檢測(cè)化妝品中常見致病菌的基因芯片和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測(cè)化妝品中致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中上述寡聚核苷酸探針包含從藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌的16S-23SrDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH基因、白色念珠菌和新生隱球菌的18S-28SrDNA間區(qū)中選取的DNA片段或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。本發(fā)明還提供利用上述基因芯片檢測(cè)化妝品中致病菌的試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片和試劑盒檢測(cè)化妝品中致病菌，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)化妝品中常見致病菌的基因芯片和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因芯片和檢測(cè)用試劑盒，尤其涉及檢測(cè)化妝品中常見致病菌的基因芯片和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]最近幾年以來(lái)，為了滿足消費(fèi)者的需求，化妝品生產(chǎn)商在提高功效和回歸大自然的同時(shí)，在化妝品中加入了來(lái)自植物、動(dòng)物中的營(yíng)養(yǎng)成分，另外化妝品中還含有氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、無(wú)機(jī)鹽和胎盤液等營(yíng)養(yǎng)成分，為細(xì)菌、真菌等各種致病菌的生長(zhǎng)、繁殖提供了足夠的營(yíng)養(yǎng)成分，因此化妝品特別容易受到微生物的污染。除此之外、PH 4-7也是微生物生長(zhǎng)最適宜的條件，另外，化妝品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存和日常使用過(guò)程中都是室溫放置，室溫也是微生滋生和繁殖的適宜溫度。微生物的生長(zhǎng)需要水分，它是決定微生物能否生長(zhǎng)和生長(zhǎng)快慢的重要因素。微生物細(xì)胞的主要成分就是碳源，微生物細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)的重要位置是氮源，另外微生物的生長(zhǎng)還需要礦物元素，包括鉀、磷、鈉、鎂、鐵等成分，另外微生物所需的生長(zhǎng)因子都是維生素類，在化妝品中含量豐富。因此化妝品里含的營(yíng)養(yǎng)為微生物生長(zhǎng)提供了一切條件，就是微生物生長(zhǎng)的搖床。
[0003]妝品中受到污染以后，會(huì)發(fā)生各種變質(zhì)現(xiàn)象，影響化妝品的質(zhì)量。微生物新陳代謝后分泌色素，比如霉菌代謝產(chǎn)生的色素，可以是化妝品變成黑色、黃色產(chǎn)生霉斑等各種顏色。另外微生物代謝有時(shí)產(chǎn)生的硫物質(zhì)，胺物質(zhì)等會(huì)發(fā)出酸臭味，使原本芬芳的氣味發(fā)出難聞的氣味。另外，微生物污染化妝品生長(zhǎng)過(guò)程中，分解蛋白質(zhì)、氨基酸、酶類等，是化妝品的理化結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，腐敗變質(zhì)不能使用。如果污染的微生物是致病菌，在使用的過(guò)程中，還會(huì)感染消費(fèi)者，嚴(yán)重危害身體健康。致病菌生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物和各種毒素，這些產(chǎn)物在人體免疫系統(tǒng)的識(shí)別下，可以變成刺激源和變應(yīng)原，使使用者產(chǎn)生過(guò)敏或者受到感染，引起各種各樣的皮膚病，比如膚色異常、接觸性和光感性皮炎，掉頭發(fā)，頭發(fā)粗糙，痤瘡等皮膚病。
[0004]根據(jù)文獻(xiàn)參考以及調(diào)查，我們選取了 12種化妝品中常見的致病菌，包括白色念珠菌(Candida albicans ),新生隱球菌(Cryp tococcus neoformans ),志賀氏菌(Shigella ),藤黃微球菌Oficrococcus Iuteus),金黃色葡萄球菌(51 taphylococcus aureus),化胺鏈球菌{Streptococcus pyogenes),沙門氏菌 kSalmorwlla),奇異變形桿菌{Proteusmirabilis、，弗氏朽1 樣酸桿菌(6?trobacter freundii),銅綠假單胞菌iPseudomormsaeruginosa )，產(chǎn)氣腸桿菌(Mn terobac ter aerogenes )，斯氏普羅威登斯菌 iPro vi denci astuart i )。
[0005]化妝品經(jīng)過(guò)一次污染和二次污染，致病菌就會(huì)進(jìn)入到化妝品中，而且化妝品為微生物的生長(zhǎng)提供了足夠的營(yíng)養(yǎng)和水分，是微生物生長(zhǎng)的溫床。污染化妝品的微生物主要包括真菌和細(xì)菌，一般霉菌不致病，細(xì)菌主要是大腸桿菌群，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌等。被污染的化妝品就會(huì)引起消費(fèi)者面部器官、皮膚的感染，更嚴(yán)重的引起全身感染，致病菌通過(guò)皮膚的破損處或者口腔進(jìn)入到人體內(nèi)。傳統(tǒng)的病原菌鑒定主要是生化鑒定和血清型分型，這些方法可以很準(zhǔn)確的鑒定微生物，但是操作時(shí)間太長(zhǎng)，操作也比較復(fù)雜，需要耗費(fèi)大量的人力和物力。隨著技術(shù)的發(fā)展，也有一些新的技術(shù)涌現(xiàn)，包括實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、熒光原位雜交、質(zhì)譜技術(shù)、免疫技術(shù)等，這些方法與傳統(tǒng)方法比，操作更簡(jiǎn)單，更快速。
[0006]( I)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)
