條件下與此類序列雜交的、但是編碼具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
[0033]對多核苷酸序列的相似性進行描述的另一種模式是確定此類序列是否能雜交。這取決于為雜交選用的條件。
[0034]用于雜交的標準條件在本文中指下述條件:其是本領域技術人員通常用于探測特異性雜交信號的條件，或者，優(yōu)選地，本領域技術人員使用的所謂“嚴謹雜交條件”。因此，在本文中使用的術語“嚴謹雜交條件”指:如果序列之間存在大約95%以及優(yōu)選地至少97%的同源性，雜交將會發(fā)生。嚴謹雜交條件是，例如，在有或沒有100 μ g/ml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb 溶液(Roche D iagnostics GmbH)中，或在包含 50% 甲酸胺、5x SSC (150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0.02%十二烷基磺酸鈉、0.1% N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(RocheDiagnostics GmbH)的溶液中，用地高辛(DIG)標記的DNA探針(通過用DIG標記系統(tǒng)(RocheDiagnostics GmbH, 68298mannheim, Germany)來制備的)在 42°C溫育 2 小時至 4 天,接著在2x SSC和0.1 % SDS中，于室溫下，洗兩次過濾器，每次5至15分鐘，然后在65-68 °C，于0.5x SSC和0.1% SDS或0.1xSSC和0.1% SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。
[0035]在一個方面，可以通過下述步驟來獲得用于本發(fā)明中的編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因、含有所述基因的核酸分子、表達載體和重組生物。
[0036](I)如下文所述,對屬于Gluconobacter屬或Acetobacter屬的、能從L-山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸的菌株進行轉(zhuǎn)座子誘變，以獲得能表達由所用的轉(zhuǎn)座子編碼的抗生素抗性的菌落；
[0037](2)用L-山梨糖酮作為底物進行篩選，選出L-抗壞血酸非生產(chǎn)突變體；
[0038](3)從突變體中分離出染色體DNA ；
[0039](4)通過菌落、噬菌斑或Southern雜交、PCR (聚合酶鏈式反應)克隆等，克隆含有來自染色體的轉(zhuǎn)座子的DNA片段；
[0040](5)測定含有轉(zhuǎn)座子插入的DNA片段的核苷酸序列；
[0041](6)從能從L-山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸的親本菌株中克隆DNA片段；
[0042](7)構建表達載體，其中編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因能有效表達；[0043](8)通過適于將DNA引入到宿主細胞中的方法，例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合轉(zhuǎn)移(conjugal transfer)和/或電穿孔,構建重組微生物,其帶有編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因，所述宿主細胞由此變成了本發(fā)明的重組生物。
[0044]轉(zhuǎn)座子誘變作為遺傳分析的有效工具是已知的(P.Gerhardt et al.,“Methods forGeneral and Molecular Bacteriology，，Chapterl7, Transposon Mutagenesis ；AmericanSociety for Microbiology)。
[0045]多種轉(zhuǎn)座子都是本領域內(nèi)已知的，例如Tn3、Tn5、Tn7、Tn9、TnlO、噬菌體Mu等。它們中間，Τη5已知幾乎不具有插入特異性，其尺寸相對地小。對于在本發(fā)明的實施中用于隨機誘變的目的而言，Τη5是優(yōu)選的。一系列的Τη5衍生物，被命名為Mini_Tn5s的，也是可用于本發(fā)明的，其由19bp的Tn5反向重復構成，這是與抗生素抗性或其它選擇性標記基因結合的轉(zhuǎn)座所需要的。除Τη5轉(zhuǎn)座酶(tnp)之外，此類Mini_Tn5s被插入到自殺性載體中，以構建有效的自殺性Tn5誘變系統(tǒng)。
[0046]用轉(zhuǎn)座子進行的隨機誘變包括:通過，例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合交配或電穿孔，用自殺性質(zhì)粒或噬菌體載體，將轉(zhuǎn)座子引入到目標細菌細胞中?？稍谵D(zhuǎn)座子攜帶的標記的幫助下，對得到的突變體進行篩選。所用的載體通過離析丟失之后，可探測到轉(zhuǎn)座子向受體細菌基因組中的轉(zhuǎn)座。
[0047]為將轉(zhuǎn)座子引入到Gluconobacter屬或Acetobacter屬的微生物中，通常使用所謂的自殺性載體(包括，例如，噬菌體Pl的衍生物)和窄宿主范圍質(zhì)粒(例如帶有ColEl復制起點的pBR325的衍生物)。可通過感染，以及通過轉(zhuǎn)化、接合交配(conjugal mating)或電穿孔，分別將噬菌體Pl載體和質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到受體細胞中，其中，優(yōu)選地，這些載體缺少受體的合適起點。對 將使用的自殺性載體和轉(zhuǎn)座子的選擇取決于如下標準，包括，例如，噬菌體敏感性、受體細胞的內(nèi)源抗生素抗性、基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(包括轉(zhuǎn)化、接合轉(zhuǎn)移、電穿孔或感染，以將帶有轉(zhuǎn)座子的載體引入E.coli)的可獲得性。
[0048]用于本發(fā)明的優(yōu)選載體中的一種是，例如，噬菌體Pl (ATCC25404)，其能將其DNA注入到屬于Gluconobacter或Acetobacter屬的微生物中，但是該DNA不能復制,通過離析將會丟失。此類攜帶有Tn5的Pl噬菌體(P1::Τη5)可以以噬菌體分解物的形式(其可根據(jù)已知方法，對攜帶有P1::Τη5的Ε.coli進行裂解來制備)使用(見,例如“Methods forGeneral and Molecular Bacteriology，，Chapterl7, Transposon Mutagenesis ；AmericanSociety for Microbiology 或美國專利 5082785,1992)。
[0049]為驗證缺陷型菌株真的攜帶有轉(zhuǎn)座子，可通過標準方法來進行例如菌落雜交或Southern雜交等方法,其中使用經(jīng)過標記的含有轉(zhuǎn)座子的DNA片段作為探針(Molecularcloning, a laboratory manual second edition, Maniatis T., et al., 1989)。
[0050]可根據(jù)本發(fā)明的實施例5所述來分離此類突變體。轉(zhuǎn)座子突變體可被用于進一步鑒定編碼L-山梨糖酮脫氫酶的目標基因，以及測定緊隨轉(zhuǎn)座子的區(qū)域的核苷酸序列。
[0051]通過篩選出既顯示載體選擇標記又顯示轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)化子，可將含有轉(zhuǎn)座子插入的DNA片段克隆進任何E.coli克隆載體，優(yōu)選地，pUC18、pUC19、pBluescript IIKS+(Stratagene Europe)及其相關物。可通過本領域已知的測序方法來測定與轉(zhuǎn)座子相鄰的核苷酸序列。
[0052]或者，當從能從L-山梨糖酮生產(chǎn)L-抗壞血酸的菌株中純化所述所述的L-山梨糖酮脫氫酶多肽時，可通過如下示意性的方法，將想要的基因從染色體全DNA克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中:
[0053](i)通過例如基質(zhì)輔助激光解吸附/電離(MALDI)等方法，從純化的蛋白質(zhì)或其肽片段來測定部分的氨基酸序列。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之后，可通過分離此類整個蛋白質(zhì)或通過肽酶處理，從凝膠中制備此類整個蛋白質(zhì)或肽片段。由此獲得的蛋白質(zhì)或其片段還可用于蛋白質(zhì)測序儀，例如Applied Biosystems自動氣相測序儀470A。該氨基酸序列可被用于用DNA合成儀(例如，Applied Biosystems自動DNA測序儀381A)來設計和制備寡核苷酸探針和/或引物。該探針可被用于:通過例如，Southern雜交、菌落雜交或噬菌斑雜交，從攜帶有目標基因的菌株的基因文庫中分離出攜帶有目標基因的克隆。
[0054](ii)或者還可以，為了從基因文庫中篩選出表達目標蛋白質(zhì)的克隆的目的，使用免疫方法，其中使用針對目標蛋白質(zhì)制備出的抗體。
[0055](iii)可通過，例如PCR，用一套引物(B卩，根據(jù)上文測定的氨基酸序列合成的兩條寡核苷酸)從染色體總DNA中擴增出目標基因的DNA片段。然后，通過Southern雜交、菌落雜交或噬菌斑雜交，用上面獲得的PCR產(chǎn)物作為探針，從例如在E.coli中構建的基因文庫分離出攜帶有整個基因的克隆。
[0056]通過本領域內(nèi)已知的方法， 使用基于本文公開的DNA序列設計的引物，可通過PCR獲得的DNA序列也是本發(fā)明的目的。
[0057]可以例如用，經(jīng)過純化的L-山梨糖酮脫氫酶蛋白質(zhì)、經(jīng)過純化的重組L-山梨糖酮脫氫酶蛋白質(zhì)(例如，E.coli中表達的加上His標簽的L-山梨糖酮脫氫酶)或其肽片段作為抗原，來制備上述抗體。從L-山梨糖酮脫氫酶的核苷酸序列推斷出的多肽序列可用作為抗原，以制備抗體。
[0058]一旦獲得了攜帶有想要的基因的克隆，就可以通過公知的方法來測定目標基因的核苷酸序列了。
