治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及與AMD危險提高或降低相關(guān)的因子H基因多態(tài)性和單元型。本發(fā)明提供了診斷和治療AMD的方法和試劑。
【專利說明】治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑
[0001]本申請是發(fā)明人于2006年2月14日提交的題為“治療和診斷年齡相關(guān)性黃斑變性的方法和試劑”的中國專利申請200680012494.9的分案申請。
[0002]相關(guān)文獻的交叉參考
[0003]本申請要求U.S.臨時申請N0.60/650, 078 (2005年2月14日提交)、60/717,861(2005 年 9 月 16 日提交)、60/715，503 (2005 年 9 月 9 日提交)和60/735，697 (2005年11月9日提交)的權(quán)益，所述文獻均以其全部內(nèi)容引入本文為參考。
[0004]聯(lián)邦資助的研發(fā)中產(chǎn)生的發(fā)明的權(quán)利陳述
[0005]本申請所述工作部分由NIH眼科研究院基金EY11515資助。美國政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。 【背景技術(shù)】
[0006]年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是發(fā)達國家中引起不可逆失明的最主要原因(綜述參閱，Zarbin, 1998, 2004 ;Klein 等，2004 ；Ambati 等，2003 ；de Jong, 2004 ；van Leeuwen 等，
2003)，影響約15%的60歲以上個體。估計有6億個體在這一年齡統(tǒng)計范圍內(nèi)。AMD的患病數(shù)隨年齡提高，在75歲及以上的群體中，輕度或早期形式在近30%的個體中發(fā)生，高級形式在約7%的個體中發(fā)生(Klein等，1992 ;Vingerling等，1995a，1995b)。在臨床上，AMD的特征為由黃斑中發(fā)生的退化性變化引起的漸進性中央視覺喪失，黃斑是視網(wǎng)膜神經(jīng)中的特化區(qū)域及其下層組織。在最嚴重或滲出性的疾病形式下，來自脈絡(luò)膜脈管系統(tǒng)的新生血管葉突破了 Bruch膜和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)，一般引起視網(wǎng)膜脫落和其后的變性。
[0007]AMD作為遲發(fā)性復(fù)合疾病，似乎由遺傳和環(huán)境因素的組合引起和/或調(diào)節(jié)(Seddon和Chen，2004 ;Tuo等，2004 ；Klein和Francis，2003)。家族性聚集研究估計遺傳組分主要參與了多達25%的疾病(Klaver等，1998a)。根據(jù)流行的假說，多數(shù)AMD病例不是多種單基因病癥的集合，而是代表定量的表型、表示多種易患基因座的相互作用。所涉及的基因座數(shù)、所賦予的歸因危險度和多個基因座之間的相互作用仍不清楚。
[0008]連鎖和候選基因篩選分析已經(jīng)對AMD的遺傳學提供了有限的了解。已經(jīng)報道了一個增加危險的基因，ABCA4 (Allikmets等，1997)和一個降低危險的基因，ApoE4 (Klaver等，1998b，Souied等，1998)對AMD的可靠關(guān)聯(lián)。，此外，一些小組報道了全基因組連鎖分析的結(jié)果(綜述于Tuo等，2004 ;Weeks等，2004)。已經(jīng)證明了一個有AMD表型的家族與特定染色體區(qū)域Iq25_q31 (ARMDl)的連鎖(Klein等，1998)。已經(jīng)提出HEMICENTIN-l基因為致病基因(Schultz等，2003)，盡管其作用還沒有可靠地得到確認。若干研究(Weeks等，2001 ;Iyengar等，2003 ;Weeks等，2004)中染色體Iq上重疊基因座的鑒定提示該基因座可能包含一個或多個AMD相關(guān)基因。
[0009]最近對玻璃疣(與AMD發(fā)病相關(guān)的特征性眼損傷)的研究已經(jīng)指出了炎癥和其他免疫介導過程(特別是補體活化)在AMD早期和晚期形式的病因?qū)W中的作用(Hageman等，1999,2001 ；Mullins 等，2000,2001 ;Russell 等，2000 ;Anderson 等，2002，2004 Johnson等,2000, 2001 ；Crabb 等,2002 ；Ambati 等,2003 ；Penfold 等,2001 ；Espinosa-Heidman 等，2003)。這些研究已經(jīng)揭示了沿著bruch膜(由彈性蛋白質(zhì)和膠原組成的分隔RPE和脈絡(luò)膜的細胞外層)的玻璃疣中和RPE細胞上的玻璃疣中的末端途徑補體組分(C5、C6、C7、C8和C9)和末端途徑的活化特異性補體蛋白質(zhì)片段(C3b、iC3b、C3dg和C5b-9)以及多種補體途徑調(diào)節(jié)子和抑制子(包括因子H、因子1、因子0、CD55和CD59) (Johnson等，2000，2001 ；Mullins等2000，2001 ;Crabb等，2002)。許多這些玻璃疣相關(guān)分子先前認為是主要由肝合成的循環(huán)血漿蛋白質(zhì)。有趣的是，許多這些玻璃疣相關(guān)分子似乎還由RPE和/或脈絡(luò)膜細胞局部合成。
[0010]補體系統(tǒng)的活化在正常宿主的防御和損傷應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Kinoshita，1991)。這一系統(tǒng)的不適當活化和/或控制(常由特異性補體相關(guān)基因的突變引起)可引起自身免疫后遺癥和局部組織破壞(Holers, 2003 ；Liszewski and Atkinson, 1991 ；Morganand Walport, 1991 ；Shen and Meri, 2003),就像動脈粥樣硬化(Torzewski 等，1997 ；Niculescu等，1999)、阿爾茨海默病(Akiyama等,2000)和腎小球腎炎(Schwertz等,2001)中所顯示的那樣。
[0011]2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGN II) 一種罕見疾病，與補體級聯(lián)系統(tǒng)旁路途徑的非受控系統(tǒng)性活化相關(guān)。該疾病的特征為腎小球基底膜中異常電子密度物質(zhì)的沉積，最終導致腎衰竭，其中所述異常電子密度物質(zhì)由補體旁路途徑中涉及的蛋白質(zhì)C3和C3c組成。有趣的是，許多MPGNII患者發(fā)生了斑狀玻璃疣、RPE脫離和脈絡(luò)膜新生血管膜，它們在臨床上和組成上均與AMD中形成的有所不同，盡管它們常在十至二十歲中檢測到(Mullins等，2001 ；0 ' Brien 等，1993 ；Huang 等，2003 ；Colville 等，2003 ；DuvalI — Young 等，1989a, 1989b ；Raines 等，1989 ；Leys 等，1990 ；McAvoy and Silvestri, 2004 ；Bennett 等，1989 ；0rth and Ri tz, 1998 ；Habib 等，1975)。
[0012]在多數(shù)MPGNII患者中，補體級聯(lián)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)失能是由針對C3bBb的自身抗體介導的。然而，其他MPGNII患者在因子H中存在突變(Ault等，1997 ;Dragon_Durey等，
2004)，因子H是旁路補體途徑的主要抑制子。因子H中的點突變(I1166R)在約克豬中引起MPGNII (Jansen等，1998)，因子H缺陷型小鼠發(fā)生嚴重腎小球腎炎(Pickering等，2002)。此外，一些患MPGNIII的擴大家族(相關(guān)疾病)的患病個體顯示對染色體lq31_32的連鎖(Neary等，2002)，lq31_32是與在AMD的全基因組連鎖研究(見上文)中已經(jīng)鑒定的基因座重疊的區(qū)域。這一特定基因座包含大量補體途徑相關(guān)基因。這些基因的一個組稱為補體活化調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H相關(guān)基因(CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)和凝固因子XIII β亞基的基因。補體途徑相關(guān)基因的第二個簇與lq25_31基因座毗鄰，包括 C4BPA、C4BPB、C4BPAL2、DAF(CD55) CR1、CR2、CRlL 和 MCP (CD46)。
[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明涉及補體因子H基因的多態(tài)性和單元型，所述基因與年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和2型膜性增生性腎小球腎炎(MPGNII)的發(fā)生相關(guān)。本發(fā)明還涉及補體因子H相關(guān)5(CFHR5)基因的多態(tài)性和單元型，所述基因與AMD和MPGNII的發(fā)生相關(guān)。本發(fā)明提供診斷、監(jiān)測和治療這些以及其他疾病的方法。
[0015]在一方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者發(fā)生年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法，所述方法包括檢測因子H基因多個多態(tài)性位點中變異的存在與否。在一個實施方案中，本發(fā)明提供診斷對發(fā)生AMD的易感性增加的方法，包括檢測個體中因子H基因多態(tài)性的存在與否。該方法可包括獲得來自個體的DNA和分析來自該個體的DNA以確定該DNA是否在因子H基因中含有多態(tài)性。某些多態(tài)性指示，該個體與對照群體相比發(fā)生AMD的易感性增加。某些多態(tài)性指示該個體發(fā)生AMD的可能性降低。某些多態(tài)性指示該個體發(fā)生AMD的可能性既沒有增加也沒有降低。
[0016]在一個實施方案中，受試者發(fā)生年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的傾向的診斷方法包括獲得來自該受試者的DNA樣品和檢測該患者的DNA中是否存在與發(fā)生AMD相關(guān)的多態(tài)性，存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD的傾向提高，不存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD的傾向降低。
[0017]在相關(guān)的方面中，本發(fā)明提供診斷對發(fā)生AMD的易感性的方法，包括確定個體的因子H單元型。該方法包括獲得來自個體的DNA和分析該個體的DNA以確定其因子H單元型。某些單元型(危險單元型)指示該個體對發(fā)生AMD的易感性提高。某些單元型(保護性單元型)指示該個體對發(fā)生AMD的易感性降低。某些單元型(中性單元型)指示該個體對發(fā)生AMD的可能性既不提高也不降低。