實(shí)時(shí)突光定量 PCR ( real-time fluorescentquantitative polymerase chainreaction)，就是在簡(jiǎn)單的PCR反應(yīng)過(guò)程中加入熒光染料或者熒光探針，利用PCR過(guò)程中熒光的變化量，用機(jī)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR中產(chǎn)物的擴(kuò)增量，實(shí)現(xiàn)定量的目的。Richardson等人就利用熒光定量PCR技術(shù)了鑒定了 314株分枝桿菌菌株，靈敏度可以高達(dá)95%以上，這位臨床治療結(jié)核病奠定了基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)方法比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性比較好，靈敏度比較高，特異性也比較高。而且PCR擴(kuò)增過(guò)程中就可以完成分析，避免了外界的污染。整個(gè)過(guò)程比較快，從提取模板到結(jié)果分析，只需要8個(gè)小時(shí)左右。但是它也有缺點(diǎn)，檢測(cè)比較單一，實(shí)際樣品中致病菌的種類繁多，所以實(shí)時(shí)熒光定量PCR還有局限性。
[0007](2)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析
限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP )的原理是根據(jù)不同種群細(xì)菌基因組DNA的多態(tài)性來(lái)鑒定病原菌。不同細(xì)菌基因組的酶切類型和位點(diǎn)不同，就可以在限制性內(nèi)切酶的作用下，被切成不同長(zhǎng)度片段的DNA，然后利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)分離，從而分析不同種群基因組的酶切類型，來(lái)鑒定病原菌。Christensen就利用RFLP技術(shù)，在八小時(shí)的情況下，就將血培養(yǎng)瓶中的乳酸菌鑒定到種。De Baere等利用本方法對(duì)95個(gè)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了有33個(gè)臨床樣品為皮膚蘚菌，正確率100%。PCR-RFLP技術(shù)標(biāo)記比較靈敏，速度也比較快，但是不足的是，基因很容易發(fā)生點(diǎn)突變、插入、缺失等情況，導(dǎo)致酶切位點(diǎn)發(fā)生變化，因此RFLP電泳圖譜也會(huì)改變，實(shí)驗(yàn)不能重復(fù)。
[0008](3)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析
單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)的原理是不同堿基順序的DNA序列具有不同的空間構(gòu)象，不同空間構(gòu)象在非變性凝膠電泳中的速度不一樣，根據(jù)電泳的圖譜就可以達(dá)到鑒定的目的。DNA單鏈在自身堿基順序的影響下，可以折疊成多種多樣的DNA單鏈構(gòu)象。SSCP的實(shí)驗(yàn)步驟一般為對(duì)特定的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)高溫變性成單鏈，然后在非變性的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，得到SSCP電泳圖譜。Shin等對(duì)12種臨床比較常見的病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，變性，然后凝膠電泳得到12種常見病原菌的電泳圖譜，能很好地區(qū)分。Turenne根據(jù)將培養(yǎng)分離的25種致病菌構(gòu)建特異性電泳圖譜，然后檢測(cè)臨床272例病原菌，將其中251種鑒定到種的水平。另外21例臨床菌株在所構(gòu)建的電泳圖譜之外。SSCP技術(shù)雖然操作方便，靈敏度高，但是在親緣關(guān)系特別相近的種屬內(nèi)，SSCP電泳圖譜可以一模一樣，說(shuō)明SSCP技術(shù)的特異性不高。
[0009](4)熒光原位雜交
突光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種非放射性的雜交技術(shù)，它的原理就是，細(xì)胞或組織切片上核酸與RNA或者DNA探針可以堿基配對(duì)，是互補(bǔ)的，二者就可以形成穩(wěn)定的雜交體，DNA或者RNA探針上面有報(bào)告分子比如生物素等，可以利用本生物素和帶有熒光染料的親和素結(jié)合，然后根據(jù)熒光染料來(lái)對(duì)所鑒定病原微生物進(jìn)行定性，定量。Shepard等就根據(jù)帶有熒光標(biāo)記的探針，在3個(gè)小時(shí)就將197株臨床病例鑒定為白色念珠菌和光滑念珠菌。本技術(shù)實(shí)驗(yàn)者比較安全，而且分辨率也比較好，簡(jiǎn)單。但是唯一的缺陷是不能高通量。
[0010](5)質(zhì)譜技術(shù)
質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry, MS)的對(duì)象是蛋白質(zhì),它的原理就是將待檢多肽與基質(zhì)結(jié)合，根據(jù)質(zhì)荷比對(duì)多肽進(jìn)行分析，達(dá)到蛋白質(zhì)鑒定，蛋白質(zhì)修飾，蛋白質(zhì)分子相互作用的目的。首先在激光的作用下，使待測(cè)樣本與基質(zhì)分子結(jié)合成結(jié)晶薄膜，同時(shí)激光釋放出能量給基質(zhì)，基質(zhì)再傳遞給待測(cè)樣本，是待測(cè)樣本變成帶正電的、質(zhì)荷比不同的分子。然后在質(zhì)譜儀中電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下分開，就得到質(zhì)譜圖。但是本技術(shù)不適用于病原微生物的快速鑒定，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)提取比較復(fù)雜，而且蛋白質(zhì)的純度對(duì)質(zhì)譜圖影響很大。雖然成本低，檢測(cè)快，但是質(zhì)譜儀在一般的實(shí)驗(yàn)室很難實(shí)現(xiàn)。
[0011](6)免疫技術(shù)
