轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻g6h1及其衍生品種的定性pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，屬于轉(zhuǎn)基因水稻品種的定性檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開了用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的8對(duì)特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明進(jìn)一步公開了轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)試劑盒。特異性、靈敏度和檢出限實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1品種的定性PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢出限好，適于轉(zhuǎn)基因G6H1水稻及其衍生品種制品的定性檢測(cè)。
【專利說明】轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻品種的定性PCR檢測(cè)方法，尤其涉及轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)引物、定性檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，屬于轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1品種，是將密碼子經(jīng)過優(yōu)化的殺蟲基因HJC-1和抗草甘膦基因G6導(dǎo)入到栽培水稻品種“秀水110”而得到的，插入序列全長(zhǎng)約10.2kb(圖1)。HJC-1是一個(gè)CrylAb 和Vip3H的融合基因，這兩個(gè)基因的融合具有對(duì)鱗翅目害蟲更廣譜的殺蟲能力。G6是一個(gè)新的5-烯醇式丙酮酸3-磷酸合成酶基因(EPSPS)，它和其它抗草甘膦基因相似性低。溫室試驗(yàn)、中間試驗(yàn)和環(huán)境釋放試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)HJC-1和G6-EPSPS基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1的抗蟲和抗草甘膦能力良好。
[0003]PCR技術(shù)是目前國內(nèi)外檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中應(yīng)用最廣泛的方法。專利CN102162012B “轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)的定性PCR檢測(cè)方法”公開了轉(zhuǎn)基因水稻科豐6號(hào)的旁側(cè)序列的定性PCR檢測(cè)方法。但是，迄今為止，缺乏一種針對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的特異性強(qiáng)、靈敏度高的定性PCR檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)；
[0005]本發(fā)明的目的之二是提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法；
[0006]本發(fā)明的目的之三是提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)試劑盒。
[0007]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明根據(jù)G6H1水稻的插入序列設(shè)計(jì)引物，根據(jù)插入序列的5’端旁側(cè)序列(插入序列的5’端旁側(cè)序列為SEQ ID N0.18所示；其中，1-480位為水稻基因組序列，481-872位為外源序列)設(shè)計(jì)8條引物，根據(jù)插入序列的3’端旁側(cè)序列(插入序列的3’端旁側(cè)序列為SEQ ID N0.19所示；其中，1-518位為外源序列，519-831為水稻基因組序列)設(shè)計(jì)9條引物，分別將上述引物進(jìn)行配對(duì)，目標(biāo)序列長(zhǎng)度在100~400bp之間。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、1%和0.1%的G6H1水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻秀水110DNA為模板，應(yīng)用常規(guī)PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，對(duì)21對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出擴(kuò)增結(jié)果較好的8對(duì)特異性檢測(cè)引物，能夠應(yīng)用于定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種，所述8對(duì)特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)的具體序列如下:
[0009]弓丨物對(duì)1:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成；[0010]弓丨物對(duì)2:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成；
[0011]弓丨物對(duì)3:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成；
[0012]弓丨物對(duì)4:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成；
[0013]引物對(duì)5:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7的核苷酸序列組成；
[0014]弓丨物對(duì)6:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成；
[0015]弓丨物對(duì)7:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7的核苷酸序列組成；
[0016]弓丨物對(duì)8:由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.15的核苷酸序列組成。[0017]為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，本發(fā)明對(duì)上述8對(duì)引物檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)5以及由SEQID N0.1和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)7具有較高的檢測(cè)靈敏度(均可達(dá)到0.1%的檢測(cè)靈敏度)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于其它6對(duì)引物的檢測(cè)靈敏度；本發(fā)明以由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)5以及由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)7作為候選引物，進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化。結(jié)果表明，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)7在G6H1水稻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %時(shí)的擴(kuò)增效率高于由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)5。
[0018]由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，采用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示的引物對(duì)7作為引物定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種不僅具有更佳的檢測(cè)靈敏度，而且具有最好的擴(kuò)增效率；因此，本發(fā)明最優(yōu)選采用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示的引物對(duì)7作為引物定性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種。