[0059]為有效表達想要的基因/核苷酸序列，可以使用多種啟動子；例如，基因的原始啟動子，抗生素抗性基因(例如，Tn5的卡納霉素抗性基因、pBR322的氨芐青霉素抗性基因)的啟動子，Ε.coli的beta半乳糖苷酶(lac)、trp、tac、trc啟動子，lambda卩遼菌體啟動子和可在宿主細胞中發(fā)揮功能的任何啟動子。為此目的而言，宿主細胞可以選自由細菌細胞、動物細胞(包括人類細胞)、真菌細胞(包括酵母細胞)和植物細胞所構成的組。優(yōu)選地，宿主細胞屬于能在體內(nèi)表達作為活性形式的L-山梨糖酮脫氫酶的細菌，特別是Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas 和 Escherichia 屬的細菌。
[0060]為進行表達，其它調(diào)控元件，例如，在宿主細胞中(其中將引入編碼序列，以提供本發(fā)明的重組細胞)可操作的Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主細胞中可操作的天然和和合成的序列)以及轉(zhuǎn)錄終止子(反向重復結構，包括任何天然的和合成的序列)，可以與上述啟動子一起使用。
[0061]在對雙鏈DNA的克隆中,可以使用一系列宿主/克隆載體的組合。用于在E.coli中表達本發(fā)明的基因(即，SNDHai基因)的優(yōu)選載體可以選自任何通常用于E.coli中的載體，例如能表達加上His標簽的重組蛋白質(zhì)的pQE載體(QIAGEN AG Switzerland)、pBR322 或其衍生物(包括，例如 pUC18 和 pBluescript II (Stratagene Cloining Systems,Calif.，USA))、pACYC177和pACYC184及其衍生物和來自廣宿主范圍質(zhì)粒的載體，例如RK2和 RSF1010。用于在細菌(包括 Gluconobacter、Acetobacter 和 Pseudomonas)中表達本發(fā)明的核苷酸序列的優(yōu)選載體選自可在Gluconobacter、Acetobacter和Pseudomonas以及優(yōu)選的克隆生物(例如E.coli)中復制的任何載體。優(yōu)選的載體是廣宿主范圍載體，例如，粘粒載體(例如pVKlOO)及其衍生物和RSF1010。為使克隆的基因穩(wěn)定且有效地表達，還為了對攜帶有克隆基因的宿主細胞進行有效地培養(yǎng)，應對載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性進行仔細考慮。含有例如可轉(zhuǎn)座元件(例如Tn5)的核酸分子也可用作為載體，以將想要的基因引入到優(yōu)選宿主中，尤其是染色體上。含有從優(yōu)選宿主中分離出的任何DNA和本發(fā)明的SNDHai基因的核酸分子還可用于將該基因引入優(yōu)選的宿主細胞，尤其是染色體上?？赏ㄟ^使用本領域公知的任何傳統(tǒng)方法，例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合交配或電穿孔，在考慮宿主細胞和核酸分子性質(zhì)的情況下，將此類核酸分子轉(zhuǎn)移至優(yōu)選的宿主中。
[0062]用本領域公知的方法，本發(fā)明提供的L-山梨糖酮脫氫酶基因/核苷酸序列可被連接到合適的載體上，所述載體含有在宿主細胞中可操作的調(diào)控序列，例如，啟動子、核糖體結合位點和轉(zhuǎn)錄終止子，以產(chǎn)生表達載體。
[0063]為構建攜帶有表達載體的重組微生物，多種基因轉(zhuǎn)移方法，包括，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、接合交配或電穿孔都可以使用。用于構建重組細胞的方法可以選自分子生物學領域公知的方法。例如，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可用于Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas或Escherichia.轉(zhuǎn)導系統(tǒng)也可用于E.coli。接合交配系統(tǒng)可廣泛用于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，包括，例如，E.col1、P.putida和Gluconobacter。接合交配的一個例子公開于W089/06，668中。接合可發(fā)生于，例如，液體培養(yǎng)基中或固體表面上。用于SNDHai生產(chǎn)的受體的例子包括，例如，Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas 或 Escherichia 的微生物?？上蛴糜诮雍辖慌涞氖荏w中加入選擇性標記；例如，通常選擇對萘啶酸或利福平的抗性。天然的抗性也可使用，例如，可將對多粘菌素B的抗性用于多種Gluconobacter。
[0064]本發(fā)明提供了重 組的L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai)?？梢酝ㄟ^將本發(fā)明提供的L-山梨糖酮脫氫酶基因引入到上文所述的宿主細胞中，來增加L-山梨糖酮脫氫酶的產(chǎn)量。在一個方面，通過使用本發(fā)明的L-山梨糖酮脫氫酶基因，在選自由Gluconobacter、Acetobacter>Pseudomonas或Escherichia所構成的組的宿主細胞中，對L-山梨糖酮脫氫酶蛋白質(zhì)進行生產(chǎn)。
[0065]能表達由本發(fā)明的多核苷酸序列編碼的SNDHai的微生物可在有氧條件下被培養(yǎng)于補充有合適營養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。培養(yǎng)可以以分批、補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進行。培養(yǎng)期可根據(jù)，例如，用于表達目標多肽的宿主、pH、溫度和使用的營養(yǎng)培養(yǎng)基而變動，其優(yōu)選為:以分批或補料分批模式進行大約I至大約10天。培養(yǎng)可在，例如，大約4.0至大約9.0的pH下進行，優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0。用于進行培養(yǎng)的優(yōu)選的溫度范圍為大約13°C至大約36°C，優(yōu)選地，從大約18°C至大約33°C。通常，培養(yǎng)既可以含有下述營養(yǎng)物，例如，可吸收碳源(例如，甘油、D-甘露醇、D、山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選地，D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油)；以及可消化的氮源，例如，有機物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、烘焙酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液。多種無機物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，培養(yǎng)基通常含有無機鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。
[0066]應當理解，用包含由本發(fā)明的多核苷酸編碼的SNDHai的宿主，從底物來生產(chǎn)維生素C的方法是用生長中的細胞來進行的，即，細胞的比生長速率例如為至少0.02H-1。
[0067]本發(fā)明的一種實施方式是經(jīng)過分離的本文公開的核苷酸序列編碼的SNDHai用于生產(chǎn)維生素C的用途。為在培養(yǎng)之后從微生物中分離和純化出SNDHai，可從液體培養(yǎng)基中收獲微生物細胞,例如,通過離心或過濾?？蓪κ斋@的細胞進行洗滌,例如,用水、生理鹽水或具有適當PH的緩沖溶液?？蓪⑾催^的細胞懸浮于合適的緩沖溶液中，并使其裂解，這通過，例如均質(zhì)機、超聲波儀、French壓力儀來進行，或者通過用溶菌酶等去處理，以獲得破碎的細胞的溶液。可從不含細胞的提取液或破碎的細胞中對L-山梨糖酮脫氫酶進行分離和純化，優(yōu)選地，通過標準方法從膜的部分獲得，所述方法例如:超離心、用合適的去垢劑進行差異溶解(differential solubilization)、通過鹽或其它合適的試劑進行沉淀、透析、離子交換色譜、羥基磷灰石色譜、疏水色譜、尺寸排除色譜、親和色譜或結晶。當重組的L-山梨糖酮脫氫酶作為加上標簽(例如，His標簽)的多肽被生產(chǎn)時，可用親和樹脂，例如Nickel親和樹脂對其進行純化?？赏ㄟ^光度測量來監(jiān)測L-山梨糖酮的純化，通過使用，例如人工電子受體，例如，氯化硝基四氮唑藍(NBT)和吩嗪硫酸甲酯、2，6_ 二氯靛酚(DCIP)、鐵氰化物或細胞色素c來進行。
[0068]本發(fā)明提供了在本文所述的SNDHai的幫助下對L-抗壞血酸的生產(chǎn)。SNDHai的來源并不重要。該方法可利用，例如，天然就能表達活性SNDHai酶的微生物、從所述微生物中分離出來的本發(fā)明的核苷酸序列編碼的SNDHa1、上文所述的帶有本發(fā)明的SNDHai基因的重組生物，或者通過使用以膜部分形式存在的天然的和/或重組的SNDHa1、下文所述的作為生物催化劑以將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的可溶的酶或被固定的酶來進行。上述用于分離和純化SNDHai的方法可用于天然的以及重組的SNDHai。
[0069]可按照上文所述對用于從L-山梨糖酮產(chǎn)生L-抗壞血酸的重組生物進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述重組生物選自由攜帶有本發(fā)明的L-山梨糖酮脫氫酶基因的Gluconobacter、Acetobacter>Pseudomonas和Escherichia所構成的組?？稍谂c上文所述相同的條件下對重組微生物進行培養(yǎng)。如果被用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的重組生物不能將任何上述碳源轉(zhuǎn)化為L-山梨糖酮，那么必須向培養(yǎng)基中添加L-山梨糖酮，使其被用作為生產(chǎn)L-抗壞血酸的前體。反應時間可隨pH、溫度和將使用的反應混合物而變動，其優(yōu)選為大約I至大約10天，以分批或補料分批方式進行。
