一株雞源耐鉛乳酸菌對(duì)體內(nèi)鉛的吸附的制作方法
【專利摘要】本研究利用已經(jīng)篩選獲得的雞源耐鉛乳酸菌進(jìn)行體內(nèi)鉛的吸附，可以減少通過(guò)飲水或飲食進(jìn)入動(dòng)物及人體內(nèi)的重金屬鉛，不僅可以吸附進(jìn)入消化系統(tǒng)未被機(jī)體吸收的鉛，而且可以提高機(jī)體排鉛的能力，減少鉛在體內(nèi)的積累，降低對(duì)機(jī)體的危害。
【專利說(shuō)明】一株雞源耐鉛乳酸菌對(duì)體內(nèi)鉛的吸附
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及高效吸附鉛乳酸菌菌株的PCR鑒定及測(cè)序，該菌株發(fā)酵液的制備，動(dòng)物鉛中毒模型的建立，飼喂發(fā)酵液劑量的選擇，體內(nèi)鉛清除效率，各個(gè)組織測(cè)定鉛前樣品的制備，ICP-OES儀器的測(cè)定。
【背景技術(shù)】
[0002]利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)NCBI進(jìn)行同源性比對(duì)。
[0003]已經(jīng)測(cè)定顯示，分離篩選的乳酸菌體外鉛吸附效率為66.95%，可以在含鉛濃度為800mg/L的平板上生長(zhǎng)良好，測(cè)定其產(chǎn)酸效果、耐酸性、以及一些吸附條件的測(cè)定結(jié)果顯示該菌株適宜用于體內(nèi)清除鉛試驗(yàn)。
[0004]選擇抗病力和適應(yīng)能力強(qiáng)，成活率高、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)的雄性KM小鼠，建立動(dòng)物鉛中毒模型，造模成功后，選擇不同劑量的發(fā)酵液進(jìn)行鉛清除試驗(yàn)。
[0005]ICP-OES可以快速高效的測(cè)定痕量元素，靈敏度高，線性范圍寬，可以同時(shí)測(cè)定多種元素等特點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明已研究證明該菌 株的體外吸附率高，要解決的技術(shù)問(wèn)題是利用已經(jīng)分離篩選的雞源乳酸菌進(jìn)行吸附試驗(yàn)，減少重金屬在動(dòng)物甚至是人體內(nèi)的積累和吸收，降低重金屬鉛對(duì)人體的危害。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是對(duì)鉛耐性菌株進(jìn)行測(cè)序后在NCBI比對(duì)，制備鉛清除發(fā)酵液，建立小鼠鉛中毒模型，飼喂不同劑量的發(fā)酵液后確定最佳吸附劑量，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察記錄各組小鼠飲水總量、飼料利用情況、體重變化等。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各個(gè)組織樣品進(jìn)行消解并進(jìn)行鉛濃度的測(cè)定。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1是雞源耐鉛乳酸菌對(duì)小鼠體內(nèi)鉛的清除圖
[0009]I經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，制備1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，預(yù)期的擴(kuò)增片段大小為1500bp左右，用DNA純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化，并送上海生工生物科技公司對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)。
[0010]2.發(fā)酵液的制備
將已經(jīng)活化的菌種按1%的接種量至有50ml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在37°C、140r/min 振蕩培養(yǎng) 48h，濃度為 101Qcfu/ml。
[0011]3.試驗(yàn)動(dòng)物的選擇
KM小鼠抗病力和適應(yīng)能力很強(qiáng)，繁殖力和成活率高、耐粗飼、對(duì)環(huán)境適應(yīng)性好、價(jià)格相對(duì)便宜是藥理學(xué)、毒理學(xué)等研究領(lǐng)域以及藥品等首選的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究選擇50只健康KM小鼠，體重20±2g。[0012]4.動(dòng)物鉛中毒模型的建立
50只小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，I籠10只，飼喂常規(guī)飼料和飲用水，飼養(yǎng)一周使其適應(yīng)新的環(huán)境，實(shí)驗(yàn)組通過(guò)自由飲水的方式進(jìn)行染毒，染毒所用的Pb (Ac) 2濃度為300mg/l，對(duì)照組自由采食飲用水。
[0013]5.發(fā)酵液劑量的選擇