[0018]在相關(guān)的實施方案中，通過分析該基因編碼的基因產(chǎn)物(如RNA或因子H蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)同種型))來確定因子H基因的多態(tài)性位點中變異的存在與否。變體蛋白質(zhì)的表達指示因子H基因的變異，并可指示提高或降低的發(fā)生AMD的傾向?？梢允褂妹庖邷y定和其他方法檢測蛋白質(zhì)。[0019]在另一相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明提供通過檢測個體生物樣品中的變體因子H多肽來診斷發(fā)生AMD或其他疾病的易感性的方法。在一個實施方案中，使用基于抗體的測定診斷個體中的AMD或其他疾病，其中使該個體的生物樣品(如血清樣品)接觸抗體并檢測變體因子H多肽的存在與否。在實施方案中，該抗體與變體因子H多肽特異性表位(即在野生型因子H多肽中未發(fā)現(xiàn))特異性相互作用。在實施方案中，使用基于分離的測定(如PAGE)診斷個體中的AMD或其他疾病，其中檢測個體的生物樣品(如血清樣品)中變體因子H多肽的存在與否。
[0020]在一個方面中，本發(fā)明提供通過調(diào)節(jié)因子H的類型和/或全身和/或眼水平的量來治療患AMD (如其中檢測到指示發(fā)生癥狀A(yù)MD的危險提高的多態(tài)性或單元型的個體)或其他變體因子H基因相關(guān)疾病的個體的方法。該因子H多肽可以是野生型因子H多肽或變體因子H多肽。該因子H多肽可以是這樣的因子H多肽，即其具有中性或保護性等位基因而不是危險單元型相關(guān)等位基因編碼的序列。在一個實施方案中，該方法包括對個體施用有效量的因子H多肽，以降低疾病癥狀。在一個實施方案中，該方法包括對個體施用有效量的因子H多肽，以降低發(fā)生疾病癥狀的傾向并延緩疾病的發(fā)生和發(fā)展。在一個實施方案中，該方法包括施用包含因子H的血液。在一個實施方案中，該方法包括施用核酸(如轉(zhuǎn)基因)，所述核酸包含編碼因子H多肽的核苷酸序列。在一個實施方案中，該方法包括施用表達因子H多肽的細胞。
[0021]在一個方面中，本發(fā)明提供治療患AMD(如其中檢測到指示發(fā)生癥狀A(yù)MD的危險提高的多態(tài)性或單元型的個體)或其他變體因子H基因相關(guān)疾病的個體的方法。在一個實施方案中，該方法包括對患者施用有效量的降低變體因子H的量或編碼因子H的基因表達的物質(zhì)，以減少患者的疾病癥狀。在相關(guān)實施方案中，對個體施用治療量的變體因子H多肽抑制劑(如滅活劑)。[0022]在一個實施方案中,對個體施用抑制性核酸(如與變體因子H多肽的核苷酸序列至少部分互補的RNA)。在一個實施方案中，施用純化的反義RNA，其與編碼變體因子H多肽的RNA互補。
[0023]在另一實施方案中，對個體施用治療量的抗CFH抗體，所述抗體足以部分滅活變體因子H多肽。
[0024]在另一實施方案中，治療個體以從血中除去因子H的有害形式(如通過血漿去除術(shù)、抗體指導的血漿去除術(shù)或與因子H結(jié)合部分如肝素的復(fù)合)。
[0025]在一個方面中，本發(fā)明提供編碼變體因子H多肽的純化DNA、編碼變體因子H多肽的純化RNA，與編碼變體因子H多肽的RNA互補的純化反義RNA以及純化的變體因子H多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供用于表達野生型或變體因子H多肽或因子H生物活性片段的核酸。
[0026]在一個方面中，本發(fā)明提供包含編碼因子H多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅(qū)動因子H基因在多種細胞類型中表達的啟動子。備選地，該載體可包括驅(qū)動因子H基因僅在特定細胞 類型(如視網(wǎng)膜細胞或腎細胞)中表達的啟動子。在一個方面中提供了含有編碼因子H蛋白質(zhì)的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含有病原體，并適于對人類患者施用。在一個實施方案中，所編碼的因子H多肽為保護性變體。
[0027]在一個方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的因子H多肽的組合物，其中所述多肽為保護性多肽。
[0028]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的因子H多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，并適于對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的因子H多肽具有野生型序列。在一個實施方案中，編碼的因子H多肽為保護性變體。
[0029]在一個方面中，本發(fā)明提供抗體，所述抗體與變體因子H多肽而不是野生型因子H多肽特異性相互作用。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并可通過消減技術(shù)獲得。這些抗體足以滅活變體因子H多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有抗因子H抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中所述組合物不含有病原體，并適于對人類患者施用。
[0030]在一個方面中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD的危險提高或降低相關(guān)的變體因子H蛋白質(zhì)的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供鑒定保護性因子H蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(a)鑒定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中保護性因子H蛋白質(zhì)由具有保護性單元型的等位基因編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明提供鑒定中性因子H蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(a)鑒定具有中性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中中性因子H蛋白質(zhì)由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD的危險降低相關(guān)的因子H變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD的危險降低相關(guān)的單元型或二倍型(diplotype)的個體；(b)獲得來自個體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中保護性因子H蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD的危險降低相關(guān)的等位基因編碼。在實施方案中，所述保護性或中性因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0031]在相關(guān)方法中，鑒定與發(fā)生AMD的危險提高相關(guān)的因子H形式，是通過(a)鑒定具危險單元型的個體；和(b)確定在個體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中危險因子H蛋白質(zhì)由具危險單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定與發(fā)生AMD的危險提高相關(guān)的因子H的變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD的危險提高相關(guān)的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自該個體的基因組DNA或RNA ;和(c)確定在個體基因組中編碼的因子H的氨基酸序列，其中危險因子H蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD的危險提高相關(guān)的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，所述危險因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。
[0032]在一個方面中，本發(fā)明提供診斷發(fā)生AMD或其他疾病的傾向或易感性的方法，所述方法通過檢測患者的生物樣品中全長因子H與截短因子H的比值。在一個實施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來自受試者的RNA樣品和檢測患者RNA中外顯子10(即全長因子H)與外顯子10A(即截短的因子H)表達的比值，比值提高指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性降低。在一個實施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD的傾向或易感性的方法包括獲得來自受試者的蛋白質(zhì)樣品和檢測患者蛋白質(zhì)中全長因子H與截短的因子H的表達比值，比值提高指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性提高，比值降低指示該受試者發(fā)生AMD的傾向或易感性降低。
[0033]在一個方面中，本發(fā)明提供細胞，所述細胞含有編碼因子H蛋白質(zhì)或其片段的重組或純化核酸，例如來自因子H基因的核酸。細胞可以為細菌或酵母或用于研究和藥物開發(fā)的任何其他細胞。因此，本發(fā)明提供表達重組變體人因子H的分離宿主細胞或細胞系。在實施方案中，變體是危險變體且第402位氨基酸具有組氨酸。在實施方案中，變體是保護性變體且第62位氨基酸為異亮氨酸。在實施方案中，變體為中性變體。在實施方案中，所述危險、保護性或中性變體因子H蛋白質(zhì)不具有野生型因子H多肽的氨基酸序列。 [0034]在一個方面中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動物，其體細胞和生殖細胞含有編碼人變體因子H多肽的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可用作AMD模型和用于篩選治療AMD的有用物質(zhì)。動物可以是小鼠、蟲或用于研究和藥物開發(fā)(如重組產(chǎn)生因子H)的任何其他動物。在實施方案中，該因子H為變體人因子H，其中所述變體的第62位氨基酸為異亮氨酸或第402位氨基酸為組氨酸。
[0035]在一個方面中，本發(fā)明提供篩選多態(tài)性位點的方法，所述多態(tài)性位點與表1A、1B和IC所述因子H基因中的多態(tài)性位點連鎖。這些方法包括鑒定基因中與因子H基因多態(tài)性位點連鎖的多態(tài)性位點，其中因子H基因中多態(tài)性位點的多態(tài)性形式與AMD相關(guān)；確定個體群中的單元型，以指示該連鎖的多態(tài)性位點是否具有與因子H基因的多態(tài)性形式平衡一不平衡的多態(tài)性形式，其中因子H基因的多態(tài)性形式與AMD表型相關(guān)。
[0036]在一個方面中，本發(fā)明提供MPGNII的診斷、治療和篩選方法，如上述對AMD進行。
[0037]在一個方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向的方法，包括檢測CFHR5基因的一個或多個多態(tài)性位點中是否存在一個或多個變異。在一個實施方案中，本發(fā)明提供診斷對發(fā)生AMD或MPGNII的易感性提高的方法，包括檢測個體CFHR5基因中是否存在多態(tài)性。該方法可包括獲得自個體的DNA和分析來自該個體的DNA以確定該DNA是否在CFHR5基因中含有多態(tài)性。某些多態(tài)性指示個體對發(fā)生AMD或MPGNII的易感性提高。某些多態(tài)性指示個體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性降低。某些多態(tài)性指示個體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。