[0019]本發(fā)明的目的之二是提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟:(I)提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA ；⑵以提取的DNA為模板，分別以引物對(duì)1-8為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出目的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出目的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
[0020]優(yōu)選的，一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟:(1)提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA; (2)以提取的DNA為模板，以SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.7所示核苷酸為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出290bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出290bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
[0021]本發(fā)明還提供了另一種較優(yōu)的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟:(I)提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA ；⑵以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7所示核苷酸為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出243bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出243bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
[0022]其中，所述的從待檢測(cè)水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、異硫氰酸胍法或鹽酸胍法等各種方法。[0023]PCR反應(yīng)體系中引物的終濃度以及退火溫度對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的特異性、靈敏度均有一定的影響；本發(fā)明優(yōu)化了 PCR反應(yīng)體系中引物終濃度以及退火溫度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)退火溫度為58°C，引物終濃度為0.4 μ mol/L，擴(kuò)增效率高，檢測(cè)結(jié)果的特異性最強(qiáng)，靈敏度最聞。
[0024]本發(fā)明中所述的PCR反應(yīng)體系可參考以下方法建立:
[0025]PCR反應(yīng)體系總體積為25.0 μ L，其中，10 XPCR緩沖液2.5 μ L，25mmol/L氯化鎂溶液 1.5 μ L, dNTPs 混合溶液(各 2.5mmol/L) 2.0 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L, 10 μ mol/L下游引物0.5 μ L，2.5U/yL Taq DNA聚合酶0.25 μ L, 25mg/L DNA模板2 μ L，余量為雙蒸水。
[0026]PCR反應(yīng)程序優(yōu)選為:94°C變性5min ;94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸60s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72°C延伸7min。
[0027]本發(fā)明的目的之三是提供一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)試劑盒，包括:10XPCR緩沖液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，檢測(cè)上下游引物對(duì)，Taq DNA聚合酶和雙蒸水；其中,所述檢測(cè)上下游引物對(duì)選自引物對(duì)1_8中的任意一對(duì)引物，優(yōu)選為引物對(duì)5或引物對(duì)7，更優(yōu)選為引物對(duì)7(由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì))。
[0028]對(duì)本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法進(jìn)行特異性測(cè)試，結(jié)果表明，僅從質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%和0.1%的G6H1水稻樣品中擴(kuò)增到預(yù)期DNA條帶，而在其它轉(zhuǎn)基因水稻混合物(科豐6號(hào)、科豐8號(hào)、克螟稻等)、轉(zhuǎn)基因玉米混合物(Btll、Btl76、M0N810等)、轉(zhuǎn)基因大豆混合物(356043,305423,CV127等)、轉(zhuǎn)基因棉花混合物(M0N1445、M0N531、M0N15985等)、轉(zhuǎn)基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1等)和非轉(zhuǎn)基因水稻中均未擴(kuò)增到預(yù)期大小的條帶，表明本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法具有高度特異性。
[0029]靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，在G6H1水稻質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%以上(含10%、5%、1%、
0.5%,0.1%)的樣品中均能穩(wěn)定擴(kuò)增到預(yù)期DNA片段，表明本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)到0.1 %。
[0030]模擬加工品測(cè)試結(jié)果表明，利用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法可從熟食產(chǎn)品中特異性地?cái)U(kuò)增到預(yù)期DNA片段，表明本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法適用于G6H1水稻及其衍生品種制品的定性PCR檢測(cè)。
[0031 ] 檢出限的測(cè)試結(jié)果表明，從20份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1 %的G6H1水稻樣品中均能穩(wěn)定檢測(cè)出預(yù)期DNA片段，表明本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法的檢出限為0.1 %。
[0032]本發(fā)明所涉及到的術(shù)語定義
[0033]除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0034]術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”意指在實(shí)驗(yàn)室里通過重組DNA技術(shù)人工插入其他物種基因以創(chuàng)造出擁有新特性的植物。
[0035]術(shù)語“密碼子”意指信使RNA鏈上決定一個(gè)氨基酸的相鄰的三個(gè)堿基叫做一個(gè)“密碼子”，亦稱三聯(lián)體密碼。
[0036]術(shù)語“引物”意指一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈。
[0037]術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”，簡(jiǎn)稱PCR，意指一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段，PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫(經(jīng)常是60°C左右)時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(72°C左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5’ -3’)的方向合成互補(bǔ)鏈。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1中插入基因結(jié)構(gòu)圖；
[0039]圖2為篩選出的8對(duì)特異性檢測(cè)引物的PCR電泳圖；
[0040]圖3為靈敏度測(cè)試篩選出的2對(duì)特異性檢測(cè)引物(即:引物對(duì)5和引物對(duì)7)的PCR電泳圖；