[0070]在一種實施方式中，重組或天然的(即，經(jīng)過分離的非重組的酶)本發(fā)明的SNDHai，可純化自上述培養(yǎng)基中，并可以以可溶的或被固定的酶的形式作為生物催化劑用于將L-山梨糖酮轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸，這可以以技術人員已知的任何工藝模式來進行，例如分批、補料分批、辦連續(xù)或連續(xù)模式。經(jīng)過純化的L-山梨糖酮脫氫酶可被，例如，以可溶形式，通過膜設備保留于反應容器中，或被固定于任何固體界面(例如，多孔的或聚合的基質(zhì))上的酶來使用。例如，該酶可與具有一個或多個功能基團的樹脂的膜、顆粒等直接結合，或者其可通過具有一個或多個功能基團的橋聯(lián)分子(例如，戊二醛)結合到樹脂上。使用可溶的、保留的或固定形式的經(jīng)過純化的酶的反應可以在需氧條件下發(fā)生于，例如，含有L-山梨糖酮和其它合適營養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基中。反應培養(yǎng)基可以含有，例如，無機鹽，例如，硫酸鎂、磷酸鉀和碳酸鈣。反應可在大約4.0至9.0的pH下進行，優(yōu)選在大約5.0至大約8.0的pH下。用于進行反應的優(yōu)選的溫度范圍為從大約13°C至大約36°C，優(yōu)選地，從大約18°C至大約33 °C。[0071 ] 可被用于本發(fā)明的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，DeutscheSammlund von Midroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) , Mascheroder WeglB,D-38124Braunschweig, Germany ；American Type Culture Collection(ATCC),P.0.Boxl549, Manassas, VA20108USA,于 2003 年 5 月 12 日；或，Culture CollectionDivision, NITE Biological Resource Center,2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu—shi,Chiba,292-0818, Japan (以前:Institue for Fermentation, Osaka (IFO),17-85,Juso-honmachi2-chome, Yodogawa-ku, 0saka532_8686, Japan)。保存到 IFO 的優(yōu)選的細菌的例子例如是 Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G.melanogenus) IF03293>Gluconobacteroxydans (以前被稱為 G.melanogenus) IF03292> Gluconobacter oxydans (以前被稱為G.rubiginosus) IF03244>Gluconobacter frateurii (以前被稱為 G.1ndustrius) IF03260>Gluconobacter cerinus IF03266、Gluconobacter oxydans IF03284 和 Acetobacter acetisubsp.0rleanus IF03259，上述這些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的 Acetobacter aceti subsp.xylinum IF013693 和 1977 年 12 月 8 日保藏的 Acetobacteraceti subsp.xy linum IF013773。菌株 Acetobacter sp.ATCC15164 也是優(yōu)選細菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans (以前被稱為G.melanogenus) N44-1是優(yōu)選細菌的另一個例子，其是菌株IF03293的衍生物，在Sugisawa et al.，Agric, Biol.Chem.54:1201-1209，1990中有所描述。
[0072]應當理解,上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名(basonym),其如 International Code of Nomenclature ofProkaryotes 所定義。
[0073]在另一個方面，本發(fā)明涉及以高產(chǎn)量生產(chǎn)L-抗壞血酸(維生素C)的新穎的方法，所述方法通過使用能將給定的碳源轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物的靜止細胞來實現(xiàn)。
[0074]使用不同的培養(yǎng)方法，直接對L-抗壞血酸進行的生產(chǎn)已被報道于多種微生物中。但是，此類方法的缺點是維生素C的低產(chǎn)量，因為產(chǎn)物具有不穩(wěn)定性。例如，使用已知能生產(chǎn)2-酮-L-古洛酸(gulonic acid) (2-KGA)和維生素C的微生物，通過微生物對維生素C進行的生產(chǎn)的產(chǎn)量會進一步受到相對高的對2-KGA的生產(chǎn)的限制，2-KGA更容易被所述微生物所合成，這會導致，例如，維生素C和2-KGA的濃度比小于0.1。因此，本發(fā)明的目的是改進對維生素C的微生物生產(chǎn)，以獲得較之現(xiàn)有技術中所述的方法更高的產(chǎn)量。
[0075]令人驚奇地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用能進行從底物到維生素C的直接轉(zhuǎn)化的微生物的靜止細胞來開展的方法， 能獲得更高產(chǎn)量的維生素C。
[0076]具體而言，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括:在包含微生物的靜止細胞的培養(yǎng)基中，將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。
[0077]用于上述使用微生物靜止細胞的方法的底物可以是能被轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的碳源，其可以容易地從D-葡萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮-D-葡萄糖酸鹽/酯，或2，5-二酮-葡萄糖酸鹽/酯。其它可能的底物可以是半乳糖。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，更優(yōu)選地，選自D-葡萄糖、D-山梨糖醇或L-山梨糖，以及最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇或L-山梨糖。在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，術語“底物”和“生產(chǎn)底物”在本文中可互換使用。
[0078]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，從底物向維生素C的轉(zhuǎn)化指:通過微生物來進行從底物產(chǎn)生維生素C的轉(zhuǎn)化，即，底物可被直接轉(zhuǎn)化為維生素C。在允許上文定義的從底物進行的此類轉(zhuǎn)化的條件下，對所述微生物進行培養(yǎng)。
[0079]針對使用微生物靜止細胞進行的上述方法，本文中使用的培養(yǎng)基可以是任何合適的用于生產(chǎn)維生素C的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是包含:例如，鹽、底物和某個pH的水性培養(yǎng)基。其中底物被轉(zhuǎn)化為維生素C的培養(yǎng)基還被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。
[0080]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，任何能進行從底物向維生素C的轉(zhuǎn)化的微生物都可使用，例如，酵母、藻類或細菌，它們可以作為野生型菌株、通過經(jīng)典誘變和選擇方法獲得的突變體菌株或者作為重組菌株存在。此類酵母的例子可以是，例如，Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Scyzosaccharomyces 或 Kluyveromyces。此類藻類的例子可以是，例如，Chlorella。此類細菌的例子可以是，例如，Gluconobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Cryptococcus、Pseudomonas (例如，Pseudomonas putida)和 Escherichia，例如 Escherichia coil。優(yōu)選的是 Gluconobacter或 Acetobacter aceti，例如，G.0xydans、G.cerinus、G.frateuri1、A.aceti subsp.xylinum或 A.aceti subsp.0rleanus。
[0081]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，可被用于本發(fā)明的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，Deutsche Sammlund von Midroorganismen undZellkulturen(DSMZ)，Mascheroder WeglB, D_38124Braunschweig，Germany ；AmericanType Culture Collection (ATCC)，P.0.Boxl549, Manassas，VA20108USA,于 2003 年5 月 12 日； 或，Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center，2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，Japan(以前:Institue forFermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi2_chome，Yodogawa-ku，0saka532_8686，Japan)。保存到IFO的優(yōu)選的細菌的例子例如是Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G.melanogenus) IF03293、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G.melanogenus)IF03292、Gluconobacter oxydans (以前被稱為 G.rubiginosus) IF03244、Gluconobacterfrateurii (以前被稱為 G.1ndustrius) IF03260、Gluconobacter cerinus IF03266、Gluconobacter oxydans IF03287 和 Acetobacter aceti subsp.0rleanus IF03259，上述這些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter acetisubsp.xy linum IF013693 和 1977 年 12 月 8 日保藏的 Acetobacter aceti subsp.xy IinumIF013773。菌株Acetobacter sp.ATCC15164也是優(yōu)選細菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株Gluconobacter oxydans (以前被稱為G.melanogenus) N44-1是優(yōu)選細菌的另一個例子，其是菌株 IF03293 的衍生物，在 Sugisawa et al.，Agric, Biol.Chem.54:1201-1209，1990 中有所描述。