[0038]在一個實施方案中，診斷受試者中發(fā)生AMD或MPGNII的傾向的方法包括從受試者獲得DNA樣品和檢測該患者的DNA中是否存在與發(fā)生AMD或MPGNII相關(guān)的多態(tài)性，存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向提高,不存在該多態(tài)性指示該受試者發(fā)生AMD或MPGNII的傾向降低。
[0039]在相關(guān)的實施方案中，通過分析基因產(chǎn)物(如RNA或該基因編碼的CFHR5蛋白質(zhì)(如蛋白質(zhì)同種型))確定CFHR5基因多態(tài)性位點處的變異存在與否。變體蛋白質(zhì)的表達指示CFHR5基因中的變異，并可指示發(fā)生AMD或MPGNII的傾向提高或降低?？梢允褂妹庖邷y定和其他方法檢測蛋白質(zhì)。
[0040]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供診斷對發(fā)生AMD或MPGNII的易感性的方法，包括確定個體的CFHR5單元型。該方法包括獲得來自個體的DNA和分析該個體的DNA以確定其CFHR5單元型。某些單元型(危險單元型)指示個體具有比對照群提高的對發(fā)生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(保護性單元型)指示該個體具有降低的對發(fā)生AMD或MPGNII的易感性。某些單元型(中性單元型)指示該個體發(fā)生AMD或MPGNII的可能性既不提高也不降低。[0041]在另一相關(guān)方面中，本發(fā)明提供通過檢測個體的生物樣品中變體CFHR5多肽來診斷對發(fā)生AMD或MPGNII或其他疾病的易感性的方法。在一個實施方案中，使用基于抗體的測定診斷個體中的AMD或MPGNII或其他疾病，其中通過使個體的生物樣品(如血清樣品)接觸該抗體并檢測是否存在該變體CFHR5多肽。在實施方案中，該抗體與變體CFHR5多肽特異性表位(即在野生型CFHR5多肽中未發(fā)現(xiàn)的)特異性相互作用。在實施方案中，使用基于分離的測定(如PAGE)診斷個體中的MPGNII或其他疾病，這是通過檢測該個體的生物樣品(如血清樣品)中是否存在該變體CFHR5多肽。可以使用多種類型的免疫測定形式來測定樣品中的CFH或CFHR5的多肽或蛋白質(zhì)。包括夾層ELISA、放射性免疫測定、熒光免疫測定、免疫組織化學測定、點印跡、量桿(dip-stick)和Western印跡。
[0042]在一個方面中，本發(fā)明提供通過調(diào)節(jié)CFHR5的類型和/或全身性和/或腎水平的量來治療個體的方法，所述個體患有AMD或MPGNII (如其中檢測到指示發(fā)生AMD或MPGNII癥狀的危險提高的多態(tài)性或單元型的個體)或與變體CFHR5基因相關(guān)的其他疾病，或者有患病危險。CFHR5多肽可以是中性或保護性等位基因而不是與危險單元型相關(guān)的等位基因所編碼的CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低疾病癥狀的量對個體施用CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低發(fā)生疾病癥狀的傾向和延緩疾病的發(fā)生或發(fā)展的量對個體施用CFHR5多肽。在一個實施方案中，該方法包括施用含有CFHR5的血。在一個實施方案中，該方法包括施用包含編碼CFHR5多肽的核苷酸序列的核酸(如轉(zhuǎn)基因)。
[0043]在一個方面中，本發(fā)明提供治療個體的方法，所述個體患有AMD或MPGNII (如檢測到指示發(fā)生AMD或MPGNII癥狀的危險提高的多態(tài)性或單元型的個體)或與變體CFHR5基因相關(guān)的其他疾病。在一個實施方案中，該方法包括以有效降低患者中疾病癥狀的量對患者施用物質(zhì)，所述物質(zhì)降低變體CFHR5的量或編碼CFHR5的基因的表達。CFHR5多肽可以是野生型CFHR5多肽或變體CFHR5多肽。
[0044]在一個實施方案中，對個體施用抑制性核酸(如與變體CFHR5多肽的核苷酸序列至少部分互補的RNA)。在一個實施方案中，施用與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補的純化的反義RNA。
[0045]在另一實施方案中，對個體施用治療量的抗CFHR5抗體，所述抗體足以使該變體CFHR5多肽部分失活。
[0046]在相關(guān)的實施方案中，對個體施用治療量的變體CFHR5多肽抑制劑(如滅活劑)。
[0047]在另一實施方案中，治療個體以從血中除去CFHR5的有害形式(如通過血漿去除術(shù)、抗體指導的血漿去除術(shù)或與CFHR5結(jié)合部分如肝素的復(fù)合)。
[0048]在一個方面中，本發(fā)明提供編碼變體CFHR5多肽的純化DNA、編碼變體CFHR5多肽的純化RNA、與編碼變體CFHR5多肽的RNA互補的純化的反義RNA以及純化的變體CFHR5多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供用于表達野生型或變體CFHR5多肽或CFHR5的生物活性片段的核酸。
[0049]在一個方面中，本發(fā)明提供包含編碼CFHR5多肽的核酸的基因治療載體。該載體可包括驅(qū)動CFHR5基因在多種細胞類型中表達的啟動子。備選地，該載體可包括驅(qū)動CFHR5基因僅在特定細胞類型(例如視網(wǎng)膜細胞或腎細胞(如內(nèi)皮細胞、腎系膜細胞、足細胞))中表達的啟動子。在一個方面中，本發(fā)明提供含有編碼CFHR5蛋白質(zhì)的基因治療載體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護性變體。
[0050]在一個方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的CFHR5多肽的組合物，其中該多肽為保護性變體。 [0051]在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的CFHR5多肽和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對人類患者施用。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為野生型序列。在一個實施方案中，編碼的CFHR5多肽為保護性變體。
[0052]在一個方面中，本發(fā)明提供與變體CFHR5多肽特異性相互作用而不與野生型CFHR5多肽相互作用的抗體。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，并都可通過消減技術(shù)獲得。這些抗體可以足以滅活變體CFHR5多肽。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供含有抗CFHR5抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物，其中該組合物不含病原體，并適于對人類患者施用。
[0053]在一個方面中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險提高或降低相關(guān)的變體CFHR5蛋白質(zhì)的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供鑒定保護性CFHR5蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(a)鑒定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中保護性CFHR5蛋白質(zhì)由具有保護性單元型的等位基因編碼。在一個實施方案中，本發(fā)明提供鑒定中性CFHR5蛋白質(zhì)的方法，所述方法通過(a)鑒定具有保護性單元型的個體，和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中中性CFHR5蛋白質(zhì)由具有中性單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險降低相關(guān)的CFHR5變體形式的方法，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險降低相關(guān)的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自個體的基因組DNA或RNA;和(c)確定在個體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中保護性CFHR5蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險降低的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，保護性或中性CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0054]在相關(guān)方法中，鑒定了與發(fā)生AMD或MPGNII的危險提高相關(guān)的CFHR5形式，所述鑒定通過(a)鑒定具危險單元型的個體和(b)確定在個體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中危險CFHR5蛋白質(zhì)由具危險單元型的等位基因編碼。在相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供鑒定與發(fā)生AMD或MPGNII的危險提高相關(guān)的CFHR5變體形式，包括(a)鑒定具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險提高相關(guān)的單元型或二倍型的個體；(b)獲得來自該個體的基因組DNA或RNA，和(c)確定在個體基因組中編碼的CFHR5氨基酸序列，其中危險CFHR5蛋白質(zhì)由具有與發(fā)生AMD或MPGNII的危險提高相關(guān)的單元型的等位基因編碼。在實施方案中，危險CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0055]在一個方面中，本發(fā)明提供含有重組或純化的核酸的細胞，所述核酸來自CFHR5基因。該細胞可以為細菌或酵母，或用于研究和藥物開發(fā)的任何其他細胞。因此，本發(fā)明提供表達重組變體人CFHR5的分離的宿主細胞或細胞系。在實施方案中，CFHR5變體為危險變體，并且第46位氨基酸為絲氨酸。在實施方案中，CFHR5變體為中性變體。在實施方案中，危險、保護性或中性變體CFHR5蛋白質(zhì)不具有野生型CFHR5多肽的氨基酸序列。
[0056]在一個方面中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因非人動物，其體細胞和生殖細胞含有編碼人變體CFHR5多肽的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物用作AMD或MPGNII的模型，并用于篩選用于治療AMD或MPGNII的物質(zhì)。所述動物可以為小鼠、蟲或用于研究和藥物開發(fā)(如重組產(chǎn)生CFHR5)的任何其他動物。 在實施方案中，CFHR5為變體人CFHR5，其中所述CFHR5變體的第46位氨基酸為絲氨酸。