[0041]圖4為由SE Q ID N0.1和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)7作為引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)程序和體系優(yōu)化；
[0042]圖5為由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7組成的引物對(duì)5作為引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)程序和體系優(yōu)化；
[0043]圖6為轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法的特異性測(cè)試；
[0044]圖7為轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)試；
[0045]圖8為轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法用于G6H1水稻加工產(chǎn)品測(cè)試；
[0046]圖9為轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法檢出限的測(cè)試；1_20為20份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的G6H1水稻樣品，每個(gè)樣品3次平行PCR反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0048]實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法的引物篩選及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0049]1、引物設(shè)計(jì)和篩選
[0050]根據(jù)G6H1水稻的插入序列(圖1)設(shè)計(jì)引物，根據(jù)插入序列的5’端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)8條引物，根據(jù)插入序列的3’端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)9條引物，分別將上述引物進(jìn)行配對(duì)，目標(biāo)序列長(zhǎng)度在100~400bp之間，引物序列見表1。
[0051]表1設(shè)計(jì)引物信息表
【權(quán)利要求】
1.用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)，其特征在于，選自以下8對(duì)引物中的任意一對(duì): 引物對(duì)1:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成； 引物對(duì)2:由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成； 引物對(duì)3:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.6的核苷酸序列組成； 引物對(duì)4:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成； 引物對(duì)5:由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.7的核苷酸序列組成； 引物對(duì)6:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.5的核苷酸序列組成； 引物對(duì)7:由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.7的核苷酸序列組成； 引物對(duì)8:由SE Q ID N0.10和SEQ ID N0.15的核苷酸序列組成。
2.權(quán)利要求1所述的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種中應(yīng)用。
3.—種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:⑴提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA ；⑵以提取的DNA為模板，以權(quán)利要求I所述的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出目的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出目的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
4.一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA； (2)以提取的DNA為模板，以SEQID N0.1和SEQ ID N0.7所示核苷酸為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出243bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出243bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
5.一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:⑴提取待檢測(cè)水稻樣品的DNA ；⑵以提取的DNA為模板，以SEQID N0.4和SEQ ID N0.7所示核苷酸為擴(kuò)增上下游引物建立PCR擴(kuò)增體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)如果從待檢測(cè)的樣品中擴(kuò)增出290bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種；如果從待檢測(cè)的樣品中未能擴(kuò)增出290bp的條帶，則待檢測(cè)的水稻樣品不是轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1或其衍生品種。
6.按照權(quán)利要求3-6任何一項(xiàng)所述的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)體系總體積為25.0 μ L，其中，10XPCR緩沖液2.5 μ L，25mmol/L氯化鎂溶液1.5 μ L，dNTPs 混合溶液 2.0yL, 10 μ mol/L 上游引物 0.5 μ L, 10 μ mol/L 下游引物 0.5 μ L,2.5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L，25mg/L DNA 模板 2 μ L，余量為雙蒸水。
7.按照權(quán)利要求3-6任何一項(xiàng)所述的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，其反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性5min ;94°C變性30s，54_60°C退火45s，72°C延伸60s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72°C延伸7min。
8.按照權(quán)利要求7所述的定性PCR檢測(cè)方法，其特征在于，其反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性5min ;94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸60s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72°C延伸7min。
9.一種轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑水稻G6H1及其衍生品種的定性PCR檢測(cè)試劑盒，包括:10 XPCR緩沖液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，檢測(cè)上下游引物對(duì)，Taq DNA聚合酶和雙蒸水；其特征在于:所述檢測(cè)上下游引物為權(quán)利要求1所述的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)。
10.按照權(quán)利要求9所述的定性PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述的特異性PCR檢測(cè)引物對(duì)為權(quán)利要求1所述的引物對(duì)5或引物對(duì)7。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103923999SQ201410172522
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】徐俊鋒, 汪小福, 陳笑蕓, 沈志誠, 劉慧
申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院