[0082]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，應當理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬性的異名(synonym)或基原異名(basonym)，其如International Code of Nomenclature of Prokaryotes 所定義。本文中使用的對微生物的命名是 International Committee on systematics of Prokaryotes and the Bacteriologyand Applied Microbiology Division of the International Union of MicrobiologicalSocieties官方接受的(在優(yōu)先權申請的提交日期時)，并被其官方出版物InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)所公開。具體的參考文獻是 Urbance et al.，IJSEM (2001) vol51:1059-1070，以及 IJSEM (2001) vol51:1231-1233 上的修訂通知，其中描述了對作為Ketogulonicigenium vuIgare的G.0xydans DSM4025的分類學上的重新歸類。
[0083]本文中使用的靜止細胞指下述微生物的細胞，所述微生物例如是存活但不能活躍生長的，或者以低的比生長速率[P]生長的，例如，低于0.02h-1的生長速率，優(yōu)選地，低于
0.01h'顯示出上述生長速率的細胞被稱為“靜止細胞模式”。
[0084]如上所述使用微生物靜止細胞來進行的本發(fā)明的方法可以以不同的步驟或階段來進行:優(yōu)選地，在第一個步驟(也被稱為步驟(a)或生長階段)中，于能夠生長的條件下對微生物進行培養(yǎng)。該階段由條件的改變終止，其中，所述條件改變使得微生物的生長速率降低至靜止細胞產(chǎn)生，這也被稱為步驟(b)，接著是用(b)的靜止細胞從底物來生產(chǎn)維生素C，這也被稱為生產(chǎn)階段。
[0085]使用微生物靜止細胞的上述方法中進行的生長和生產(chǎn)階段可在同樣的容器中進行，即，僅有一個容器，或在兩個或更多的不同容器中進行，在兩個階段之間具有可選的分離步驟?？赏ㄟ^任何合適的手段從細胞中回收得到產(chǎn)生的維生素C?；厥找馕吨?，例如，產(chǎn)生的維生素C可從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離出來。可選地，由此產(chǎn)生的維生素C可被進一步加工。
[0086]就使用微生物靜止細胞進行上述方法的本發(fā)明的目的而言，術語“生長階段”、“生長(growing)步驟”、“生長(growth)步驟”和“生長時期”在本文中可互換使用。這同樣適用于“生產(chǎn)階段”、 “生產(chǎn)步驟”、“生產(chǎn)時期”。
[0087]進行本發(fā)明的使用微生物靜止細胞的上述方法的一種途徑可以是下述方法，其中:微生物生長于第一種容器(所謂的生長容器)中，它們作為靜止細胞的來源，細胞中的至少一部分被轉(zhuǎn)移到第二種容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。生產(chǎn)容器中的條件可以是:使得從生長容器中轉(zhuǎn)移出的細胞變?yōu)樯衔亩x的靜止細胞的條件。維生素C在第二種容器中產(chǎn)生，并從其中被回收。
[0088]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，在一個方面，生長步驟可在水性培養(yǎng)基中進行，即，補充有用于在需氧條件下生長的合適營養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以以，例如，分批、補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來進行。培養(yǎng)時間可以隨所用的細胞種類、pH、溫度、營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其可以為例如:以分批或補料分批模式進行時，10小時至大約10天之間，優(yōu)選為大約I天至大約10天之間，更優(yōu)選地，大約I至大約5天，取決于所述微生物。如果細胞以連續(xù)模式被培養(yǎng)，駐留時間可以例如為大約2至大約100小時，優(yōu)選地，大約2至大約50小時，取決于所述微生物。如果微生物選自細菌，培養(yǎng)可進行于大約3.0至大約9.0的pH下,優(yōu)選為大約4.0至大約9.0,更優(yōu)選地,大約4.0至大約8.0,進一步更優(yōu)選地，大約5.0至大約8.0。如果使用了藻類或酵母，培養(yǎng)可進行于低于大約7.0的pH下，優(yōu)選低于大約6.0,更優(yōu)選低于大約5.5,最優(yōu)選地,低于大約5.00使用細菌進行培養(yǎng)的合適的溫度范圍為，例如，從大約13°C至大約40°C，優(yōu)選地，從大約18°C至大約37°C，更優(yōu)選地，從大約13°C至大約36°C，最優(yōu)選地，從大約18°C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用于進行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以例如，大約15°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約20°C至大約450C，更優(yōu)選地，大約25°C至大約40°C，進一步更優(yōu)選地，大約25°C至大約38°C，最優(yōu)選地，大約30°C至大約38°C。用于進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基通?？梢院邢率鰻I養(yǎng)物，例如，可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，優(yōu)選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇和甘油；以及可消化的氮源，例如，有機物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培養(yǎng)基可以具有或不具有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。多種無機物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，培養(yǎng)基通常含有無機鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。
[0089]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，在生長階段中，比生長速率例如為至少0.021!'對于以分批、補料分批或半連續(xù)模式生長的細胞而言，生長速率取決于，例如，生長培養(yǎng)基的組成、pH、溫度等。通常，生長速率可以例如在大約0.05至大約0.2h-1的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，在大約0.06至大約0.15h-1的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0.07至大約0.13h-1的范圍內(nèi)。
[0090]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的另一個方面，靜止細胞可通過對個別微生物在作為生長容器的瓊脂平板上進行培養(yǎng)來提供，其中使用了基本上相同的條件，例如，如上所述的培養(yǎng)時間、pH、溫度、營養(yǎng)培養(yǎng)基,并添加有瓊脂。
[0091]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，如果生長和生產(chǎn)階段進行于兩種分離的容器中，那么來自生長階段的 細胞可被收獲或濃縮，并轉(zhuǎn)移至第二種容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。該容器可以含有補充有任何適用的生產(chǎn)底物(可通過細胞被轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸)的水性培養(yǎng)基。來自生長容器的細胞可通過任何合適的操作被收獲或濃縮，例如，離心、膜橫流(membrane crossflow)超濾或微濾、過濾、傾析、絮凝。由此獲得的細胞還可以以原始培養(yǎng)液的形式從生長容器轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器中，而不用被收獲、濃縮或洗滌，即，以細胞懸浮液的形式被轉(zhuǎn)移。在一種優(yōu)選的實施方式中，細胞以細胞懸浮液的形式從生長容器被轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器，在它們之間沒有任何洗滌或分離步驟。
[0092]因此，本適用微生物靜止細胞進行的上述方法的一種優(yōu)選的實施方式中，上文所述的本發(fā)明方法的步驟(a)和(C)不被任何洗滌和/或分離步驟分開。