[0057]在一個方面中，本發(fā)明提供篩選與表14或表15中所述CFHR5基因多態(tài)性位點連鎖的多態(tài)性位點的方法。這些方法包括鑒定與CFHR5基因多態(tài)性位點連鎖的基因中的多態(tài)性位點，其中CFHR5基因中多態(tài)性位點的多態(tài)性形式與AMD或MPGNII相關(guān)；以及測定個體群中的單元型，以指示連鎖的多態(tài)性位點是否具有與AMD或MPGNII表型相關(guān)CFHR5基因的多態(tài)性形式平衡一不平衡的多態(tài)性形式。
[0058]在一個方面中，本發(fā)明提供用于分析因子H單元型的試劑盒。該試劑盒可用于診斷患者的AMD。該試劑盒可包括一個或多個因子H、因子H等位基因特異性寡核苷酸(如等位基因特異性引物或探針)或特異性識別因子H多肽的抗體。該因子H等位基因特異性寡核苷酸可包括來自因子H基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。該因子H特異性抗體可識別正?；蛞吧虷多肽或變體因子H多肽，其中在該因子H編碼區(qū)中存在一個或多個非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該試劑盒可用于診斷AMD以及與因子H基因SNP相關(guān)的其他疾病，如MPGNII。作為替代或補充，該試劑盒可包括一個或多個因子H相關(guān)5(CFHR5)等位基因特異性寡核苷酸(如引物或探針)或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5等位基因特異性引物和因子H相關(guān)5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自因子H相關(guān)5基因的編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。因子H相關(guān)5特異性抗體可識別正常或野生型H多肽或變體因子H相關(guān)5多肽，其中在該因子H相關(guān)5編碼區(qū)中存在一個或多個非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0059]在一個實施方案中，該試劑盒包含探針或引物，它們可以在表1A、表1B和/或表IC中列出的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因。在實施方案中，該探針為用于核酸擴增的引物，所述擴增為擴增跨越表1A、表1B和/或表1C中列出因子H基因多態(tài)性位點的區(qū)域。在實施方案中，該試劑盒具有探針或引物，它們在表1A、表1B和/或表1C中列出的一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因。在實施方案中，該試劑盒具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)rs3766404 ；
(d)rsl061147 ； (e)rsl061170 ； (f)rs203674 ； (g)rs529825 和 rs800292 中至少一個；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個；(i)rs529825 和 rs800292 中至少一個，以及 rs3766404 ;以及 rsl061147, rsl061170 和 rs203674 中至少一個；或者 j)rs529825,rs800292, rs3766404, rsl061170 和 rs203674 中至少一個。
[0060]在相關(guān)實施方案中，試劑盒具有在一個以上多態(tài)性位點區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ； (c)內(nèi)含子2 (IVS2或insTT) (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ；j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個或三個；(I)rs529825 和 rs800292 中至少一個;和內(nèi)含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147、rsl061170 和rs203674 中至少一個；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內(nèi)含子2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ;和 rs375046 ； (n) rs529825、rs800292、內(nèi)含子2 ;rs3766404、rsl061170、外顯子10A、rs203674和rs375046中至少兩個，或至少三個或至少四個；(ο)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22(1210)與任意前述變異或一組變異(a-o)組合。在實施方案中，試劑盒具有在rs460897和rs460184中一處或兩處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點選自(a)rs3753394 ； (b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 ;和(k)rs1065489?[0061]在一個實施方案中，作為上述探針的替代或補充，試劑盒含有區(qū)分CFHR5基因中多態(tài)性位點的探針、引物、抗體等。在一個方面中，本發(fā)明提供基于CFHR5基因變異的診斷患者AMD或MPGNII的試劑盒。試劑盒可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸，或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。CFHR5特異性抗體可識別正?；蛞吧虲FHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在CFHR5編碼區(qū)中存在一個或多個非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該試劑盒可用于診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因中SNP相關(guān)的其他疾病。
[0062]在一個實施方案中，試劑盒含有在表14或表15中列出的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用于核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點的區(qū)域。在實施方案中，該試劑盒具有在表14或表15中列出的一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒包含在一個、兩個或全部以下多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0063]在一個實施方案中，試劑盒含有在CFH基因中的多態(tài)性位點和CFHR基因(如CFHR5)的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。
[0064]在一個方面中，本發(fā)明提供用于確定受試者單元型的裝置。該裝置可用于例如診斷患者的AMD或其他疾病。在一個實施方案中，該裝置含有在表1A、IB和/或IC中列出的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用于核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表1A、1B和/或IC中列出的因子H基因多態(tài)性位點的區(qū)域。在實施方案中，該裝置具有在表1A、1B和/或IC中列出的一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該裝置具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點包括(a)rs529825 ； (b)rs800292 ； (c)rs3766404 ； (d)rsl061147 ；
(e)rsl061170 ;(f)rs203674 ;(g)rs529825 和 rs800292 中至少一個；(h)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個;(i) rs529825 和 rs800292 中至少一個；和 rs3766404 ；以及 rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少一個；或者 j)至少 rs529825、rs800292、rs3766404、rsl061170 和 rs203674。
[0065]上述試劑盒及其內(nèi)含物還可用于為任何目的而鑒定發(fā)生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0066]在相關(guān)實施方案中，該裝置具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點包括(a)rs529825 ；(b)rs800292 ；(c)內(nèi)含子2(IVS2或insTT) ； (d)rs3766404 ； (e)rsl061147 ； (f)rsl061170 ； (g)外顯子 IOA ； (h)rs203674 ； (i)rs375046 ； (j)rs529825 和 rs800292 ； (k)rsl061147、rsl061170 和 rs203674 中至少兩個或三個；(l)rs529825 和 rs800292 中至少一個；和內(nèi)含子 2 ;和 rs3766404 ;和 rsl061147,rsl061170 和 rs203674 中至少一個；和外顯子 IOA ;和 rs375046 ； (m)至少 rs529825 ；rs800292 ;內(nèi)含子 2 ；rs3766404 ；rsl061170 ;外顯子 IOA ；rs203674 ；和 rs375046 ； (η)rs529825、rs800292、內(nèi)含子 2、rs3766404、rsl061170、外顯子 10A、rs203674 和 rs375046中至少兩個，或至少三個或至少四個；(o)外顯子22 (1210);或(P)外顯子22 (1210)與任意前述變異或一組變異(a- o)組合。在實施方案中，裝置具有在rs460897和rs460184中一個或兩個處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，裝置具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點選自(a)rs3753394 ;(b)rs529825 ;(c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2 (IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ； (g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ; (j) rs3753396 和(k) rsl065489。在實施方案中，裝置具有在一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物，其中所述多態(tài)性位點選自(a)rs3753394 ；(b)rs529825 ； (c)rs800292 ； (d)內(nèi)含子 2(IVS2 或 insTT) ； (e)rs3766404 ； (f)rsl061147 ；(g)rsl061170 ； (h)rs2274700 ； (i)rs203674 ； (j)rs3753396 和(k)rs1065489?