根據(jù)口服液給量標(biāo)準(zhǔn)，5.0Omg/kgBW、10.0Omg/kgBW、15mg/kgBff,分別經(jīng)口給予低、中、高三個(gè)劑量組0.1ml、0.2ml、0.3ml菌液。
[0014]6.體內(nèi)清除試驗(yàn)
每天早上9點(diǎn)，低、中、高三個(gè)劑量組分別進(jìn)行灌胃乳酸菌口服液，灌服劑量分別為
0.l、0.2、0.3ml。再給予足量的飼料自由攝食，對(duì)照組分為空白對(duì)照組和染鉛對(duì)照組，分別飼喂飲用水和一定濃度的醋酸鉛溶液。
[0015]7.血液樣品的處理
所有器皿用5%硝酸浸泡24h以上后，再先用蒸餾水沖洗，再用超純水沖洗后，晾干備用。然后取ImL全血于25mL的錐形瓶中，加入4mL硝酸,放置過(guò)夜后，緩慢加熱至微沸,加熱至近干有白色結(jié)晶，加入1ml超純水排酸，進(jìn)行兩次排酸，于1ml容量瓶中定容，同時(shí)做空白對(duì)照。
[0016]8.肝臟、腎臟、肌肉、骨骼等組織樣品的處理
稱取試樣0.lg-0.5g (精確到0.0001 g)于錐形瓶中，加1mL混合酸，加蓋浸泡過(guò)夜，電熱板上消解至透明的淡黃色，若變棕黑色，再加混合酸，直至冒白煙，消化液呈無(wú)色透明或略帶黃色，放冷，加入1ml超純水排酸2次，用水少量多次洗滌錐形瓶，洗液合并于容量瓶中并定容至10ml。
【權(quán)利要求】
1.分離篩選的耐鉛乳酸菌體外吸附效率高、具有一定的益生性，為了更好的利用該菌株減少重金屬鉛對(duì)動(dòng)物及人體危害，本研究利用該菌株清除中毒小鼠體內(nèi)的鉛。
2.方法如下: 步驟一:PCR測(cè)序 步驟二:清除鉛發(fā)酵液的制備及菌種的保存 步驟三:建立小鼠鉛中毒模型 步驟四:清除劑劑量的選擇 步驟五:樣品的采集和制備 步驟六=ICP-OES測(cè)定 分離篩選的耐鉛菌株為乳酸菌，NCBI比對(duì)結(jié)果顯不與faeciuni同源性為97%。
3.制備清除發(fā)酵液時(shí)按1%接種量于50mLMRS液體培養(yǎng)基中，140r/min搖床，37°C培養(yǎng)36h后菌體濃度為10nCFU/mL，于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.菌種于脫脂乳中保存于_80°C。
5.MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g,乙酸鈉5g,牛肉膏1g,酵母膏5g,磷酸氫二鉀2g,葡萄糖 20g, MgSO4.7H20 0.2g，MnSO4.H2O 0.25g，檸檬酸二銨 2g，吐溫 80 lmL，蒸餾水 100mL,pH6.5。
6.115°C滅菌 30min。
7.建立鉛中毒模型時(shí)，各組小鼠均為雄性，體重為20±0.2g，在相同的條件下，給予同劑量的飲用水和飼料飼喂一周，使其適應(yīng)新的環(huán)境。
8.造模組經(jīng)口給予300mg/L醋酸鉛溶液，空白組飲用相同劑量的飲用水，造模1d后測(cè)定血液及各組織中鉛濃度。
9.造模成功后血鉛濃度最高位7.0lmg/L,飼料和飲水中濃度僅為0.78ug/g和0.534mg/L,血鉛濃度顯著高于600ug/L。
10.此外，肝臟、腎臟、骨骼中鉛濃度較高。
11.造模成功后，每天早上9:00，造模組分別飼喂低、中、高劑量清除劑為0.1、0.2、0.3mL，對(duì)照組飼喂相同劑量的生理鹽水，全部飲用后給予足量的飲用水和飼料，飼喂40d后測(cè)定不同組織中鉛濃度。
12.血液、肝臟、腎臟、骨骼、肌肉清除效率分別為79.4%,78.5%,43.7%,47.9%,38.3%，血液、肝臟、腎臟、肌肉在中、低劑量時(shí)清除效率最高，由于骨骼鉛濃度最高，在高劑量時(shí)清除效率最聞。
13.組織樣品的制備，選擇濕法消解進(jìn)行樣品的制備，準(zhǔn)確稱取濕樣0.3000-0.4000g于50mL錐形瓶中，加入SmL硝酸(優(yōu)級(jí)純)和2mL高氯酸(優(yōu)級(jí)純)，放置過(guò)夜，然后調(diào)節(jié)電熱板溫度為120°C是樣品充分消解，不斷升高溫度至250°C使其微沸，直至樣品透明或淡黃色，剩余ImL后冷卻，加入1mL超純水排酸2次，定容至10mL。
14.1CP-OES測(cè)定鉛濃度，測(cè)定波長(zhǎng)為220.353nm ;等離子體冷卻氣流量:8.0L/min ;輔助氣體流速:0.2L/min ;霧化器流量:0.55L/min ;功率:1.30kff ;觀測(cè)高度:15 ;觀測(cè)方式:軸式。
15.方法檢出限為0.002mg/L，平均加標(biāo)回收率為100.4%，變異系數(shù)為1.64%。
16.血液中Ca、Fe、Mg、Zn等微量元素含量與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異，該菌株在清除體內(nèi)鉛的同時(shí)，對(duì)體內(nèi)必須微量元素的吸收沒(méi)有影響，對(duì)鉛具有特異性吸附。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104031986SQ201410173795
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】趙宏坤, 滿兆紅, 都啟晶 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)