基于環(huán)介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于環(huán)介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法，屬于食品和飲料中植物源性成分的定性檢測技術，具體地說是用環(huán)介導等溫擴增技術檢測食品和飲料中胡蘿卜成分的試劑盒及方法。試劑盒包括10×Bstbuffer、dNTP、硫酸鎂、甜菜堿、上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物、上游環(huán)引物、下游環(huán)引物、BstDNA聚合酶、顯色劑和陽性對照；其中10×Bstbuffer中含有三羥基甲基氨基甲烷、氯化鉀、硫酸銨、硫酸鎂和曲拉通X-100；胡蘿卜成分的環(huán)介導等溫擴增檢測方法包括食品和飲料DNA的提取、胡蘿卜成分的環(huán)介導等溫擴增和結果判定。本發(fā)明的試劑盒快速、特異性強、操作簡便、重復性好，方法靈敏度很高，可檢測含量低至0.001%的胡蘿卜成分。
【專利說明】基于環(huán)介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒及其檢測方法，屬于利用核酸擴增技術進行植物源性成分快速檢測的【技術領域】。
【背景技術】
[0002]全球經(jīng)濟一體化和貿(mào)易國際化的的不斷擴大，對于發(fā)展中的中國，是機遇也是挑戰(zhàn)。目前，我國已成為世界上第五大農(nóng)產(chǎn)品出口國，農(nóng)產(chǎn)品進出口貿(mào)易持續(xù)增長。美國、歐盟、日本等發(fā)達國家和地區(qū)為了維護本國的經(jīng)濟利益，爭奪國際市場，竭力通過名目繁多的檢驗項目和嚴格甚至苛刻的技術標準，對進口農(nóng)產(chǎn)品設置貿(mào)易障礙，導致我國農(nóng)產(chǎn)品出口增長遭受較大壓力。就進出口的農(nóng)產(chǎn)品而言，合格的產(chǎn)品，不僅要無毒無害，滿足安全衛(wèi)生要求；而且要無攙雜攙假，滿足品質要求。其中品質合格，又主要包含兩方面的含義:1.原料來源與標簽一致。2.組分含量與標簽一致。歐盟自2006年I月I日起開始實施新的食品衛(wèi)生法規(guī)，新法規(guī)突出了食品生產(chǎn)過程中的可追溯管理與食品的可追溯性，強調(diào)食品的身份鑒定標識與健康標識。我國國家標準GB 7718-94《食品標簽通用標準》和國家出入境檢驗檢疫局發(fā)布的《進出口食品標簽管理辦法》，也明確提出食品標簽標注內(nèi)容應與食品相符。為此，國家質檢總局專門發(fā)文，要求嚴厲打擊制假制劣的違法行為，對假冒偽劣產(chǎn)品要依法沒收并監(jiān)督銷毀，追查生產(chǎn)源頭和去向，嚴防流入消費環(huán)節(jié)。
[0003]在食品和飲料的生產(chǎn)與銷售中，產(chǎn)品無標簽或標簽不規(guī)范，利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費者謀取暴利的事件，國內(nèi)、國外均屢屢發(fā)生。各種原料被加工成食品和飲料成品后，已無法從外觀 對其組成進行鑒定。生產(chǎn)者受利益驅動，擅自改變產(chǎn)品組成，或摻入價廉的替代品，或直接減少原料用量，導致產(chǎn)品的真實屬性與標簽不符。這種造假行為不僅僅涉及經(jīng)濟、營養(yǎng)價值，更直接影響著消費者的健康，可能引發(fā)食源性過敏反應。
[0004]胡蘿卜是一種質脆味美的家常蔬菜，素有“小人參”之稱，其富含糖類、脂肪、揮發(fā)油、胡蘿卜素、維生素A、維生素B1、維生素B2、花青素、鈣、鐵等多種營養(yǎng)成分，常作為食品配料用于制作各種糕點、面食和飲料。胡蘿卜雖營養(yǎng)豐富，但同時也是一種常見的食物過敏原。有文獻報道，胡蘿卜、蘋果、大豆、榛子、獼猴桃、小麥是柏林人最常見的食物過敏原。瑞士專家報道，大約25%的食物過敏者會對胡蘿卜產(chǎn)生過敏反應?！秮嗊\食品安全食品過敏原標識標注》地方技術規(guī)范已于2009年頒布實施，規(guī)范列出可導致過敏反應的食品名單，要求含有名單上過敏原的亞運食品必須如實標注，胡蘿卜位列其中。鑒于此，盡快建立可靠有效的胡蘿卜成分檢測方法，確保食物標簽真實準確，對于減少食源性過敏反應發(fā)生，加強食品過敏原標識管理，改進食品安全，保護消費者利益具有重要意義。
[0005]食品中植物源性成分檢測，常采用蛋白檢測和DNA檢測的方法。兩類方法，對于不同產(chǎn)品中植物源性成分的檢出和定量檢測，各有優(yōu)、缺點。以DNA為測試對象的方法與以蛋白為測試對象的方法相比，在產(chǎn)品成分復雜的情況下，目標DNA可以有效提取，受產(chǎn)品基質的影響較??；此外，DNA比較穩(wěn)定，不象蛋白質組成那樣易受加工工藝的影響。當前，基于DNA的檢測方法中，常用的有聚合酶鏈式反應(常規(guī)PCR和實時熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質熱循環(huán)儀，而且因為溫度循環(huán)導致耗時較長。其他新開發(fā)的核酸擴增方法，比如 NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)>3SR (self-sustainedsequence replication)^SDA(strand displacement amplification)等，在擴增循環(huán)方面，都有各自的創(chuàng)新點。