[0067]在一個方面中，本發(fā)明提供用于診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。在一個實施方案中，該裝置含有在表14和表15列出的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，探針為用于核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點的區(qū)域。在實施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。本發(fā)明的裝置可含有區(qū)分因子H和CHFR5變體的探針或引物，包括上文及本文公開內(nèi)容中其他處所述的位點的任何組合。
[0068]上文所述裝置及其內(nèi)含物還可用于為任何目的而鑒定發(fā)生MPGNII的傾向或確定因子H單元型。
[0069]在一個實施方案中，作為上述探針或引物的替代或補充，該裝置含有區(qū)分CFHR5基因中多態(tài)性位點的探針、引物、抗體等。在一個方面中，本發(fā)明提供基于CFHR5基因變異診斷患者的AMD或MPGNII的裝置。該裝置可包括一種或多種CFHR5特異性探針或CFHR5等位基因特異性寡核苷酸或特異性識別CFHR5多肽的抗體。CFHR5特異性引物和CFHR5等位基因特異性寡核苷酸可包括來自CFHR5基因編碼(外顯子)或非編碼(啟動子、5’未翻譯、內(nèi)含子或3’未翻譯)區(qū)的序列。該CFHR5特異性抗體可識別正?；蛞吧虲FHR5多肽或變體CFHR5多肽，其中在該CFHR5編碼區(qū)中存在一個或多個非同義單核苷酸多態(tài)性(SNP)。該裝置可用于診斷AMD或MPGNII以及與CFHR5基因SNP相關(guān)的其他疾病。
[0070] 在一個實施方案中，該裝置含有在表14或表15中列出的多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該探針為用于核酸擴增的引物，其中擴增是擴增跨越表14或表15中列出的CFHR5基因多態(tài)性位點的區(qū)域。在實施方案中，該裝置具有在表14或表15中列出的一個以上多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物。在實施方案中，該試劑盒具有在一個、兩個或全部以下多態(tài)性位點處區(qū)分等位基因的探針或引物:rs9427661( —249T>C) ；rs9427662( — 20T>C)和 rsl2097550(P46S)。
[0071]在一個實施方案中，該裝置含有在CFH基因中的多態(tài)性位點和CFHR基因(如CFHR5)的多態(tài)性位點區(qū)分等位基因的探針或引物。
[0072]在閱讀全部公開內(nèi)容后，本發(fā)明的其他方面將是顯而易見的。
[0073]附圖簡述
[0074]圖1A-1L顯示人視網(wǎng)膜色素上皮中因子H(圖1A-1H)和末端互補復(fù)合物(C5b_9)(圖11-1L)的免疫定位?？s寫:(RPE) —脈絡(luò)膜(Chor)復(fù)合物；Bruch膜(BM);視網(wǎng)膜(Ret);玻璃疣(Dr)。
[0075]圖2顯示使用來自人眼的RNA提取物對因子H基因表達((FH和截短形式HFL1)的RT-PCR分析。
[0076]圖3是人因子H基因的簡圖，顯示本分析中使用的12個SNP、因子H基因的22個外顯子、20個短共有重復(fù)序列(SCR)、病原體和其他底物的結(jié)合位點以及連鎖不平衡(LD)節(jié)段的大概位置。顯示CHl所有22個外顯子(但無內(nèi)含子)的簡圖未按比例拉伸。
[0077]圖4是人因子H基因SNP的單元型網(wǎng)狀圖，顯示危險(實心圓)、保護性(劃線圓)、中性(空心圓)和始祖(標出)單元型的關(guān)系以及單元型的相對頻率，以圓的大小和位置表示。
[0078]圖5顯示人因子H基因單元型和二倍型的相關(guān)分析。在AMD病例和對照中分析了8個信息化SNP的配對連鎖不平衡。顯示了在編碼鏈上標出的多態(tài)性位點處的核苷酸，除了IYS1，顯示了其非編碼鏈上的核苷酸。
[0079]圖6顯示人因子H cDNA參照形式的3926堿基核苷酸序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID N0:1])。ATG起始密碼子開始于第74位核苷酸，TAG終止密碼子終止于第3769位核苷酸。
[0080]圖7 顯示 SEQ ID NO:1 編碼的多肽序列(GenBank登錄號 Y00716 [SEQ ID NO:2]) ?1231個氨基酸的因子H多肽包括18個氨基酸的N端信號肽。
[0081]圖8顯示HFLl——人因子H截短形式的參照形式的1658堿基核苷酸序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:3])。ATG起始密碼子開始于第74位核苷酸，TGA終止密碼子終止于第1423位核苷酸。
[0082]圖9顯示SEQ ID NO:3編碼的HFLl參照形式的多肽序列(GenBank登錄號X07523[SEQ ID NO:4])。449個氨基酸的HFLl多肽包括18個氨基酸的N端信號肽。
[0083]圖10顯示示例性人因子H保護性變體的多肽序列[SEQ ID NO:5]。這種保護性變體因子H多肽的第62位氨基酸為異亮氨酸，第402位氨基酸為酪氨酸(以粗體標出)。
[0084]圖11顯示示例性HFLl保護性變體——人因子H的截短形式的多肽序列(SEQ IDNO:6)。這種保護性變體截短的因子H多肽的第62位氨基酸為異亮氨酸，第402位氨基酸為酪氨酸(以粗體標出)。
[0085]圖12顯示如(A)光學顯微鏡和(B)電子顯微鏡所見，具有密集膜內(nèi)沉積的顯著的腎小球細胞增多，其在MPGNII患者中引起毛細血管壁增厚。沉積可在腎小球基底膜(GBM)的致密板中形成分節(jié)的、間斷或彌散模式。通過光學顯微鏡可見，它們是嗜酸性并為折射體，用過碘酸希夫明亮染色并為高滲的，這解釋了其電子密度外觀(A)。甚至通過電子顯微鏡可見，沉積缺乏亞結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為非常暗的均勻斑點(B)。致密沉積的準確組成仍然未知(條帶，5 μ m)。
[0086]圖13是顯示補體級聯(lián)系統(tǒng)旁路途徑的激活和調(diào)節(jié)的圖，所述補體級聯(lián)系統(tǒng)在AMD和MPGNII患者中系統(tǒng)性高水平激活。補體級聯(lián)系統(tǒng)的旁路途徑在MPGNII/DDD患者中系統(tǒng)性高水平激活。正常情況下，自發(fā)的水解(稱為tick-over)過程低水平地持續(xù)激活C3。C3水解與圖上部顯示的大的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化相關(guān)。該構(gòu)象變化使C3 (H20)與C3b(C3的切割產(chǎn)物)類似。起始轉(zhuǎn)化酶C3 (H20)Bb激活C3以形成C3b。盡管C3b具有短暫的半衰期，如果其與IgG、細胞或基底膜結(jié)合，則可被保護免于立即失活。(C3b)2-1gG復(fù)合物在流體相中形成，并與備解素(P)結(jié)合，這促進了因子B的結(jié)合和C3bBb的產(chǎn)生，C3bBb為旁路途徑的轉(zhuǎn)化酶，其在此處顯示為Bb(C3b)2-1gG-備解素復(fù)合物。擴增環(huán)以箭頭顯示。C3NeF延長了 C3轉(zhuǎn)化酶的半衰期，在插圖中顯示。降解C3轉(zhuǎn)化酶的一種機制是通過其與補體因子H(CFH)的相互作用，在底部右側(cè)顯示為fH。因子H的缺乏和突變與MPGN II/DDD相關(guān)。
[0087]圖14為顯示補體激活調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇在染色體lq32上的組構(gòu)以及已知為補體因子 H (CFH)、因子 H 樣 I (CFHLl)和因子 H 相關(guān) 1、2、3、4 和 5 (CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)中短共有重復(fù)序列(SCR)的約60個氨基酸的結(jié)構(gòu)域的排列的圖。CFH具有20個SCR。已經(jīng)確定了這些SCR中一些的相互作用配偶體，在右上方顯示(CRP - C反應(yīng)蛋白質(zhì)；Hep，肝素)。補體因子H樣I(CFHLl)是CFH的剪接異構(gòu)體，而補體因子H相關(guān)蛋白質(zhì)1-5 (CFHR1-5)各由單獨的基因編碼(CFHR1-5)。CFHR1-5的SCR與CFH中的一些SCR相似，以橢圓中的數(shù)字顯示。例如，CFHR5具有9個SCR，前兩個與因子H的SCR6和7相似，因此具有CRP和肝素結(jié)合特性。CFHR5的SCR5-7在相應(yīng)橢圓中具有數(shù)字12 — 14，因為這些SCR與因子H的SCR12 - 14相似，并具有C3b和肝素結(jié)合特性。
[0088]圖15顯示連鎖不平衡曲線，表明A307A和Y402H在因子H中連鎖不平衡，一 249T>C和-20T>C在CFHR5中連鎖不平衡。
[0089]圖16顯示人CFHR5參照形式的2821個堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號AF295327[SEQ ID N0:7])。ATG起始密碼子開始于第94位核苷酸，TGA終止密碼子終止于第1803位核苷酸。
[0090]圖17 顯示 SEQ ID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號 AAK15619 [SEQ ID NO:8])。569個氨基酸的CFHR5多肽包括18個氨基酸的N端信號肽。