免疫學(xué)技術(shù)主要包括乳膠凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫法、免疫磁性分離法。這三種技術(shù)的共同原理都是通過(guò)抗原抗體反應(yīng)，然后級(jí)聯(lián)放大，達(dá)到檢測(cè)的目的。乳膠凝集反應(yīng)就是把抗體標(biāo)記上 人工大分子乳膠，然后與抗體反應(yīng)。酶聯(lián)免疫法就是將酶連接到抗原抗體上，然后加入底物與酶反應(yīng)，產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)，通過(guò)顏色的變化來(lái)定性病原菌。免疫磁性分離法就是將抗原抗體反應(yīng)與磁場(chǎng)聯(lián)系到一塊，首先抗體與磁性微球連接，然后抗體與被檢測(cè)抗原連接，通過(guò)磁場(chǎng)的變換，將微生物分離出來(lái)，達(dá)到鑒定的目的。但是此種技術(shù)不是高通量的，不能應(yīng)對(duì)樣品比較多的情況。
[0012]這些檢測(cè)技術(shù)手段都各有自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，化妝品中致病菌對(duì)人的危害也很嚴(yán)重，因此找到一種快速、靈敏、高通量的方法至關(guān)重要。
[0013]RNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS),在細(xì)菌中是 16SrRNA-23S rRNA之間的基因序列，在真菌中是18S rRNA-28S rRNA之間的基因序列。本實(shí)驗(yàn)中白色念珠菌、新生隱球菌的特異探針是跟據(jù)18S rRNA-28S rRNA之間的基因序列確定的，藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌是根據(jù)16S rRNA-23S rRNA之間的基因序列確定的。由于志賀氏菌的ITS與沙門氏菌的ITS同源性接近，很難區(qū)分，所以志賀氏菌根據(jù)
特異基因設(shè)計(jì)探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明提供一種檢測(cè)化妝品中致病菌的基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測(cè)化妝品中常見致病菌檢測(cè)技術(shù)存在的費(fèi)時(shí)耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌檢測(cè)范圍，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，縮短檢測(cè)周期。
[0015]為實(shí)現(xiàn)上述目的文發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容:
一種檢測(cè)化妝品中常見致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于所述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列:
(O從藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏朽1檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌的16S-23S rDNA間區(qū)、白色念珠菌、新生隱球菌18S-28S rDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH基因(2)上述(I)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；
(3)上述(I)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列
其中，上述的從藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌的16S-23S rDNA間區(qū)、白色念珠菌、新生隱球菌18S-28S rDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH基因中選取的DNA片段具有SEQ ID NO:5 - SEQ ID N0:35所示的DNA序列中的一種或多種DNA序列；從細(xì)菌16s rDNA保守區(qū)中選取的DNA片段具有SEQ ID NO: 3所示的DNA序列。從真菌18s rDNA保守區(qū)中選取的DNA片段具有SEQ ID NO: 2所示的DNA序列。
[0016]其中，上述的寡聚核苷酸探針還包含陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針和熒光探針。上述的陽(yáng)性對(duì)照探針優(yōu)選為從細(xì)菌16s rDNA保守區(qū)和真菌18S rDNA中選取的DNA片段或者其互補(bǔ)的DNA或RNA序列，本發(fā)明的較佳實(shí)施例中上述的陽(yáng)性對(duì)照探針具有SEQ ID NO:2-SEQ ID NO: 3所示的DNA序列。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供上述的基因芯片的應(yīng)用，其可用于藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌、白色念珠菌、新生隱球菌、志賀氏菌的至少一種的檢測(cè)。其中，所應(yīng)用的檢測(cè)探針包括SEQ ID NO: 36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列中的至少一種。
[0018]本發(fā)明所涉及的SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 41序列如下:
表2實(shí)驗(yàn)所用到的探針序列_
Na οι |TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Cy3d
N0.02 ATTATGCGACCGCCCGGCTAAT
N0.03 GTACACACCGCCCGTCACACCATb
NO 04 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTc
N0.05 ATCAACTTGTCACACCAGATTATTACT