[0093]在使用微生物靜止細胞進行的上述方法的方面，如果生長和生產(chǎn)階段進行于同樣的容器中，細胞可以生長于適當?shù)臈l件下，達到理想的細胞密度，接著用含有生產(chǎn)底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基來替換生長培養(yǎng)基。此類替換可以例如是，在從容器中收回或收獲上清液的同時，以與之相同的速度，將生產(chǎn)培養(yǎng)基補入到容器中。為將靜止細胞保留于容器中，可以使用用于細胞回收或駐留的操作，例如，細胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限于使用如下的方法:離心機、過濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚合基質(zhì)上的細胞固定。在轉(zhuǎn)移階段之后，容器被用于下述加工條件，在此條件下，細胞以如上定義的靜止細胞模式存在，生產(chǎn)底物能有效地轉(zhuǎn)化為維生素C。
[0094]在使用微生物的靜止細胞的上述方法的方面，用于生產(chǎn)步驟中的生產(chǎn)容器中水性培養(yǎng)基在下文中被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基，其可以僅含有將被轉(zhuǎn)化為L-抗壞血酸的生產(chǎn)底物，或可以含有，例如，額外的無機鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸鈣。生產(chǎn)培養(yǎng)基還可以含有可消化的氮源，例如有機物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液；以及無機物質(zhì)，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細胞被保持為上文定義的靜止細胞模式的濃度。培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生產(chǎn)步驟可以，例如以批次、補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進行。在補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式下，來自生長容器和生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩種細胞都可以以合適的補料速率被連續(xù)或間歇地補入到生產(chǎn)容器中?；蛘?，僅有生產(chǎn)培養(yǎng)基可被連續(xù)或間歇補入到生產(chǎn)容器中，而來自生長容器的細胞可被立刻轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器。來自生長容器的細胞可被用作為生產(chǎn)容器中的細胞懸浮液，或者可被用作為:例如，在任何固相(例如，多孔或聚合基質(zhì))上絮凝或固定的物質(zhì)。生長時期(被定義為從底物進入到生產(chǎn)容器中開始，到收獲含有維生素C的上清液,所謂的收獲流(harvest stream)之間的時期)，可根據(jù),例如,使用的細胞的濃度和種類、pH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變動，其優(yōu)選在大約2至大約100小時之間。pH和溫度可與生長步驟中的PH和溫度不同，但應與生長步驟中的基本上相同。
[0095]在使用微生物的靜止細胞的上述方法的一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)步驟可以以連續(xù)模式進行，這意味著，含有來自生長容器的細胞的第一種補料流和含有底物的第二種補料流被連續(xù)或間歇補入到生產(chǎn)容器中。第一種流可以僅含有從生長培養(yǎng)基中分離/分開的細胞，或直接來自生長步驟的細胞懸浮液，即，懸浮于生長培養(yǎng)基中的細胞，而沒有任何中間的細胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補料流可以包括生產(chǎn)步驟的操作所需要的所有其它補料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的生產(chǎn)培養(yǎng)基、用于稀釋的水以及用于控制pH的堿。
[0096]在使用微生物的靜止細胞的上述方法的方面，當兩種流都連續(xù)補料時，第一種流的補料速率與第二種流的補料速率之比可在大約0.01至大約10之間變動，優(yōu)選地，在大約
0.01至大約5之間變動，優(yōu)選地，在大約0.02至大約2之間變動。該比例取決于第一種和第二種流中各自的細胞和底物地濃度。
[0097]進行本發(fā)明的使用微生物靜止細胞的上述方法的另一種方式可以是:在生長容器中使用一定細胞密度 的靜止細胞的方法。通過技術人員已知的方法，于600nm處，細胞密度可作為吸收單位(光學密度)被測得。在一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)步驟中的細胞密度為至少大約10，更優(yōu)選地，大約10至大約200之間，進一步更優(yōu)選地，大約15至大約200之間，進一步更優(yōu)選地，大約15至大約120之間,最優(yōu)選地,大約20至大約120之間。
[0098]在使用微生物的靜止細胞的上述方法的方面，為在生產(chǎn)階段期間(例如，以連續(xù)或半連續(xù)模式進行的)，以想要的細胞密度將細胞保持于生產(chǎn)容器中，本領域內(nèi)已知的任何手段都可以使用，例如，通過離心、過濾、微濾的膜橫流超濾、傾析、絮凝進行的細胞再循環(huán)，通過膜設備進行的細胞駐留或細胞固定。此外，在生產(chǎn)步驟以連續(xù)或半連續(xù)模式進行的情況下，從生長容器中連續(xù)或間歇補入細胞，生產(chǎn)容器中的細胞密度可被保持于恒定的水平，例如，通過從生產(chǎn)容器中收獲一定量的細胞來進行，所述的量相應于從生長容器中補入的細胞的量。
[0099]在使用微生物靜止細胞的上述方法的方面，從生產(chǎn)容器中回收/收獲在所謂的收獲流中含有的產(chǎn)生出的維生素C。收獲流可以包括，例如，來自生產(chǎn)容器的不含細胞的或含有細胞的水溶液，其中含有通過生產(chǎn)容器中的靜止細胞從生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化得到的維生素C?？赏ㄟ^本領域內(nèi)已知的任何操作，將仍處于收獲流中的細胞與維生素C分開，例如，過濾、離心、傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或端點(deadend)過濾。在該細胞分離操作之后，收獲流中基本不含細胞。
[0100]在使用微生物靜止細胞的上述方法的方面，在一個方面，本發(fā)明的方法使得維生素C的產(chǎn)量為至少大約1.8g/l，優(yōu)選為至少大約2.5g/l，更優(yōu)選為至少大約4.0g/Ι，最優(yōu)選為至少大約5.7g/l。在一種實施方式中，由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn)量在大約1.8至大約600g/l的范圍內(nèi)。維生素C的產(chǎn)量指直接從生產(chǎn)容器中獲得的收獲流中(即包含維生素C的不含細胞的上清液中)的維生素C濃度。
[0101]在使用微生物靜止細胞的上述方法的方面，在本發(fā)明的一種實施方式中，使用重組微生物的靜止細胞,例如重組細菌,通過上述方法來生產(chǎn)維生素C。優(yōu)選地，重組細菌選自能在體內(nèi)表達作為活性形式的L-山梨糖酮脫氫酶的細菌,特別是Gluconobacter、Acetobacter、Pseudomonas 和 Escherichia 屬的細菌，最優(yōu)選地，來自 Gluconobacter>Acetobacter或E.coli的細菌。進一步更優(yōu)選地是,例如，G.0xydans和E.coli,最優(yōu)選地，選自由 G.0xydans N44_1、G.0xydans IF03293 和 G.0xydans IF03244 所構成的組。重組微生物可以是下述任何微生物:已用公知技術對其進行了遺傳改造，以在其染色體上或在質(zhì)粒上含有一種或多種想要的引入到所述微生物中的基因，使得(例如)所述基因過量表達。引入到所述微生物中的想要的基因可以編碼，例如，從底物到維生素C的轉(zhuǎn)化中涉及到的酶。在一種優(yōu)選的實施方式中，想要的基因編碼L-山梨糖酮脫氫酶，其催化L-山梨糖酮向維生素C的轉(zhuǎn)化。一種用于本發(fā)明的優(yōu)選的L-山梨糖酮脫氫酶是，例如，SEQ ID NO:2所示的G.0xydans N44-1 的 L-山梨糖酮脫氫酶(SNDHai) (Sugisawa et al.,Agric.Biol.Chem.54:1201-1209，1990)，編碼所述SNDHai的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述SNDHai的功能性衍生物可被用于本發(fā)明的目的。應當理解，較之SEQ ID NO:1，具有至少80 %，優(yōu)選至少90%同源性，并編碼能催化L-山梨糖酮向維生素C的轉(zhuǎn)化的酶的核苷酸序列也是本發(fā)明的一部分。
[0102]重組微生物，例如G.0xydans N44-1，可以包含克隆于合適的質(zhì)粒上或整合進其染色體的SNDHai的若干拷貝。適合用于本發(fā)明的質(zhì)?？截惱缭诿總€被轉(zhuǎn)化的微生物中大約2個至大約15個的范圍內(nèi)，優(yōu)選在大約5個至大約10個的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^，例如，將SDS-PAGE上可見的各條條帶的亮度相比較來確定質(zhì)粒拷貝數(shù)。
[0103]在使用微生物靜 止細胞的上述方法的方面，當使用用于本發(fā)明方法的重組微生物時，生長和生產(chǎn)步驟可與上文所述基本相同。如果使用了包含SNDHai的重組微生物，例如，具有增加的SNDHai劑量的重組G.0xydans N44-1，生長培養(yǎng)基可以含有，例如，單獨的D-山梨糖醇、L-山梨糖、甘油或D-葡萄糖或它們的混合物，一種或多種合適的氮源和鹽。生長培養(yǎng)基可以含有，例如，D-山梨糖醇和/或L-山梨糖和鹽?？苫景凑毡疚乃鰜磉M行維生素C的收獲。