NASBA和3SR使用一系列轉錄和反轉錄過程來循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內(nèi)切酶和修飾過的模板來循環(huán)擴增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測并擴增小于10個拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點。技術要求、材料儀器要求、技術本身特異性缺陷等方面嚴重束縛了這些技術的推廣應用。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification,簡稱LAMP)技術則在這些方面有所突破。LAMP有比較高的特異性和抗干擾能力，只有當2對引物與目的片段的六個區(qū)域都匹配上時才能進行擴增。非目的片段對LAMP反應的干擾比較小，這方面比常規(guī)的PCR要強。LAMP的反應體系比較穩(wěn)定可靠，在室溫下放置2周后仍然穩(wěn)定并且對于樣品中原有或污染的無關、干擾片段仍然不敏感。同時LAMP的敏感性也比較高，可以以單拷貝的基因為模板進行擴增。LAMP反應的過程簡單快速而且高效，能夠在Ih內(nèi)將單拷貝的基因模板擴增到IO9-1Oltl個拷貝，如果在體系中增加2條環(huán)狀引物，還可使LAMP的反應時間縮短近一半，從而進一步提高檢測效率。LAMP擴增反應過程是在60-70°C的恒溫下進行的。這就擺脫了昂貴儀器的束縛，一個水浴鍋即可完成絕大多數(shù)檢測過程。其結果的檢測可使用濁度儀檢測沉淀濁度，也可通過使用染料，在日光下肉眼直接判定。因此，相比于其他基于DNA的檢測方法，LAMP方法更加簡便、快捷，是真正普及型的核酸檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種采用環(huán)節(jié)導等溫擴增技術檢測胡蘿卜成分的試劑盒和檢測方法，克服基于蛋白的檢測方法在某些食品和飲料檢測中的局限性，為胡蘿卜成分檢測提供有效工具，從而確保食品和飲料標簽的一致性，保護消費者利益。
[0007]本發(fā)明的主要原理為:設計6條特異引物，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在恒溫條件下不停地自我循環(huán)。LAMP擴增分兩個階段:第I階段為起始階段:任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補結構，自我堿基配對形成環(huán)狀結構。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結構。該結構是LAMP基因擴增循環(huán)的起始結構。第2階段是擴增循環(huán)階段:以莖環(huán)狀結構為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結合，開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結構。迅速以3 ’末端的BI區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結構的DNA。BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增，且產(chǎn)物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環(huán)狀引物LF和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結構結合啟動鏈置換合成，周而復始。該循環(huán)反應可使靶DNA累積到IO9-1Oltl拷貝。擴增結果通過熒光染料染色肉眼觀察。[0008]本發(fā)明涉及的胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒，其中包括的試劑如下:
(1)環(huán)介導等溫擴增反應液A
包括 IOXBst buffer 反應緩沖液、l-2mmol/L dNTP、5_7mmol/L硫酸鎂、0.8-lMmol/L上游內(nèi)引物、0.8-lMmol/L下游內(nèi)引物、0.1-0.2Mmol/L上游外引物、0.1-0.2Mmol/L下游外引物、0.4-0.6Mmol/L上游環(huán)引物、0.4-0.6Mmol/L下游環(huán)引物和0.7-0.9mol/L甜菜堿；
其中IOXBst buffer反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ；
其中上游內(nèi)引物的序列為:5’- AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC -3’ ；下游內(nèi)引物的序列為:5’_ GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACMTCGAAGTGCA -3’ ；上游外引物的序列為:5’_ GAAATTGGCCTCCCGTGC -3’ ；下游外引物的序列為:5’- GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；上游環(huán)引物的序列為:5’_ CGTCACCAGAGACTCATTTTTGA -3’ ；下游環(huán)引物的序列為:5’-GGCCCTTGGGCACAGCAAA -3，；