[0091]圖18顯不CFH和 因子H相關(guān)蛋白質(zhì)的基因中的基因組復(fù)制。外顯子以垂直線標出。以相同字母標出的區(qū)域(如A，A’和A")具有基本相同的序列。
[0092]發(fā)明詳述[0093]1.引言
[0094]本發(fā)明提供由因子H基因中和因子H相關(guān)基因如因子H相關(guān)5基因中多種變異組成的多態(tài)性和單元型的集合。這些多態(tài)性和單元型與年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和其他因子H相關(guān)病癥相關(guān)。這些多態(tài)性和單元型中的某些導致變體因子H多肽。對這些和其他多態(tài)性和多態(tài)性組(如單元型)的檢測可用于設(shè)計和進行AMD的診斷測定。可以通過核酸分析、通過因子H編碼序列所編碼的多肽(包括剪接變體編碼的多肽)的分析或通過本領(lǐng)域已知的其他方法檢測多態(tài)性和多態(tài)性組。分析這類多態(tài)性和單元型也可用于設(shè)計AMD的預(yù)防和治療方案。
[0095]因 子H是多功能蛋白質(zhì)，發(fā)揮補體系統(tǒng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子的功能。參閱Zipfel，2001, " Factor H and disease:a complement regulator affects vital bodyfunctions" Semin Thromb Hemost.27:191-9。因子 H 蛋白質(zhì)活性包括:(I)與 C 反應(yīng)蛋白質(zhì)(CRP)結(jié)合，⑵與C3b結(jié)合，(3)與肝素結(jié)合，⑷與唾液酸結(jié)合，(5)與內(nèi)皮細胞表面結(jié)合，(6)與細胞整聯(lián)蛋白質(zhì)受體結(jié)合，(7)與病原體(包括微生物)結(jié)合(見圖3)和(8)C3b輔因子活性。因子H基因稱為HFl、Cra和HF，位于人染色體1，位置lq32。lq32特定基因座含有大量補體途徑相關(guān)基因。這些基因中的一組稱為補體激活調(diào)節(jié)子(RCA)基因簇，含有編碼因子H、五種因子H—相關(guān)基因(分別為FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4和FHR - 5或者CFHR1、CFHR2、CFHR3、CFHR4和CFHR5)的基因，以及編碼凝結(jié)因子XIII β亞基的基因。因子H和因子H相關(guān)基因幾乎完全由短共有重復(fù)序列(SCR)組成。因子H和FHLl 分別由 SCRl — 20 和 I — 7 組成。FHR — 1、FHR — 2、FHR — 3、FHR-4 和 FHR — 5 分別由5、4、5、5和8個SCR組成(見圖14)?；虻捻樞驈闹z粒到端粒為FH/FHL1、FHR_3、FHR — 1、FHR-4、FHR — 2 和 FHR — 5。
[0096]因子H基因
[0097]已經(jīng)確定了人因子H cDNA的參照形式(SEQ ID NO:1)(參閱Ripoche等，1988，Biochem J249:593 — 602)和基因組序列。因子H cDNA編碼表觀分子量155kDa的長度為1231個氨基酸的多肽(SEQ ID NO:2)。存在稱為FHL — I (也稱為HFLl或CFHT)的因子H替代性剪接形式。FHL — I (SEQ ID NO:3)基本對應(yīng)于因子H的外顯子I至9 (參閱Ripoche 等，1988，Biochem J249:593 — 602)。FHLIcDNA 編碼表觀分子量 45 — 50kDA 的長度為449個氨基酸的多肽(SEQ ID NO:4)。Hll和FHLl的前445個氨基酸相同，F(xiàn)HLl具有獨特的C端4個氨基酸(外顯子10A)。替代外顯子IOA位于外顯子9與外顯子10之間的內(nèi)含子中。人因子H和FHLl的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)分別以登錄號Y00716和X07523見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。人因子H cDNA參照形式的3926堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID NO:1])示于圖6，SEQ ID NO:1編碼的多肽序列(GenBank登錄號Y00716[SEQ ID NO:2])示于圖7。人因子H的截短形式——HFLl參照形式的1658個堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:3])示于圖8，SEQ ID NO:3編碼的多肽序列(GenBank登錄號X07523 [SEQ ID NO:4])示于圖9。因子H基因序列(長度為150626個堿基)以GenBank登錄號AL049744可見。因子H啟動子位于因子H基因編碼區(qū)的5’。
[0098]FHR — I 基因
[0099]FHR-1 基因也稱為 CHFR1、CFHL1、CFHL、FHR1 和 HFL1。已經(jīng)確定了人 HFR — IcDNA的參照形式(參閱 Estaller 等，1991，J Immunol.146:3190 — 3196)和基因組序列。FHR —IcDNA編碼長度為330個氨基酸的多肽，預(yù)計分子量為39kDa。人FHR — I的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號M65292見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。FHR — I基因序列以GenBank登錄號AL049741可見。
[0100]FHR—2 基因
[0101]FHR - 2 基因也稱為 CHFR2、CFHL2、FHR2 和 HFL3。已經(jīng)確定了人 HFR — 2cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 2cDNA編碼長度為270個氨基酸的多肽，預(yù)計分子量為31kDa。人FHR-2的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號BC022283見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。FHR — 2基因序列以GenBank登錄號AL139418可見。
[0102]FHR—3 基因
[0103]FHR - 3 基因也稱為 CHFR3、CFHL3、FHR3 和 HFL4。已經(jīng)確定了人 HFR — 3cDNA 的參照形式(參閱 Strausberg 等，Proc.Natl.Acad.Sci 美國 99: 16899 一 16903)和基因組序列。FHR - 3cDNA編碼長度為330個氨基酸的多肽，預(yù)計分子量為38kDa。人FHR-3的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號BC058009見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。FHR — 3基因序列以GenBank登錄號AL049741可見。
[0104]H1R-4 基因
[0105]FHR-4基因也稱為CHFR4、CFHL4和FHR4。已經(jīng)測定了人HFR_4cDNA的參照形式(參閱 Skerka 等，1991，J.Biol.Chem.272:5627 — 5634)和基因組序列。FHR_4cDNA 編碼長度為331個氨基酸的 多肽，預(yù)計分子量為38kDa。人FHR-4的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號X98337見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。FHR-4基因序列以GenBank登錄號AF190816 (5，末端)、AL139418(3’ 末端)和 BX248415 可見。
[0106]H1R-5 基因
[0107]FHR-5基因也稱為CHFR5、CFHL5和FHR5。已經(jīng)確定了人CHFR_5cDNA的參照形式(SEQ ID NO:83)(參閱 McRae 等，2001，J.Biol.Chem.276:6747 — 6754)和基因組序列。CFHR5cDNA編碼長度為569個氨基酸的多肽(SEQ ID NO:8)，表觀分子量為65kDa。人CFHR5的cDNA和氨基酸序列數(shù)據(jù)以登錄號AF295327見于EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫。人CFHR5參照形式的2821堿基的核苷酸序列(GenBank登錄號AF295327 [SEQ ID NO:7])示于圖16，SEQID NO:7 編碼的多肽序列(GenBank 登錄號 AAK15619[SEQ ID NO:8])示于圖 17。CFHR-5基因序列以GenBank登錄號AL139418 (5，末端)、AL353809 (3，末端)可見。FHR-5啟動子位于CFHR5基因編碼區(qū)的5’。
[0108]I1.定義
