玫瑰RrDFR1基因在調(diào)控植物花青素合成中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種玫瑰DNA片段的分離、克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。所述的DNA片段包含玫瑰花色功能基因RrDFR1，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列如SEQ?ID?NO：2所示。該基因片段能夠改變植物的花色,提高植物花青素的含量。將該基因片段直接轉(zhuǎn)化植物，使轉(zhuǎn)基因植物的花色發(fā)生改變，花青素含量增加。
【專利說(shuō)明】玫瑰RrDFRI基因在調(diào)控植物花青素合成中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種玫瑰基因片段的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的基因與植物花青素代謝有關(guān)。將該基因的完整翻譯區(qū)與花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入一般植物體，轉(zhuǎn)基因植株的花色發(fā)生變化，花青素含量增加。
【背景技術(shù)】
[0002]植物的色素主要有三大類:甜菜堿類、類胡蘿卜素類和花青素類。其中花青素是廣泛存在于植物中的一種水溶性色素，它由一個(gè)基本的結(jié)構(gòu)母核以及不同的取代基組成，因取代基類型及位置的差異從而形成了具有不同顏色的花青素物質(zhì)包括紅、粉、紫和藍(lán)色等，其中大約88%的被子植物的花顏色是由花青素決定的，花青素在結(jié)構(gòu)上主要分三類:天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素(cyanidin)和飛燕草素(delphinidin)。花青素主要以糖苷的形式存在于表皮細(xì)胞的液包內(nèi)并有多種生理功能，例如幫助植物傳粉，提高植物抗病性，以及保護(hù)植物免受低溫和紫外線傷害等；花青素也是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的植物中最強(qiáng)效的自由基清除劑，其強(qiáng)大的抗氧化能力可以預(yù)防心血管疾病、抗腫瘤、抗突變、抗動(dòng)脈硬化功能，調(diào)節(jié)免疫活性等功能。此外，花青素還是一種安全、無(wú)毒的天然食用色素。因此，花青素在園藝、醫(yī)藥、化妝、食品等方面具有一定的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值。
[0003]玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是薔薇科薔薇屬落葉叢生灌木,花型秀美,芳香四溢，色彩絢麗，在中國(guó)傳統(tǒng)名花中評(píng)價(jià)極高，素有“花中皇后”之稱。玫瑰具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其花瓣含有豐富的花青素類物質(zhì)，可以深入應(yīng)用于食品、醫(yī)療、保健等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的提供一種分離的玫瑰功能基因RrDFRl在調(diào)控植物花青素合成中的應(yīng)用，該基因與花色的形成相關(guān)。
[0005]本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]本發(fā)明提供了玫瑰中表達(dá)RrDFRl的基因編碼序列及其功能，具體包括=RrDFRl基因的核苷酸編碼序列的克隆，表達(dá)載體構(gòu)建，將該基因轉(zhuǎn)化宿主煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，進(jìn)行分子鑒定和表型觀察。
[0007]本發(fā)明首先從玫瑰中克隆出RrDFRl功能基因，該基因片段為具有特定序列的DNA分子，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?050bp，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNO=I所示。
[0008]本發(fā)明還提供了這種玫瑰RrDFRl蛋白編碼序列，它有349個(gè)氨基酸殘基，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009]本發(fā)明還提供了用于調(diào)取獲得玫瑰樣品中基因RrDFRl的一對(duì)核苷酸引物。該引物根據(jù)基因RrDFRl設(shè)計(jì)，使用該對(duì)引物對(duì)玫瑰花瓣樣品cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得1050bp的基因片段。該引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0010]Pl 正向引物:5’ ATGGGATCGGAATCCGAG3’ (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:3)
[0011] P2 反向引物:5’ TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’ (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:4)[0012]本發(fā)明還提供了一對(duì)檢測(cè)玫瑰RrDFRl基因在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)的引物對(duì)。該引物對(duì)根據(jù)基因RrDFRl設(shè)計(jì)，用該對(duì)引物轉(zhuǎn)化該基因的煙草樣品cDNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)該基因是否在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，獲得長(zhǎng)度為207bp的片段。
[0013]上述引物對(duì)的DNA序列如下所示:
[0014]P3 正向引物:5’ CAAGGGCATTGAGGAGAACTTGC3’ (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:5)
[0015]P4 反向引物:5’ CCTGTGACTTTGACACGGACGA3’ (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:6)
[0016]可以利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物技術(shù)方法將本發(fā)明提供的RrDFRl的編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。使用本發(fā)明的基因片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前面可加上任意一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或者植株進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被轉(zhuǎn)化的宿主是包括煙草在內(nèi)的多種植物，培育不同花色的植物種類。
