一種鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶的基因、其干擾基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因，其干擾基因及其應(yīng)用。鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因具有SEQ?ID?NO：1所示的序列特征。其干擾基因正義鏈具有SEQ?ID?NO：4所示的序列，反義鏈具有SEQ?ID?NO：5所示的序列。本發(fā)明還公開了二氫葉酸還原酶(OfDHFR)基因及其干擾RNA序列用于害蟲防治的用途。
【專利說明】—種鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶的基因、其干擾基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及鱗翅目昆蟲亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因、其干擾基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guen6e)屬于鱗翅目螟蛾科，以玉米、棉花、谷子、高粱等為食，每年造成玉米的減產(chǎn)量可達總產(chǎn)量的10% -30%，而且在我國分布區(qū)域跨度大，是我國重要的農(nóng)業(yè)害蟲。由于其鉆蛀特性，防治困難，目前尚沒有特效的化學(xué)農(nóng)藥。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象,小干擾RNA被認為是一種快捷、高效的調(diào)控體內(nèi)基因表達的方法。以害蟲關(guān)鍵生理功能基因為生物分子靶標，通過干擾其活性達到抑 制生長發(fā)育和殺蟲目的，具有顯著的商業(yè)價值和應(yīng)用前景。
[0003]二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR, ECl.5.1.3)是細胞內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，它在輔酶NADPH的參與下，催化底物二氫葉酸還原為四氫葉酸(tetrahydrofolate, THF)。THF可以作為一碳單位的傳遞體。而一碳單位是生物體新陳代謝過程中含有一個碳原子的基團，例如甲基、羥甲基等，其主要生理功能是作為嘌呤和嘧啶的合成原料，是氨基酸和核苷酸聯(lián)系的紐帶。除此之外，THF還可參與到在胸苷酸合酶(TS)的催化下，脫氧尿苷一磷酸(dUMP)轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀找涣姿?dTMP)的生物合成中，這是dTMP從頭生物合成的唯一路徑，dTMP是DNA合成所必須的前體物質(zhì)，而DNA的合成又與細胞復(fù)制密切相關(guān)。由于昆蟲不能自身合成THF，必須要從外界獲得葉酸再轉(zhuǎn)化為DHF，進而由DHFR催化合成THF，所以DHFR對于昆蟲生長發(fā)育起著極其重要的作用，通過對其功能的干擾和抑制可實現(xiàn)害蟲防治的目標。
[0004]經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，尚未有將DHFR基因及其干擾RNA用于害蟲防治的應(yīng)用或報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種全新的亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)的基因核苷酸序列，以及OfDHFR基因的干擾RNA分子在亞洲玉米螟防控中的用途。
[0006]本發(fā)明公開了一種亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因，其核苷酸序列為SEQID NO:1 所示。
[0007]本發(fā)明公開了一種亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0008]本發(fā)明還公開了所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因干擾RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。根據(jù)亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶OfDHFR基因序列設(shè)計合成的dsRNA，其核苷酸序列包括正義鏈序列為SEQ ID NO:4，反義鏈為SEQ ID NO:5。可以特異性的沉默亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶的基因的mRNA的表達，有效控制玉米螟成蟲產(chǎn)卵，減少幼蟲數(shù)量，從而減輕下代玉米螟危害，有效控制蟲害。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1:從亞洲玉米螟幼蟲中提取的總RNA的凝膠電泳圖
[0010]圖2 =PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖
[0011]圖3:3 ’ RACE的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖
[0012]圖4:5 ’ RACE的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖
[0013]圖 5:利用 OfDHFR-Fl/OFDHFR-Rl 和 OfDHFR-FI/0FDHFR-R2 引物擴增的 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳圖
[0014]圖6:利用RNA1-DNA-F/RNA1-DNA-R弓丨物擴增的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖
[0015]圖7: dsRNA的凝膠電泳圖
[0016]圖8 =RNA干擾后雌蟲OfDHFR的表達情況
[0017]圖9 =RNA干擾后雌蟲的產(chǎn)卵情況【具體實施方式】
[0018]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0019]亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)由中國科學(xué)院植物保護研究所贈與。
[0020]下述實施例中涉及到的使用試劑盒的實驗操作，均按照試劑盒說明書進行操作。
[0021]實施例1
[0022]亞洲玉米螟二氫葉酸還原酶(OfDHFR)基因的獲得
[0023]一.亞洲玉米螟幼蟲的總RNA提取
[0024]使用RNAiso plus (Code N0.D9108A)對亞洲玉米螟(幼蟲)進行總RNA提取，獲得其總RNA。
[0025]取Iul上述亞洲玉米螟總RNA進行I %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1，RNA樣品的結(jié)果清晰，符合質(zhì)量要求適合進行下一步實驗。
[0026]二.RT-PCR
[0027]以亞洲玉米螟總RNA為模板，進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。
[0028]1.引物設(shè)計和合成
[0029]設(shè)計并合成引物:
[0030]OfDHFR-1-F:GCNGCNGCNTGYGAYAAYATGGG(SEQ ID NO:6)
[0031]OfDHFR-1-R:ATRTTNGGRAARAANGTRTCRCA(SEQ ID NO:7)
[0032]0fDHFR-2-F:GTNATHATGGGNMGTCGNACNTGG (SEQ ID NO:8)
[0033]0fDHFR-2-R:GANGAGCCNCCDATNACCCA(SEQ ID NO:9)
[0034]2.反轉(zhuǎn)錄
[0035]使用TakaRa PrimeScript ? RT-PCR Kit (Co de N0.DRO14A)進行反轉(zhuǎn)錄實驗。
[0036]反應(yīng)體系:
【權(quán)利要求】
1.一種鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.如權(quán)利要求1所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.如權(quán)利要求1所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因的干擾RNA序列，其正義鏈具有SEQ ID NO:4所示的序列，反義鏈具有SEQ ID NO:5所示的序列。
4.如權(quán)利要求3所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因干擾RNA序列的模板DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
5.如權(quán)利要求1所述鱗翅目昆蟲二氫葉酸還原酶基因及權(quán)利要求3所述的干擾RNA序列在綠色農(nóng)藥開發(fā)和 害蟲防治中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/06GK103923931SQ201410172992
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月25日
【發(fā)明者】楊君, 夏悅昕, 白敬, 屈明博, 劉田, 姜秀萍, 楊青 申請人:大連理工大學(xué)