[0109]提供以下定義以幫助理解本發(fā)明。除非另外指明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語、注釋和其他科學或醫(yī)學術(shù)語或命名法具有醫(yī)學和分子生物學領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的意義。在一些情況下，為了清楚和/或易于參考起見，本文定義了具有普遍理解意義的術(shù)語，不應(yīng)假定本文中這些定義的內(nèi)容代表與本領(lǐng)域一般理解相比存在的顯著差異。
[0110]“核酸”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”是任何長度的核苷酸聚合形式，可以是DNA或RNA，并且可以是單鏈或雙鏈。核酸可包括啟動子或其他調(diào)節(jié)序列。寡核苷酸基本通過合成的手段制備。核酸包括跨越任一多態(tài)性位點或位于其側(cè)翼的DNA節(jié)段或其互補序列，所示多態(tài)性位點示于表1A、表1B和/或1C，或者已知在因子H基因中。節(jié)段通常在5至100個連續(xù)堿基之間，范圍經(jīng)常從下限5、10、12、15、20或25個核苷酸至上限10、15、20、25、30、50或 100 個核苷酸(其中上限大于下限)。5-10、5-20、10-20、12 — 30、15-30、10-50、20-50或20-100之間的核酸是常見的。多態(tài)性位點可以在節(jié)段內(nèi)的任何位置出現(xiàn)。提到雙鏈核酸中的一條鏈的序列也定義了其互補鏈，除非本文中另外明確說明，提到核酸的一條鏈也指其互補物。對于某些應(yīng)用，可以修飾核酸(如RNA)以提高胞內(nèi)穩(wěn)定性和半衰期?？赡艿男揎棸ǖ粌H限于在分子骨架中使用硫代磷酸酯或2’ -O -甲基而不是磷酸二酯酶鍵。修飾的核酸包括肽核酸(PNA)和具有內(nèi)源性內(nèi)切核酸酶不易識別的非常規(guī)堿基如肌苷、queosine和wybutosine以及腺嘌呤、胞嘧唳、鳥嘌呤、胸腺嘧唳和尿嘧唳的乙?；弧⒓谆?、硫代一及類似修飾形式的核酸。
[0111]“雜交探針”是能以堿基特異性方式與核酸互補鏈結(jié)合的核酸。此類探針包括核酸和肽核酸(Nielsen等，1991)?？梢栽诒绢I(lǐng)域已知的嚴格條件下進行雜交。例如，參閱如 Berger 和 Kimmel (1987)Methods In Enzymology, 152 卷:Guide To Molecular CloningTechniques,San Diego:Academic Press,Inc.;Sambrook 等，(1989)Molecular Cloning:Aaboratory Manual,第 2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory ;Sambook(2001)第 3版；Rychlik，W.和 Rhoads，R.E.，1989，Nucl.Acids Res.17,8543 ；Mueller,P.R.等(1993)In Current Protocols in Molecular Biologyl5.5, Greene Publishing Associates,Inc.和 John Wiley 和 Sons, New York ;以及 Anderson 和 Young, Quantitative FilterHybridization in Nucleic Acid Hybridization (1985))。本文使用的術(shù)語“探針”包括引物。探針和引物有時指“寡核苷酸”。
[0112]術(shù)語“引物”指能在適當條件下、在適當?shù)木彌_液和適當?shù)臏囟认伦鳛槟０逯笇У腄NA合成的起始點的單鏈寡核苷酸。引物的適當長度取決于引物的預(yù)期用途，但范圍一般從15至30個核苷酸。引物序列不需要與模板精確互補，但必須充分互補以與模板雜交。術(shù)語“引物位點”指靶DNA中 與引物雜交的區(qū)域。術(shù)語“引物對”指一組引物，包括與待擴增DNA序列的5’末端雜交的5’上游引物以及與待擴增序列3’末端互補序列雜交的3’下游引物。
[0113]用于短探針和引物的示例性雜交條件為所計算的Tm下約5至12°C。計算Tm的公式是已知的，包括對于小于14個堿基的寡聚物并假定反應(yīng)在50mM —價陽離子存在下進行時的Tm = 4 0C X (引物中的G和C數(shù))+2°C X (引物中的A和T數(shù))。對于較長的寡聚物，可以使用以下公式:Tm = 64.9°C +41°C X (引物中的G和C數(shù)一16.4)/N，其中N為引物長度。另一普遍使用的公式考慮了反應(yīng)的鹽濃度(Rychlik,同上，Sambrook,同上，Mueller,同上):Tm = 81.5°C +16.6°C X (logl0[Na+] + [K+])+0.41°C X (% GC) — 675/N，其中 N 為寡聚物中的核苷酸數(shù)。上述公式提供了某些應(yīng)用的起點，然而，特定探針和引物的設(shè)可以考慮其他或不同的因素。設(shè)計用于本發(fā)明方法的探針和引物的方法為本領(lǐng)域所熟知。
[0114]術(shù)語“危險”、“保護性”和“中性”用于描述變異、SNP、單元型、二倍型和特征為這些變異模式的基因所編碼的群體中的蛋白質(zhì)。危險單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其包含至少一個與發(fā)生AMD的危險提高相關(guān)的變體多態(tài)性，優(yōu)選一組變體多態(tài)性。涉及因子H或因子H相關(guān)基因使用時，術(shù)語“變體”指核苷酸序列，其中該序列與種群(本文中為美國歐裔血統(tǒng)的人)中最常見的序列不同。變體多態(tài)性可以在基因的編碼或非編碼部分中。危險因子H單元型的實例為編碼氨基酸402處的組氨酸和/或氨基酸1210處的半胱氨酸的因子H基因等位基因。危險單元型可以是天然存在的，或者通過重組技術(shù)合成。保護性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其包含至少一個與發(fā)生AMD的危險降低相關(guān)的變體多態(tài)性，優(yōu)選一組多態(tài)性。例如，一種保護性因子H單元型具有編碼氨基酸62處為異亮氨酸的因子H基因。保護性單元型可以是天然存在的，或者通過重組技術(shù)合成。中性單元型是基因(本文中為因子H或因子H相關(guān)基因)的等位基因形式，其不包含種群或人種群中與發(fā)生AMD的危險提高或降低相關(guān)的變體多態(tài)性。從以下的討論中顯然可見，當施用于需要治療或預(yù)防AMD或其他病癥的患者時，“中性”單元型編碼的蛋白質(zhì)可以是保護性的。即施用于例如患AMD或有發(fā)生AMD的受試者時，CFH或CFHR5的“中性”和“保護性”形式可提供治療益處，從而“保護”受試者免于疾病。
[0115]術(shù)語“野生型”指核酸或多肽，其中序列為種群(本文中為歐洲一美洲血統(tǒng)的人)中的普及形式(約40%普及，見圖5)。就本文公開內(nèi)容的目的而言，“野生型”因子H蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 2的序列(圖7)，只是第402位氨基酸為酪氨酸(Y ; [SEQ ID NO:337])。就本文公開內(nèi)容的目的而言，編碼野生型因子H蛋白質(zhì)的因子H基因具有SEQ ID N0:1的序列(圖6)，只是開始于堿基1277的密碼子(對應(yīng)于第402位氨基酸)編碼酪氨酸(TAT [SEQID NO:336])。
[0116]涉及因子H或因子H相關(guān)多肽時使用的術(shù)語“變體”指多肽，其中序列在改變所編碼多肽的氨基酸序列的位置上不同于正?；蛞吧托蛄?。例如，因子H基因核苷酸序列中的一些變異或取代改變密碼子，從而編碼不同的氨基酸(例如但不僅限于在一個或多個I62V、Y402H、D936E中的替代等位基因)，導致變體多肽。變體多肽可與危險相關(guān)(如第402位為組氨酸)、與保護相 關(guān)(如第62位為異亮氨酸)，或者可以由中性單元型編碼(如936位為天冬氨酸)。變體CFHR5多肽可與危險相關(guān)(如第46位為絲氨酸)、與保護相關(guān)，或者可以是中性的。
[0117]涉及因子H多肽時，術(shù)語“參照”指氨基酸序列與Ripoche等人，1988, BiochemJ.249 =593-602 所述的全長 O7Hl，SEQ ID NO:2)或截短(FHL1，SEQ ID NO:4)人因子 H 序列相同的多肽。涉及CFHR5多肽時，術(shù)語“參照”指氨基酸序列與McRae等人，2001，J.Biol.Chem.276:6747-6754所述全長人CFHR5 (SEQ ID NO:8)的序列相同的多肽。任意地將第一種鑒定的等位基因形式稱為參照形式或等位基因；其他等位基因形式稱為替代或變體等位基因。野生型和變體形式可以與參照形式具有實質(zhì)的序列同一性(例如，野生型或變體形式可以在至少90%的野生型或變體中氨基酸位置上與參照形式相同，有時在至少95%的位置、有時至少98%或99%的位置上與參照形式相同)。變體可以由于移碼突變或剪接變異而在某些蛋白質(zhì)區(qū)域中與參照形式不同。