[0017]本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因煙草花青素提取及測(cè)定方法。提液氮桶采取成熟花朵的花瓣，用液氮將花瓣研磨成細(xì)粉，分裝到離心管中后迅速放入液氮中凍存，于_80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取0.1g花瓣，加入0.5mL提取液(甲醇:鹽酸:水體積比=70: 0.1: 29.9，)于黑暗條件下4°C浸提24h，期間每隔6h用旋轉(zhuǎn)振蕩器振蕩lmin。12000rpm離心10min，取上清至新的離心管中，再用孔徑0.22 μ m的尼龍微孔濾器過(guò)濾后，保存于_40°C冰箱中，用于花青苷的分析。用分光光度儀(UV-2401PC，SHIMADZU)分別在波長(zhǎng)530nm與657nm處測(cè)量樣本的吸光值。花青素的含量用如下公式計(jì)算:QAnthocyanins=(A530 - 0.25XA657) XM^1 0
[0018]更詳細(xì)的技術(shù)方案見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明分離克隆的包含有RrDFRl基因編碼區(qū)的DNA片段(其中l(wèi)-1008bp為CDS)。序列全長(zhǎng)為1050bp，編碼349個(gè)氨基酸。
[0020]序列表SEQ ID NO:2是上述RrDFRl基因片段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的序列。
[0021]序列表SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4是擴(kuò)增上述玫瑰花瓣樣品cDNA的引物對(duì)的DNA序列。
[0022]序列表SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)基因片段引物對(duì)的DNA序列。
[0023]圖1:是超量植物表達(dá)載體pCAMBIA2300s結(jié)構(gòu)示意圖。
[0024]圖2:是重組質(zhì)粒pCAMBIA2300s-RrDFRl結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖3:對(duì)照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrDFRl基因的早花煙草的花色比較圖。圖中標(biāo)記:圖3A是對(duì)照早花煙草花色；圖3B是本發(fā)明轉(zhuǎn)RrDFRl基因早花煙草的花色。
[0026]圖4 =RrDFRl基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量的電泳跑膠圖。圖4A是轉(zhuǎn)RrDFRl基因的跑膠圖，圖4B是轉(zhuǎn)看家基因eIF的跑膠圖，圖中標(biāo)記:M為分子量大小，1-3為3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，P為重組質(zhì)粒pCAMBIA2300s-RrDFRl，CK為早花煙草(作為轉(zhuǎn)基因早花煙草的對(duì)照)。[0027]圖5:對(duì)照早花煙草與轉(zhuǎn)化RrDFRl基因的早花煙草花瓣花青素含量圖。圖中標(biāo)記:1-為早花煙草；2、3_分別為RrDFRl-6、RrDFRl-12，為2個(gè)轉(zhuǎn)基因的煙草株系。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1:分離克隆RrFLSl基因
[0029]本發(fā)明的前期對(duì)豐花玫瑰(又稱“平陰一號(hào)”，http://tc.cctv.com/20100412/103621, shtml，豐花玫瑰的選育文獻(xiàn)已經(jīng)公開(kāi)發(fā)表，見(jiàn):呂傳潤(rùn)(平陰玫瑰研究所)，玫瑰新品種-豐花玫瑰及栽培技術(shù)，山東林業(yè)科技，2007，5:77 ;華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院園藝植物生物學(xué)花卉實(shí)踐教學(xué)基地從山東省平陰縣平陰玫瑰研究所引種)不同時(shí)期的花朵進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成)，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中得到了 RrDFRl基因的全長(zhǎng)序列。根據(jù)轉(zhuǎn)錄測(cè)序RrDFRl基因的已知序列全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)特異引物Pl (見(jiàn)序列表SEQ IDNO:3)正向引物5’ATGGGATCGGAATCCGAG3’和P2 (見(jiàn)序列表SEQ IDNO:4)反向引物5’ TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’，將測(cè)序序列的l_1050bp從玫瑰品種‘豐花’(即豐花玫瑰)花瓣RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出來(lái)，擴(kuò)增得到的片段如下所示:
[0030]ATGGGATCGGAATCCGAGTCCGTTTGCGTGACAGGCGCCTCCGGTTTCGTAGGTTCATGGCTCGTCATGAGACTCCTAGAGCGCGGCTACACTGTCCGAGCCACCGTGCGAGACCCTGCTAATTCGAAGAAGGTGAAGCATCTGCTGGACTTACCAAAGGCGGCGACTCACTTGACGCTGTGGAAGGCAGACTTGGCGGAGGAGGGAAGCTTCGACGAAGCCATCAAGGGATGCACCGGAGTGTTCCATGTCGCCACTCCTATGGATTTTGAGTCCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATCAAACCTACTATAAATGGGGTGCTAGACATCATGAAAGCATGTCTAAAAGCAAAGACTGTAAGAAGGCTAGTGTTTACAGCTTCGGCTGGATCTGTCAAT GTTGAAGAGACCCAAAAGCCGGTCTACAACGAAAGCAACTGGAGTGATGTCGAATTTTGCCGGAGAGTGAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTATCCAAAACTCTAGCTGAGCAAGAGGCATGGAAGTTTGCCAAAGAAAATAACATTGATTTCATCACCATTATCCCAACTCTCGTAATCGGTCCATTTCTCATGCCTGCCATGCCGCCGAGCCTCATTACTGGACTTTCGCCACTCACTGGAAATGAAAGTCATTATTCGATCATAAAGCAAGGCCAATTCATTCATCTAGACGACCTCTGCCAATCTCATATATACTTGTATGAGCATCCGAAAGCAGAGGGCCGCTACATTTGTTCATCGCACGATGCTACGATTCATGAAATTGCGAAATTGCTGAGGGAAAAGTACCCCGAGTACAATGTTCCTACAACGTTCAAGGGCATTGAGGAGAACTTGCCAAAGGTCCATTTTTCTTCAAAGAAATTATTGGAAACAGGGTTCGAGTTCAAATACAGCTTGGAGGACATGTTTGTAGGAGCTGTTGATGCTTGTAAAGCAAAGGGTTTGCTTCCTCCTCCTACTGAAAGAGTTGAAAAGCAGGAGGTTGATGAGAGCAGTGTCGTCCGTGTCAAAGTCACAGGCTAA