其中上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物、上游環(huán)引物、下游環(huán)引物體積比為:8:8:1:1:4:4 ；
(2)Bst DNA 聚合酶 B:8U/^L ;
(3)顯色劑C:熒光染料SYBR Green ；
(4)陽性對照D:胡 蘿卜基因組DNA，20ng/^L。
[0009]上面所述環(huán)介導等溫擴增反應液A,每管20μL的最佳組成為:10XBst buffer反應緩沖液 2.5PL、25mmol/L dNTPl.3μL、100mmol/L 硫酸鎂 1.5PL、5mol/L 甜菜堿 4μL、10Mmol/L上游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L下游內(nèi)引物2.4pL、10Mmol/L上游外引物0.3μL,10Mmol/L下游外引物0.3μL、10Mmol/L上游環(huán)引物1.2μL、10Mmol/L下游外引物1.2μL,ddH20 (滅菌雙蒸水)2.9PL。
[0010]使用上述引物，檢測產(chǎn)品中胡蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1) - (3):
(I)待檢樣品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取試劑盒。
[0011](2)胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增
A.在反應管中分別加入20μL環(huán)介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勾；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0012]擴增時，應設立2個對照:陽性對照(胡蘿卜基因組DNA作為模板)、空白對照(不含DNA模板，以水代替)。
[0013](3)顯色檢測
在待檢的每個反應管中加入WL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化。在陽性對照和空白對照都成立的情況下(即胡蘿卜DNA出現(xiàn)擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色變?yōu)榫G色；空白對照無擴增，加入顯色劑后，擴增反應液顏色為橙色)，如果樣品的反應管中擴增反應液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有胡蘿卜成分，如果顏色為橙色，則說明待檢樣品中不含有胡蘿卜成分。
[0014]本發(fā)明建立了胡蘿卜成分的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法。該發(fā)明具有特異性強、靈敏度高、操作簡便的特點。使用本試劑盒及檢測方法，可檢測含量低至0.001%的胡蘿卜DNA，其絕對檢測限為4.128pg ;而且與包括同屬傘形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香在內(nèi)的其他近緣物種及非近緣物種沒有交叉反應，特別適用于一些成分復雜的加工食品和飲料中胡蘿卜成分的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為用胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增檢測方法檢測同屬傘形科植物的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，常見蔬菜青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥以及常見食品花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA，上述樣品的顯色反應，圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)顯色結果。管2為空白對照(水)的顯色結果；管3-管19依次為孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉的顯色結果。
[0016]圖2為用胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增檢測方法檢測不同含量胡蘿卜成分DNA溶液的顯色反應。圖中管I為空白對照(水)的顯色結果。管2-管7依次為含10%、1%、0.1%、0.01%、
0.001%,0.0001%胡蘿卜成分DNA溶液的顯色結果。
[0017]圖3為用胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增檢測方法檢測米粉樣品DNA，樣品的顯色反應。圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)的顯色結果，管2為空白對照(水)的顯色結果，管3為米粉樣品的顯色結果。
[0018]圖4為胡蘿卜環(huán)介導等溫擴增檢測方法檢測面條樣品DNA，樣品的顯色反應。圖中管I為陽性對照(胡蘿卜DNA)顯色結果，管2為空白對照(水)的顯色結果，管3為面條樣品的顯色結果。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0020]實施例1