[0104]在另一個方面，本發(fā)明的方法可與下述其它步驟組合，所述步驟用于將維生素C與收獲流中含有的其它組分進行進一步分離和/或純化，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可以包括技術人員已知的任何手段，例如，濃縮、結晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進一步純化，這是通過下述操作手段來進行的，例如，用活性炭進行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結晶、過濾和干燥。特別地，將維生素C與收獲流中其它組分的第一次分離可通過下述方法地任何合適的組合或重復來進行，所述方法為:兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析(two-orthree-compartment electrodialysis),兩極膜電滲析,反滲透或吸附，其進行于，例如，離子交換樹脂或非離子樹脂上。如果獲得的維生素C的形式為L-抗壞血酸的鹽，將該鹽形式轉(zhuǎn)化為游離酸形式可通過，例如，兩極膜電滲析、離子交換、模擬移動床色譜技術等來進行。上述步驟的組合，例如，將電滲析和兩極膜電滲析組合為一個步驟也可使用，上述步驟，例如，多個使用模擬移動床色譜方法的離子交換步驟的組合也可以使用。上述流程中的任何一種單獨或互相的組合就構成了用于分離和純化產(chǎn)物，即維生素C的方便的手段。由此獲得的產(chǎn)物還可被進一步分離(通過下述方法，例如，通過濃縮、結晶、沉淀、對晶體的洗滌和干燥來進行)和/或進一步純化(用活性炭處理，離子交換和/或重結晶)。
[0105]在一種優(yōu)選的實施方式中，通過上述一系列下游加工步驟來從收獲流中純化維生素C，而不必要在該過程中的任何時刻將其轉(zhuǎn)移到非水性溶液中，即，所有步驟都在水性環(huán)境中進行。此類優(yōu)選的下游加工流程可以包括，例如，通過兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析對來自生產(chǎn)容器的收獲流進行濃縮，通過兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存在的維生素C轉(zhuǎn)化為其酸的形式，通過用活性炭進行處理、離子交換或非離子樹脂來進行純化，接著進行進一步的濃縮步驟和結晶。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹脂對其進行處理，并對其進行重結晶。然后可對上述晶體進行分離、洗滌和干燥。
[0106]下述實施例進一步地闡述了本發(fā)明，但其并不欲以任何方式對本發(fā)明加以限制。
[0107]實施例1用鈍化的SNDHai來牛產(chǎn)L-杭壞血酸
[0108]L 鈍化 SNDHai
[0109]將通過補料分批培養(yǎng)(關于培養(yǎng)，見實施例3)的能生產(chǎn)SNDHai的微生物細胞懸浮于25ml磷酸緩沖液(20mM，pH7.0)中，所述緩沖液中含有2mM的MgCl2UmM 二硫蘇糖醇(DTT)和2-3片不含EDTA的蛋白酶抑制劑藥片(Roche Diagnostics GmbH)。用FrenchPressure cell對細胞懸浮液進行三次處理。隨后，加入25ml磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2UM NaCl)，對懸浮液進行超離心(30，OOOrpm, 60分鐘，4°C )。用磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2、500mM NaCl)對含有膜部分的沉淀進行洗滌，然后將其懸浮于適當量的磷酸緩沖液(20mM，pH7.0，其中含有2mM的MgCl2)中。然后加入N-辛基葡糖苷(Fluka)，至終濃度為2% (w/v)，在冰上輕微攪拌下將懸浮液培養(yǎng)90分鐘。離心(20，000rpm，60*#，4°C )后，收集澄清的、略帶紅色的上清液，加入終濃度為15% (w/v)的聚乙二醇6000 (Fluka)。在4°C輕微振蕩下培養(yǎng)60分鐘后，接著進行離心(10，OOOrpm, 30分鐘，4°C )，將沉淀溶解于Tris-HCl緩沖液(20mM, ρΗ7.6，含有2mM的MgCl2和0.5% (w/v)月桂基磺基甜菜堿)中。在4°C輕微振蕩下過夜后，對溶液進行離心(20，000rpm，30分鐘，4°C )。收集上清液，按照下述方法對其進行進一步純化。
[0110]下述純化步驟進行于4 °C,其在Akta Explorerios-系統(tǒng)(AmershamBiosciences)上進行，其中使用軟件UNIC0RN3.1。用于離子交換色譜的典型流速在l_2ml/分鐘的范圍內(nèi)。在280nm處對蛋白質(zhì)洗脫進行監(jiān)測，用標準的光度檢測，在純化的所有階段(見下文)對SNDHai活性部分進行測定，或?qū)兓糠诌M行產(chǎn)物檢測。
[0111]用20mM Tris-HCl緩沖液(ρΗ7.6，含有2mM的MgCl2和0.5% (w/v)月桂基磺基甜菜堿)，在S^hadex G25-凝膠過濾柱(空體積:2.5ml)上，對澄清的上清液IV進行脫鹽，所述上清液以2.5ml為一份。
[0112] 收集SNDHai陽性部分，將其中一份(大約IOml)置于強陰離子交換柱(例如，Mono-Q HR, Amersham Biosciences,柱體積:8ml)上，所述柱在使用之前已用緩沖液AKlOmM TrisUOmM BisTrisUOmMMES,2mM MgCl2^0.5%月桂基磺基甜菜堿，ρΗ7.6)平衡過。用100%的緩沖液Al來洗脫未結合的蛋白質(zhì)，四份柱體積之后，應用在6份柱體積內(nèi)變化至Ij 100%緩沖液 BI (Tris, IOmM ；BisTris, IOmM ；MES, IOmM ;MgCl2，2mM和月桂基磺基甜菜堿，0.5%,pH4.7)的線性pH梯度，接著是8份柱體積的100%緩沖液BI。在大約6.5的pH值(其非常接近于從氨基酸序列計算出的6.52的pi值)洗脫出了 SNDHai。收集活性部分，用等量的HEPES-緩沖液(50mM，pH8.0，其中含有2mM MgCl2和0.5%月桂基磺基甜菜堿，終體積為15-20ml)進行稀釋,將其用于另一強陰離子交換柱(例如，Mono-Q HR, AmershamBiosciences,柱體積:1ml)，其已經(jīng)過了緩沖液 A2(15mM HEPES, 2mM MgCl2,0.5%月桂基磺基甜菜堿，PH7.6)的平衡。用100%的緩沖液A2來洗脫未結合的蛋白質(zhì)，四份柱體積之后，應用在20份柱體積內(nèi)變化到40%緩沖液B2(HEPES，15mM ；MgCl2,2mM ；LiCl, IM和月桂基磺基甜菜堿，0.5%，pH7.6)的線性鹽梯度，接著是至100%緩沖液B2的階梯度(stepgradient)。SNDHai在大約150mM LiCl處洗脫出?；钚圆糠衷赟DS凝膠電泳上顯示為大約85kDa的單條帶。
[0113]2.用于SNDHai的光度檢測
[0114]用于對SNDHai活性進行光度測量的反應混合物由0.196mM氯化硝基四氮唑藍(NBT)、0.137mM吩嗪硫酸甲酯(PMS) ,20.4mM L-山梨糖酮和處于終體積為1.0ml的0.1M的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)中的酶溶液構成。所述反應從加入酶開始，在具有Ι-cm光路的比色皿中，于570nm處，對作為NBT還原速率的酶活性進行測量(T = 25V )。酶活性的一個單位被定義為:每分鐘催化I μ M NBT還原的酶的量。ρΗ7.5處NBT的的消光系數(shù)被取為IOOmT1Cm'兩種參照比色皿被用于活性測定:其中一種含有除了 L-山梨糖酮之外的上述成分，另一種含有除了酶溶液之外的所有成分。
[0115]3.用于SNDHai的產(chǎn)物檢測
[0116]用下述組合物(0.5ml的總體積)的檢測，針對從L-山梨糖酮對L-抗壞血酸的生產(chǎn)，直接對含有純的SNDHai的部分(見上)進行分析，所述組合物包括:0.14mg/ml的純化并脫鹽的SNDHa1、50mM磷酸緩沖液(pH6.5)、8mg/ml牛血清清蛋白(BSA)、IOOmM L-山梨糖酮、ImMPMS、5mM CaCl2、50 μ M PQQ-K2。檢測于25°C，充分振蕩下(臺上振蕩器上，900rpm)，沒有光的情況下，在合適的反應試管中進行。
[0117]用具有與Aminex-HPX_78H(300x7.8mm)柱(Biorad, Reinach, Switzerland)相連的 LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck, Darmstadt, Germany)的AgilentllOOHPLC 系統(tǒng)(Agilent Technologies, Wilmington, USA),通過高效液相色譜(HPLC)對樣品進行分析。流動相為0.004M硫酸，流速為0.6ml/分鐘。用UV探測器(波長254nm)結合折射率探 測器來記錄兩種信號。此外，用氨基柱(YMC-Pack Polyamine-1I，YMC, Inc., Kyoto, Japan)和254nm處的UV探測來進行對L-抗壞血酸的鑒定。流動相為50mM NH4H2PO4和乙腈(40: 60)。在這些條件下，典型的初始定體積L-抗壞血酸產(chǎn)率為
0.5-1.0g/1/h。因此，I小時的反應時間之后，上清液中L-抗壞血酸的濃度為300至930mg/L.[0118]實施例2在試管和瓶中發(fā)酵從L-山梨糖和D-山梨糖醇來生產(chǎn)L-抗壞血 酸
[0119]將G.0xydans N44-1的細胞用于接種4ml N0.3BD液體培養(yǎng)基，并在220rpm振蕩下，于30°C在試管(18mm直徑)中對其進行培養(yǎng)3天。在培養(yǎng)時期的末尾，收集到20mg/l的L-抗壞血酸。
[0120]在200rpm振蕩下，30°C時，在500ml帶擋板搖瓶中的50ml N0.5培養(yǎng)基中，對菌株N44-1的細胞(重復三份)進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/l MgSO4.7H20和15g/L的CaCO30 72小時的培養(yǎng)后，在三個瓶中通過HPLC檢測到的L-抗壞血酸的量為400、500和680mg/l。
[0121]實施例3在補料分批發(fā)酵中從D-山梨糖醇來生產(chǎn)L-抗壞血酸
[0122]在180rpm振蕩下，30°C時，在2_1帶擋板搖瓶中的200ml N0.5培養(yǎng)基中，對G.0xydans N44-1的細胞進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有100g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/I 酵母提取物(Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland)、2.5g/l MgSO4.7H20 和 15g/L 的CaCO30 48小時后，用150ml該培養(yǎng)物去接種101的生物反應器(B.Braun ED10,Melsungen,Germany),所述反應器中已裝有5.31的培養(yǎng)基(含有20g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、15g/I 酵母提取物(Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland)和 2.5g/l MgSO4.7H20)，并裝備有溫度、PH和溶解氧傳感器和控制線圈。溫度被控制為30°C，通過加入28%氨溶液將pH控制為6.0,氣流為4.51/分鐘,通過攪拌速度(最小300rpm)級聯(lián)將溶解氧控制為30%。6小時的反應時間后，以25g/h的速率，在44小時的時段內(nèi)，補加入500g/l的山梨糖醇溶液。96小時的反應時間后，上清液中留有1%的底物，并已產(chǎn)生了 950mg/l的L-抗壞血酸。