[0031]擴(kuò)增產(chǎn)物中的l_1050bp就是本發(fā)明的序列。具體步驟為:
[0032]1、采用常用的CTAB法(參照:《植物基因工程》，王關(guān)林，方宏筠主編)從玫瑰品種‘豐花’中提取花瓣總RNA，具體步驟如下:
[0033]I)向離心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液(2% (ff/V)CTAB,NaCll.4mol/L, EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris *C1100mmol/L, 2% (ff/V)pvp)和 10%的β_巰基乙醇，在水浴鍋中預(yù)熱。
[0034]2)將玫瑰花瓣用液氮冷卻研磨，加入提取液中，混勻，65°C水浴10分鐘
[0035]3)加入等體積的氯仿:異戊醇(體積比24: I)混合液，顛倒混勻，靜置lOmin，4°C下 12000g 離心 IOmin
[0036]4)取上清，重復(fù)步驟3)[0037]5)取上清，加入終濃度為2mol/L的LiCl，冰浴10-12小時(shí)，12000g，4°C離心15分鐘，棄上清，用75%乙醇清洗沉淀兩次，溶于適量的DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水中待用。
[0038]6)以從玫瑰品種‘豐花’中提取花瓣總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，反應(yīng)條件為:65°C 5min, 42°C 50min,70°C IOmin。
[0039]7)根據(jù)轉(zhuǎn)錄測(cè)序中的序列設(shè)計(jì)的特異引物Pl (見(jiàn)序列表SEQ ID N:
3)5’ ATGGGATCGGAATCCGAG3’ 和 P2 (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO:4) 5’ TTAGCCTGTGACTTTGACACG3’，將RrDFRl從玫瑰品種‘豐花’花瓣RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中擴(kuò)增出來(lái)。
[0040]反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min ；94°C 30sec,60°C 30sec, 72°C lmin, 37 個(gè)循環(huán)；72°C
延伸lOmin。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入ρΜ?κ' 18-Τ載體(購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，獲得所需的全長(zhǎng)基因。該克隆被命名為PMDk: 18-RrDFRl質(zhì)粒。
[0041]實(shí)施例2 =RrDFRl基因超量表達(dá)載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化
[0042]為了能更好地闡明此基因的功能， 申請(qǐng)人:將其在煙草中超量表達(dá)，從轉(zhuǎn)基因植株的表型來(lái)驗(yàn)證。具體步驟是:首先將實(shí)施例1中得到的陽(yáng)性克「'^11)? 18-RrFLSl質(zhì)粒用BamH I和Sal I雙酶切，回收目的片段；同時(shí)，用同樣的方法酶切攜帶雙煙草花葉病毒啟動(dòng)子35S的遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA2300s (該遺傳轉(zhuǎn)化載體來(lái)自湖北省武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和贈(zèng)送)。酶切完畢，用包含RrDFRl基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(圖1)載體做連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (大腸桿菌菌株購(gòu)自寶生物工程大連有限公司)。通過(guò)酶切篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組載體(或稱轉(zhuǎn)化質(zhì)粒)， 申請(qǐng)人:將其命名為重組質(zhì)粒pCAMBIA2300s-RrDFRl。
[0043]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入到早花煙草中，經(jīng)過(guò)侵染、共培養(yǎng)、篩選同時(shí)具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化苗，再通過(guò)生根、練苗移栽等常規(guī)步驟(參考文獻(xiàn)J.薩姆布魯克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著；黃培堂，王嘉璽等譯；分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)；北京，科學(xué)出版社；2002版)，得到轉(zhuǎn)基因植株。
[0044]本發(fā)明的遺傳轉(zhuǎn)化的主要步驟和應(yīng)用試劑如下所述:
[0045](I)試劑和溶液縮寫(xiě)
[0046]本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫(xiě)表示如下:6-BA(6-BenzylaminoPurine,6-節(jié)氨基嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid,萘乙酸)；Kan (Kanamycin,卡那霉素)；Cef (Cefotaxime,頭孢霉素)；Hyg (Hygromycin,潮霉素)
[0047](2)用于早花煙草遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方
[0048]表1列出了本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分及其用量。
[0049]表1早花煙草轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基設(shè)計(jì)
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的玫瑰RrDFRl基因在調(diào)控植物花青素合成中的應(yīng)用，其特征在于該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物是煙草。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103993019SQ201410180475
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】寧國(guó)貴, 羅平, 包滿珠, 申玉曉, 李泉江 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)