按照以下程序進行檢測:
(I)非胡蘿卜樣品DNA的提取
A.稱取0.1g樣品，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；1.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0021](2)非胡蘿卜樣品DNA的環(huán)介導等溫擴增:
A.在反應管中加入20μL環(huán)介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0022](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
管3-管19，即孜然、香芳\香菜、大茴香、小茴香、青椒、黃瓜、菜花、圓白菜、洋蔥、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋、豬肉、牛肉DNA均無擴增，反應液顏色為橙色；陽性對照管管I (胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色變?yōu)榫G色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，見圖1。
[0023]該組引物，經(jīng)在線BLAST的結果證實，具有很高的特異性，不會與其他物種發(fā)生交叉反應。胡蘿卜為傘形科植物，因此在特異性實驗中特別選擇同屬傘形科的孜然、香芹、香菜、大茴香、小茴香，以及其他常見食品青椒、黃瓜、花生、牛奶、大豆、小麥、雞蛋DNA等進行實驗。經(jīng)驗證，除胡蘿卜基因組DNA出現(xiàn)陽性擴增，反應液顏色變?yōu)榫G色外，其他物種均無擴增，反應液顏色為橙色，與預期相符，表明該組引物有良好的特異性，與上述物種沒有交叉反應。
[0024]實施例2
按照以下程序進行檢測:
(I)不同含量胡蘿卜樣品DNA的提取
A.將胡蘿卜和大豆，加入液氮，研磨成粉末狀后，各稱取0.1 g，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min;；
C.將胡蘿卜和大豆樣品的DNA抽提緩沖液按比例(10%,1%，0.1%，0.01%, 0.001%,
0.0001%)進行混合；
D.加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min，去上清，保留沉淀；
E.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
F.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
G將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
1.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
J.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0025](2)不同含量胡蘿卜樣品DNA的環(huán)介導等溫擴增:A.在反應管中加入20μL環(huán)介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0026](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
管2-管6，即胡蘿卜含量為10%、1%、0.1%、0.01%,0.001%的DNA樣品均出現(xiàn)陽性擴增，反應液顏色變?yōu)榫G色；空白對照管管I (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，見圖2。
[0027]胡蘿卜樣品取0.lg，提取得到的核酸濃度為103.2ng/yL。檢測中使用4yL，據(jù)此可粗略估計當DNA抽提緩沖液中的胡蘿卜成分含量為0.001%,胡蘿卜成分DNA總量為
4.128pg，即該方法的絕對檢測限為4.128pg。
[0028]實施例3
按照以下程序進行檢測:
(I)待測米粉樣品DNA的提取
A.稱取0.1g米粉，轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0029](2)待測米粉樣品DNA的環(huán)介導等溫擴增
A.在反應管中加入20μL環(huán)介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0030](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
樣品管管3反應液顏色變?yōu)榫G色，見圖3。陽性對照管管I (胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色變?yōu)榫G色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，結果均正常，據(jù)此可判定該樣品檢出胡蘿卜成分。
[0031]實施例4
按照以下程序進行檢測:(I)待測面條樣品DNA的提取
A.取面條適量，磨碎后，稱取0.1g轉至1.5mL離心管中。加入600μL預熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；