N0.06 AGGCGGGATCGCTTTGACAATG
N0.07 ACTTGCGGCGGTAACGTC
N0.08 CCTGTGAACTGTTTATGTTGCTTCGG
N0.09 GGTTTTATTACCTGTTGGACTTGGATT
N0.10 AGTCTTCGGCAAGCTGATAACAACCA
N0.1~GACACACTGTTTCATTTCTCCGTAATAA
N0.12 TAATAAGAAATGAAAAATGGTGTGTTGCA
N0.13 GATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCC
N0.14 AGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCA
N0.15 AGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCG
N0.16 GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTATTCT
N0.17 TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACTAAA
N0.18 ATGTTAACGTTTGACTTATAAAAATGGTGG
N0.19 GGCTCCATCAGGATACAATCCTACTAAACTT
N0.20 CACATGGTCAGATTCCTAATTTTCTACAGA
N0.2~GCTAAAGCGAGCGTTGCTTAGTATCCTA
N0.22 GAGGTTCTGACTACACGATGGGGCTAT
N0.23 AAAAGGAGTGGTTATACGGGTATTAAAACATTA
N0.24 GAATAACTAAGCTAATTCAAATGAGTTATCTTACT
N0.25 CCACCCAGATAGTCTTTGAAAGAGACACTTT
N0.26 CGCGCAGCCTTTCGATTGTACACCAAAGATTGGCG
N0.27 AACGCACATTGTTTATCGCTTAAACAATGTGAG
N0.28Igctcccacacgaattgcttgattcact
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)化妝品中常見致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于所述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列: (O從藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏朽1檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌的16S-23S rDNA間區(qū)、白色念珠菌、新生隱球菌18S-28S rDNA間區(qū)以及志賀氏菌的ipaH基因中選取的DNA序列； (2)所述(I)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列； (3)所述(I)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。
2.權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的從藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌的16S-23S rDNA間區(qū)、白色念珠菌、新生隱球菌18S-28S rDNA間區(qū)以及志賀氏菌的基因中選取的DNA片段具有SEQ ID NO:5 - SEQ ID N0:35所示的DNA序列中的一種或者多種DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探針還包含陽(yáng)性對(duì)照探針、陰性對(duì)照探針和熒光探針。
4.權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照探針選自細(xì)菌16srDNA保守區(qū)中選取的DNA片段或者 其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。
5.權(quán)利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照探針具有SEQID N0:2-SEQ ID NO: 3所示的DNA序列，陰性對(duì)照為SEQ ID NO:4。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基因芯片在用于檢測(cè)藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌、白色念珠菌、新生隱球菌、志賀氏菌方面的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所應(yīng)用的檢測(cè)探針包括SEQID NO: 36-SEQ IDNO: 41所示的DNA序列中的至少一種。
8.—種檢測(cè)化妝品品中常見致病菌的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的基因芯片。
9.權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括檢測(cè)探針SEQID NO:36-SEQ ID NO: 41所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的至少一種；還包括雜交盒、雜交液和分析鑒定結(jié)果用的判讀軟件以及說(shuō)明書。
10.權(quán)利要求8所述試劑盒在制備用于檢測(cè)藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、沙門氏菌、奇異變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、銅綠假單胞菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏普羅威登斯菌、白色念珠菌、新生隱球菌、志賀氏菌方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/14GK103937897SQ201410174089
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】王磊, 曹勃陽(yáng), 陳敏, 徐洋洋, 馮露 申請(qǐng)人:南開大學(xué)