[0123]實施例4在細胞膜部分中從L-山梨糖酮或L-山梨糖來生產(chǎn)L-抗壞血酸
[0124]在500ml帶擋板瓶中100mL N0.3BD液體培養(yǎng)基中，220rpm的振蕩下，于30°C對G.0xydans N44-1的細胞進行3天的培養(yǎng)。在500rpm對得到的培養(yǎng)物進行離心，以去除CaC03。然后在5，OOOrpm對來自該步驟的上清液進行離心，以使細胞沉淀。將收集的細胞懸浮于3ml的50mM磷酸鉀緩沖液(ρΗ7.0)中，通過在900ps1.兩次經(jīng)過French Pressurecell (SIM-AMINCO Spetronic Instruments, USA)來使細胞破碎。先在 5，OOOrpm 下對得到的均勻混合物進行離心，以去除細胞殘骸。然后，將上清液稀釋為最終的蛋白質(zhì)濃度為3mg蛋白質(zhì)/ml。將該經(jīng)過稀釋的樣品稱為不含細胞的提取物(CFE)。在100，OOOxg對CFE進行60分鐘的離心。棄去上清液，收集沉淀，作為膜部分。
[0125]在220rpm振蕩下，于30°C，在50mM磷酸鉀緩沖液(ρΗ7.0)中，用膜部分(100 μ I)來進行15小時的反應(200 μ I)。待測底物為L-山梨糖酮(1%終濃度)和L-山梨糖(2%終濃度)。用于反應的最終蛋白質(zhì)濃度為1.5mg/ml。在培養(yǎng)時期的末尾，從1% L-山梨糖酮和2% L-山梨糖分別產(chǎn)生了 680mg/l和10mg/l的L-抗壞血酸。
[0126]實施例 5 從 Gluconobacter oxydans N44-1 中分離 SNDHai 基因
[0127]L Tn5 誘奪
[0128]通過下述接合交配方法，將質(zhì)粒pSUP2021 (含有Τη5的“自殺性”載體(Simon R.etal.1983.B10/TECHN0L0GY1:784-791))從 E.coli HBlOl 中轉(zhuǎn)移至 G.0xydans N44-1 中。于30°C在含有5ml MB液體培養(yǎng)基的試管中對G.0xydans N44-1進行過夜的培養(yǎng)。于37°C，在含有5mlLB培養(yǎng)基(具有50 μ g/ml卡納霉素)的試管中，對攜帶有助手質(zhì)粒(helperplasmid)pRK2013(D.H.Figurski, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,76，1648-1652，1979)的E.coli HBlOl和攜帶有質(zhì)粒pSUP2021的E.coli HB101進行過夜培養(yǎng)。通過離心，從過夜培養(yǎng)物中分別收集 G.0xydans N44-1、Ε.coli HBlOl (pRK2013)和 E.coli HBlOl (pSUP2021)的細胞，并將它們懸浮于原始體積的MB培養(yǎng)基中。然后將這些細胞懸浮液等體積混合，將混合物涂布到置于MB瓊脂平板頂端的0.45 μ m硝酸纖維素膜上。在27°C培養(yǎng)一天之后，從膜上刮下細胞，在MB培養(yǎng)基中制備稀釋液。然后將經(jīng)過稀釋的細胞涂布于含有IOyg/ml多粘菌素B和50 μ g/ml卡納霉素的MB瓊脂培養(yǎng)基(MPK培養(yǎng)基)上。多粘菌素B針對E.coli供體和助手菌株進行選擇，而卡納霉素則選出已經(jīng)經(jīng)過質(zhì)粒PSUP2021轉(zhuǎn)化的那些G.0xydans細胞(即,轉(zhuǎn)化接合子)。獲得了大約30，000個轉(zhuǎn)化接合子。
[0129]2.篩詵L-杭壞血酸非牛產(chǎn)者
[0130]用滅菌牙簽將總共3，760個轉(zhuǎn)化接合子轉(zhuǎn)移到MPK格網(wǎng)平板(grid plate)上，并在27°C培養(yǎng)3天。為對從L-山梨糖酮到L-抗壞血酸的生產(chǎn)進行檢測，用滅菌牙簽從格網(wǎng)平板上挑出每個轉(zhuǎn)化接合子的細胞，將其懸浮于96孔微滴定板中的50 μ I靜止細胞反應混合物(含有0.5% L-山梨糖酮、0.3% NaCl和1% CaCO3)中。在30°C，沒有振蕩的情況下，對微滴定板進行一天的培養(yǎng)。得到的反應混合物中每種取I微升，用抗壞血酸試驗條帶(teststrip)和 RQFlex2 儀器(Merck KGaA, 6427IDarmstadt, Germany)針對L-抗壞血酸的形成對其進行分析。陽性對照菌株是在相同條件下生長的G.0xydans N44-1。通過該方法，鑒定出了 L-抗壞血酸非生產(chǎn)突變體N44-1-6A9。然后進行Southern印記雜交分析，以驗證突變體N44-1-6A9 的染色體 DNA 中 Tn5 的存在。用 Apa1、Cla1、EcoR1、EcoRV、Kpn1、Stu1、BamH1、Sail或HindIII對2 μ g從突變體中分離出的染色體DNA進行消化，并對其進行瓊脂糖凝膠電泳(0.8%瓊脂糖)。然后用0.25N HCl對凝膠進行15分鐘的處理，接著中0.5N NaOH處理 30 分鐘。用快速向下轉(zhuǎn)移系統(tǒng) TurboBlotter (Schleicher&Schuell GmbH, Germany)將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用質(zhì)粒pSUP2021作為模板，使用引物Tn2419 (SEQ ID NO:3)和Tn3125R(SEQ ID NO:4)，用 PCR-DIG 標記試劑盒(Roche Diagnostics GmbH, 68298Mannheim,Germany)來制備探針。獲得了 707bp的PCR產(chǎn)物。
[0131]所用的雜交條件如下所示:雜交在嚴謹雜交條件下進行，例如，在具有100μ g/ml鮭魚精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics)中，用地高辛(DIG)標記過的DNA探針(使用 DIG 標記系統(tǒng)制備的；Roche Diagnostics GmbH, 68298Mannheim, Germany)于 42°C進行2小時至4天的培養(yǎng)，接著在室溫下2xSSC和0.1% SDS中對過濾器進行15分鐘的洗滌(進行兩次)，然后在65°C，于0.5xSSC和0.1 % SDS或0.1xSSC和0.1 % SDS中再洗15分鐘(進行兩次)。
[0132]雜交步驟之后，用STORM儀器(Amersham Biosciences),用抗DIG-AP接合物(conjugate) (Roche Diagnostics GmbH, 68298Mannheim, Germany)和 ECF 底物(AmershamBiocsiences Uppsala, Sweden)來進行對雜交的探測。所有操作都按照廠商說明書來進行。
[0133]用上述方法，驗證了突變體N44-1-6A9染色體中Tn5的存在。
[0134]3.克隆被Τη5打斷的DNA片段，并對鄰近區(qū)域進行測序
[0135]基于上節(jié)2中所述的限制性酶消化的結果，選用Apa1、Cla1、EcoRI和EcoRV作為能產(chǎn)生下述DNA片段的酶，所述DNA片段具有超過Ikb的、在Τη5插入兩端的側(cè)翼染色體DNA。用SalI (其在Τη5的大約中間處進行切割)和ApaI對突變體Ν44-1-6Α9的DNA進行雙消化，給出了兩條能與上述707bp的探針進行雜交的片段(6.2和3.8kb)。
[0136]制備Tn5突變體G.0xydans N44_1_6A9的染色體DNA,用ApaI進行消化。從瓊脂糖凝膠中分離出大 小為9至12kb的DNA片段，將其與預先用ApaI消化過的克隆載體pBluescript II KS+ (Stratagene, Switzerland)連接。然后將連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli細胞,在含有50 μ g/ml卡納霉素和100 μ g/ml氨芐青霉素的L-瓊脂平板上進行選擇。從一個轉(zhuǎn)化子中提取出質(zhì)粒，對側(cè)翼于Tn5插入的克隆區(qū)域進行測序。移去9bp的重復(已知在Tn5轉(zhuǎn)座事件期間發(fā)生)后，組合出了單個開放讀碼框(被Τη5插入打斷)的核苷酸序列。完整開放讀碼框的核苷酸序列，在下文中被稱為Gluconobacter oxydans N44-1的SNDHai基因，其由2367bp構成，被示為SEQ ID NO:1。從SEQ ID NO:1的核苷酸序列推斷出的相應的氨基酸序列在本文中被示為SEQ ID NO:2。
[0137]在數(shù)據(jù)庫PRO Sff-SwissProt (完整釋放版本，加上了增加的更新)上，對SNDHai基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:I)進行Blast2搜索(來自National Center forBiotechnology Information [NCBI]的 BLAST 的版本 2,在 Altschul et al.(Nucleic AcidsRes.25:3389-3402,1997)中有所描述)。所使用的條件為:帶缺口比對，以及對于低復雜度區(qū)域過濾掉查詢序列。
[0138]用程序M0TIFS，很容易鑒定出細菌的醌蛋白脫氫酶特征序列，這表明，SNDHai具有PQQ依賴型酶的特征。
[0139]實施#il 6 )(寸倉g從L-山梨糖SM牛.產(chǎn)L-抗.壞血酸的細Iif講Southern印?Ρ,分木斤