B.在管中加入等體積酚/氯仿600μL，上下顛倒充分混勻，抽提2min；
C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；
D.在沉淀中加入60μLRNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300μL緩沖液，上下顛倒混勻10次；
Ε.取出離心柱，將離心柱放置在I個2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；
F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入200μL洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
G.在離心柱中加入200μL70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復此步驟一次；
H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；
1.將離心柱放置在 一個新的1.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50μL洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作LAMP反應的模板。
[0032](2)待測面條樣品DNA的環(huán)介導等溫擴增
A.在反應管中加入20μL環(huán)介導等溫擴增反應液A、WLBst DNA聚合酶B和4μL待檢樣品DNA，混勻；
B.于恒溫水浴上63°C放置40min；
C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢。
[0033](3)加入顯色劑SYBR Green,顯色檢測
樣品管管3反應液顏色為橙色，見圖4。陽性對照管管I (以胡蘿卜基因組DNA作為反應模板)反應液顏色為綠色、空白對照管管2 (以水作為反應模板)反應液顏色為橙色，結果均正常，據(jù)此可判定該樣品未檢出胡蘿卜成分。
【權利要求】
1.一種基于環(huán)介導等溫擴增技術的胡蘿卜成分快速檢測試劑盒，其特征在于，其中的試劑包括(I) - (4): (1)環(huán)介導等溫擴增反應液A 包括 IOXBst buffer 反應緩沖液、l-2mmol/L dNTP、5_7mmol/L硫酸鎂、0.8_lMmol/L上游內(nèi)引物、0.8-lMmol/L下游內(nèi)引物、0.1-0.2Mmol/L上游外引物、0.1-0.2Mmol/L下游外引物、0.4-0.6Mmol/L上游環(huán)引物、0.4-0.6Mmol/L下游環(huán)引物和0.7-0.9mol/L甜菜堿； 其中IOXBst buffer反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和I %曲拉通X-100 ； 其中上游內(nèi)引物的序列為:5’-AACCACCGATGTCGCGATGCCTTTTGTGTGCGGTTGGC-3’ ；下游內(nèi)引物的序列為:5’ - GTCGTTGTGTATACCCGCCGCGGGTCACAATCGAAGTGCA-3’ ；上游外引物的序列為:5’ - GAAATTGGCCTCCCGTGC-3’ ；下游外引物的序列為:5’ -GCTTAAACTCAGCGGGTAGT-3’ ；上游環(huán)引物的序列為:5’ -CGTCACCAGAGACTCAITITTGA-3’ ；下游環(huán)引物的序列為:5’-GGCCCTTGGGCACAGCAAA-3’ ； 其中上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上游外引物、下游外引物、上游環(huán)引物、下游環(huán)引物體積比為:8:8:1:1:4:4 ；
(2)Bst DNA 聚 合酶 B:8U/^L ; (3)顯色劑C:熒光染料SYBR Green ； (4)陽性對照D:胡蘿卜基因組DNA，20ng/^L。
2.一種利用權利要求1所述的試劑盒檢測胡蘿卜成分的方法，其特征是依次包括下列步驟: (1)待檢樣品DNA的提?。? (2)胡蘿卜成分的環(huán)介導等溫擴增: A.在裝有20μL如權利要求1所述的環(huán)介導等溫擴增反應液A的反應管中加入WLBstDNA聚合酶B和4PL待檢樣品DNA，混勻； B.于恒溫水浴上63°C放置40min； C.將水浴調(diào)到85°C中止反應，5min后取出待檢； 擴增時，設立2個對照:陽性對照為胡蘿卜基因組DNA、空白對照為不含DNA模板的水； (3)顯色檢測 在待檢的每個反應管中加入WL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化。
3.如果樣品的擴增反應液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢樣品含有胡蘿卜成分；如果顏色為橙色，則說明待檢樣品不含有胡蘿卜成分。
【文檔編號】C12N15/11GK103993075SQ201410171512
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月26日 優(yōu)先權日:2014年4月26日
【發(fā)明者】孫敏, 高宏偉, 肖西志, 劉彩霞 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心