[0140]從Gluconobacter oxydans IF03293、IF03292、IF03244、IF03287, Gluconobacterfrateurii IF03260 和 IF03265,Gluconobacter cerinus IF03266 和 IF03269, Acetobacteraceti subsp.0rleanus IF03259, Acetobacter aceti subsp.xylinum IF013693 和IF013773, Acetobacter sp.ATCC15164和Escherichia coli K-12 的細胞來制備染色體DNA。在含有5g/l細菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/L葡萄糖、5g/L甘露醇、Ig/L MgSO4.7H20、5ml/L乙醇和15g/L瓊脂的N0.350培養(yǎng)基上，于27°C對菌株IF013693和IF013773進行3天的培養(yǎng)。在含有25g/l甘露醇、5g/l酵母提取物(Difco Laboratories,Detroit, Mich.，USA)、3g/l細菌蛋白胨(Difco)和18g/l瓊脂(Difco)的甘露醇培養(yǎng)基(MB)瓊脂培養(yǎng)基上,于27°C對所有其它的Acetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株進行3天的培養(yǎng)。E.coli K-12被培養(yǎng)于Luria Broth瓊脂培養(yǎng)基上。染色體DNA制備物被用于在實施例5所述的嚴謹條件下進行Southern印記雜交。用ClaI (當分析N-結構域區(qū)域時)或EcoRI (當分析C-結構域區(qū)域時)對染色體DNA制備物進行消化，通過瓊脂糖凝膠電泳(I %瓊脂糖)分離出I μ g的DNA片段。用0.25N的HCl對凝膠進行15分鐘的處理，然后用0.5N NaOH進行30分鐘的處理,然后將其按照廠商說明書用Vacuum BlotterModel785 (BIO-RAD Laboratories AG, Switzerland)印到尼龍膜上。使用表2中所述的引物組，用PCR-DIG標記試劑盒(Roche Diagnostics)來制備探針。PCR產(chǎn)物Pl對應于SNDHai的被稱為N-結構域的區(qū)域(可能的跨膜區(qū)域)，而PCR產(chǎn)物P2則對應于SNDHai的被稱為C-結構域的區(qū)域(可能的主要脫氫酶區(qū)域)。
[0141]表2.用于PCR以產(chǎn)生用于Southern雜交的經(jīng)過標記的探針的引物
[0142]
【權利要求】
1.一種經(jīng)過分離的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子是可從編碼具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽的多核苷酸獲得的，所述多核苷酸分子包含SEQ ID NO:1的至少20個連續(xù)核苷酸的部分核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其中，SEQIDNO:1的部分核苷酸序列具有至少50個連續(xù)核苷酸。
3.如權利要求1所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其中，SEQIDNO:1的部分核苷酸序列具有至少100個連續(xù)核苷酸。
4.如權利要求3所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其中，所述部分核苷酸序列可從下述多核苷酸序列獲得，當對至少100個連續(xù)核苷酸進行比較時，所述多核苷酸序列與SEQ IDNO:1具有至少60%的同源性。
5.如權利要求1至4中任意一項所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，所述部分核苷酸序列可從與SEQ ID NO:1具有至少80%的同源性的多核苷酸序列獲得。
6.如權利要求1至5中任意一項所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，所述部分核苷酸序列可從與SEQ ID NO:1具有至少90%的同源性的多核苷酸序列獲得。
7.如權利要求1至6中任意一項所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子,其選自由SEQNOs:1、11、13、15、17、19、21 和 26 所構成的組。
8.如權利要求1所述的經(jīng)過分離的多核苷酸分子，其中所述部分核苷酸序列選自由SEQ IDNOs:5、6、7、8、9、10、23 和 24 所構成的組。
9.一種多肽，所述多肽由前述權利要求中任意一項所述的多核苷酸編碼。
10.如權利要求9所述的多肽，其包含選自由SEQID NO:2、12、14、16、18、20、22和27所構成的組的至少25個連續(xù)氨基酸的部分氨基酸序列。
11.如權利要求9或10所述的多肽，其中，所述部分氨基酸序列具有至少35個連續(xù)氨基酸。
12.—種重組DNA分子，所述分子用于表達具有L-山梨糖酮脫氫酶活性的多肽，所述重組DNA分子包含如權利要求1至7中任意一項所述的多核苷酸。
13.一種表達載體，其中包含如權利要求12所述的重組DNA分子。
14.一種重組生物，其已被如權利要求12所述的重組DNA和/或權利要求13的表達載體所轉(zhuǎn)化。
15.如權利要求14所述的重組生物，其中，所述重組DNA至少部分整合進了染色體。
16.如權利要求14或15所述的重組生物，其選自由真菌、植物、動物和細菌細胞所構成的組。
17.如權利要求16所述的重組生物，其中所述生物是選自由Gluconobacter、Acetobacter> Pseudomonas 和 Escherichia 所構成的組的屬的細菌。
18.一種用于從選自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物來生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述方法包括: (a)在合適的培養(yǎng)基中繁殖如權利要求14至17中任意一項所述的重組生物，以及 (b)從所述培養(yǎng)基中回收和分離L-抗壞血酸。
19.一種用于從選自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物來生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述方法包括:(a)在合適的培養(yǎng)基中繁殖編碼如權利要求9中所述的多肽的非重組生物，以及 (b)從所述培養(yǎng)基中回收和分離L-抗壞血酸。
20.一種用于生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述方法包括:將選自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物與權利要求9的經(jīng)過分離的多肽接觸。
21.一種用于從選自D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮的底物來生產(chǎn)L-抗壞血酸的方法，所述方法包括: (a)在合適的培養(yǎng)基中繁殖如權利要求14至17中任意一項所述的重組生物或編碼如權利要求9中所述的多肽的非重組生物， (b)分離和純化L-山梨糖酮脫氫酶， (c)在存在(b)的L-山梨糖酮脫氫酶的情況下，對底物進行溫育；以及 (d)從反應混合物中回收及分離L-抗壞血酸。
22.—種用于生產(chǎn)L-山梨糖酮脫氫酶的方法，其中，在合適的培養(yǎng)基中繁殖包含如權利要求I至7中任意一項所述的多核苷酸的重組生物，對細胞進行破碎，以及對L-山梨糖酮脫氫酶進行分離。
23.一種用于生 產(chǎn)L-山梨糖酮脫氫酶的方法，其中，在合適的培養(yǎng)基中繁殖包含如權利要求I至7中任意一項所述的多核苷酸的非重組生物，對細胞進行破碎，以及對L-山梨糖酮脫氫酶進行分離。
24.一種用于生產(chǎn)維生素C的方法，所述方法包括:在包含微生物靜止細胞的培養(yǎng)基中，將底物轉(zhuǎn)化為維生素C。
25.如權利要求25所述的方法，包括如下步驟: (a)在能進行生長的條件下培養(yǎng)所述微生物， (b)改變所述條件，使得所述微生物的生長速率降低，導致靜止細胞產(chǎn)生；以及 (c)用(b)的靜止細胞從底物生產(chǎn)維生素C。
26.如權利要求25所述的方法，其中步驟(a)和(c)進行于2個或多個分離的容器中。
27.如權利要求25所述的方法，其中步驟(a)和(c)不被任何洗滌和/或分離步驟分開。
28.如權利要求24至27中任意一項所述的方法，其中以分批、補料分批、連續(xù)或半連續(xù)方式對所述微生物進行培養(yǎng)。
29.如權利要求25所述的方法，其中，步驟(c)以分批、補料分批、連續(xù)或半連續(xù)方式進行。
30.如權利要求24至29中任意一項所述的方法，其中，作為600nm處的OD來測量的培養(yǎng)基中靜止細胞的密度為至少10。
31.如權利要求24至30中任意一項所述的方法，其中，產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn)量為至少1.8g/l。
32.如權利要求24至31中任意一項所述的方法，其中，所述微生物選自由酵母、藻類和細菌所構成的組。
33.如權利要求24至32中任意一項所述的方法，其中，所述微生物選自由Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、ScyzosaccharomycesΛ Kluyveromyces、Chlorella、Gluconobacter、Acetobacter acet1、Pantoea、Cryptococcus、PseudomonasΛ 和Escherichia所構成的組。
34.如權利要求24至33中任意一項所述的方法，其中，所述底物選自由D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮-D-葡萄糖酸鹽/酯和2，5- 二酮-葡萄糖酸鹽/酯所構成的組。
35.如權利要求24至34中任意一項所述的方法，其中，使用能從底物生產(chǎn)維生素C和2-酮-L-古洛酸的微生物，并且其中，維生素C和2-KGA濃度之間的比例大于0.1。
36.如權利要求18至21或24至35中任意一項所述的方法，進一步包括:從所述培養(yǎng)基中分離出維生素C，以及可選地，一個或多個純化步驟。
37.如權利要求36所述的方法，其中所有純化步驟都在水性環(huán)境中進行。
38.如權利要求18至21或24至37中任意一項所述的方法，進一步包括:利用電滲析從所述培養(yǎng)基組分中分離出維生素C。
【文檔編號】C12N9/04GK104004776SQ201410171433
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2004年8月16日 優(yōu)先權日:2003年8月14日
【發(fā)明者】阿蘭·貝利, 康妮·李, 安妮·弗朗索瓦·邁耶, 新城雅子 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權資產(chǎn)管理有限公司