[0118]術(shù)語“多態(tài)性”指種群中存在兩種或更多遺傳確定的替代序列或等位基因?！岸鄳B(tài)性位點”是發(fā)生序列趨異的基因座。多態(tài)性位點具有至少兩種等位基因。雙等位基因多態(tài)性具有兩種等位基因。三等位基因多態(tài)性具有三種等位基因。二倍體生物的等位基因形式可以是純合或雜合的。多態(tài)性位點可以小至一個堿基對。多態(tài)性位點的實例包括:限制性片段長度多態(tài)性(RFLP);可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)(VNTR);高變區(qū)；小衛(wèi)星；雙核苷酸重復(fù)；三核苷酸重復(fù)；四核苷酸重復(fù)和簡單序列重復(fù)。本文使用的術(shù)語“多態(tài)性”可包括一組多態(tài)性(即單元型)。[0119]“單核苷酸多態(tài)性(SNP) ”在單核苷酸占據(jù)的多態(tài)性位點發(fā)生，所述位點是等位基因序列之間的變異位點。該序列之前和之后一般為高度保守的等位基因序列。SNP通常由于多態(tài)性位點處一個核苷酸取代另一個而產(chǎn)生。用一個嘌呤取代另一個嘌呤或者用一個嘧啶取代另一個嘧啶稱為轉(zhuǎn)換(transition)。用嘧啶取代嘌呤或相反稱為顛換(transversion)。同義SNP指編碼區(qū)中用一個核苷酸取代另一個而不改變所編碼多肽氨基酸序列。非同義SNP指編碼區(qū)中用一個核苷酸取代另一個而改變所編碼多肽氨基酸序列。SNP還可以由相對于參照等位基因的核苷酸缺失或插入而產(chǎn)生。
[0120]一“組”多態(tài)性指多于一種多態(tài)性，如表1A、表1B和/或表1C中所示或已知在因子H基因或其他基因中的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或多于6種多態(tài)性。
[0121]術(shù)語“單元型”指個體基因中一組多態(tài)性或多態(tài)性位點的等位基因的命名。例如，“112”因子H單元型指該因子H基因在前兩個多態(tài)性位點處均包含等位基因I，在第三個多態(tài)性位點處包含等位基因2。“二倍型”為單元型對。
[0122]“分離的”核酸指是組合物中存在的優(yōu)勢種的核酸種類。分離的指核酸從至少一種與其天然相關(guān)的化合物分離。純化的核酸包含(基于摩爾)至少約50%、80%或90%的所存在的所有大分子種類。[0123]當兩氨基酸序列至少約80%—致、優(yōu)選至少約90%—致、更優(yōu)選至少約95%、至少約98%—致或至少約99%—致時，認為其具有“實質(zhì)的同一性”。一般通過確定兩序列間的最佳比對和比較兩序列來計算序列同一性百分比?？梢酝ㄟ^觀察，或使用Smith和Waterman, 1981, Adv.App1.Math.2:482 的局部同源性算法、使用 Needleman 和 Wunsch,1970, J.Mol.Biol.48:443 的同源性比對算法、使用 Pearson 和 Lipman, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85:2444的相似性搜索方法，通過這些算法的計算機化的實施(例如Wisconsin Genetics 軟件包中，Genetics Computer Group, 575Science Dr., Madison,Wis.)使用用于氨基酸比較的默認參數(shù)(例如用于缺口評分等)來進行序列的最適比對。有的時候需要描述兩個序列之間關(guān)于具體長度或區(qū)域的序列同一性(例如兩個序列可以被描述為在至少500堿基對的長度上具有至少95%的同一性)。通常所述長度可以是至少約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個氨基酸，或是參照蛋白質(zhì)的全長。如果兩個氨基酸序列有1、2或3個殘基，或2-20個殘基、2-10個殘基、3_20個殘基或3 —10個殘基不同，則也認為它們具有實質(zhì)的同一性。
[0124]“連鎖”描述了基因、等位基因、基因座或遺傳標記由于其位于相同染色體上，所以被一起遺傳的趨勢。連鎖可通過兩個基因、等位基因、基因座或遺傳標記之間的重組百分比測量。通常，以彼此間50厘摩(CM)以內(nèi)的距離存在的基因座是連鎖的。連鎖的標記可存在于相同的基因或基因簇內(nèi)?！斑B鎖不平衡”或“等位基因關(guān)聯(lián)”是指具體的等位基因或遺傳標記與位于鄰近染色體位點上特定的等位基因或遺傳標記，以比群體中對任何具體等位基因可能估計的頻率更頻繁地優(yōu)先關(guān)聯(lián)。連鎖不平衡的標記特別適用于檢測對疾病的易感性，即使標記本身不引起所述疾病。
[0125]術(shù)語“診斷”是指確定個體是否具有發(fā)生疾病的傾向(包括有無體征或癥狀)的能力。診斷發(fā)生疾病的傾向還可被稱為“篩選”，在本文中使用時，術(shù)語診斷和篩選可交換使用。應(yīng)當明白具有提高的或降低的發(fā)生病癥的傾向是指相對于未患有所述病癥的群體中的個體，發(fā)生所述病癥的可能性。
[0126]II1.表格
[0127]本文涉及到的某些表格在下文實施例之后提供。提供以下描述以幫助閱讀者:
[0128]表1A-1C顯示人因子H基因多態(tài)性及其與年齡相關(guān)性黃斑變性的關(guān)聯(lián)。(IA)顯示人因子H基因中dbSNP號、定位、跨越多態(tài)性的編碼(頂部，5’到3’方向)和非編碼(底部)鏈的序列、氨基酸改變、對照和AMD病例的等位基因頻率，和ISNP的X 2與P —值。(IB)顯示人因子H基因中dbSNP號、被查詢的序列、黑猩猩因子H基因中相應(yīng)的核苷酸、定位、氨基酸改變以及引物與探針組。(IC)顯示在dbSNP數(shù)據(jù)庫中沒有找到的人因子H基因中定位、跨越多態(tài)性的序列、氨基酸位置和14SNP的氨基酸改變(如果有的話)。
[0129]表2顯示一組AMD病例和對照中人因子H基因中八個SNP的單元型分析。
[0130]表3顯示人因子H基因中六個SNP的單元型分析以及它們與AMD的關(guān)聯(lián)。
[0131]表4顯示11個人因子H基因SNP與年齡相關(guān)性黃斑變性的關(guān)聯(lián)。
[0132]表5顯示用于人因子H的SSCP、DHPLC和DNA測序分析的引物。
[0133]表6顯示AMD患者和對照的基因分型數(shù)據(jù)。
[0134]表7顯示多個人種群中危險單元型的頻率。
[0135]表8顯示若干 種因子H的二倍型。指出了普遍危險和保護性二倍型。
[0136]表9顯示用于擴增因子H編碼序列的引物序列。
[0137]表10顯示用于擴增CFHR5編碼序列的引物序列。
[0138]表11顯示22個MPGNII患者中因子H SNP分析。
[0139]表12顯示22個MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對照中因子H SNP頻率的比較。
[0140]表13列出與MPGNII相關(guān)聯(lián)的因子H SNP及其相關(guān)的SCR。
[0141]表14顯示22個MPGNII患者中CFHR5SNP的分析。
[0142]表15顯示22個MPGNII患者和AMD —陰性的、人種相匹配的對照中CFHR5SNP頻率的比較。
[0143]表16顯示用于檢測因子H基因中多態(tài)性的示例性的等位基因特異的探針(16A)和引物(16B)。
[0144]IV.補體因子H多態(tài)性
[0145]在一個方面，本發(fā)明提供與下述發(fā)現(xiàn)相關(guān)的新的診斷、治療和藥物篩選方法，所述發(fā)現(xiàn)為:補體因子H(HFl)基因中的多態(tài)位點與對AMD的易感性和AMD的發(fā)展有關(guān)。
[0146]與AMD相關(guān)的因子H多態(tài)性如實施例1所述被鑒定，其根據(jù)標準方案使用SSCP分析、DHPLC分析和直接測序法檢查因子H(包括外顯子10A，其被轉(zhuǎn)錄為因子H的同種型FHLI)的編碼區(qū)和鄰近內(nèi)含子區(qū)域的變體。剩余的多態(tài)性通過5’核酸酶(Taqman，ABI)方法分型。如所述的進行Taqman基因分型和關(guān)聯(lián)分析(Gold等,2004)。使用Mac Vector軟件設(shè)計用于SSCP和DNA測序分析的引物，以擴增各外顯子及其鄰近的內(nèi)含子區(qū)域。根據(jù)標準方案通過SSCP和DHPLC，針對序列變異篩選PCR得到的擴增子。通過SSCP和DHPLC檢測到的所有改變根據(jù)標準方案通過雙向測序證實。使用X方(X2)和Fisher' s精確檢測(P值)進行統(tǒng)計學分析。
[0147]使用兩組獨立的AMD病例和年齡匹配的對照。所有參與的個體都是美國歐裔血統(tǒng)、大于60歲年齡并依照知情同意在IRB-批準的方案下招募。這些組由以下組成:來自The University of 1wa的352名患有臨床上被證明的AMD的無關(guān)聯(lián)的患者(平均年齡79.5±7.8歲)和113名無關(guān)聯(lián)的對照患者(平均年齡78.4±7.4歲；通過年齡和人種匹配)，和來自Columbia University的550名患有臨床上被證明的AMD的無關(guān)聯(lián)的患者(平均年齡71.32±8.9)和275名無關(guān)聯(lián)的、通過年齡和人種匹配的對照(平均年齡68.84±8.6歲)。由視網(wǎng)膜研究員訓練的眼科醫(yī)師通過間接檢眼鏡檢查法和裂隙燈顯微鏡檢查法來檢查患者。
[0148]Fundas照片根據(jù)標準化的、國際分類體系(Bird等，1995)分級。如果對照患者未顯示任何可辨別的黃斑疾病體征或不具有已知的AMD家族史，則將他們選擇并包括。AMD患者根據(jù)他們參與研究時最嚴重的眼分類被細分為表型類別:早期AMD (ARM)、地圖樣萎縮(GA)和滲出性(CNV) AMD。The University of 1wa的ARM和GA病例被進一步細分為不同的表型(單獨的RPE改變、>10的斑狀硬玻璃疣、斑狀軟玻璃疣、BB (表皮)玻璃疣、PED、“Cherokee”萎縮、半島狀地圖樣萎縮(peninsular geographic atrophy)和框式地圖樣萎縮(pattern geographic atrophy))。所有病例的最早的可被證明的表型也被記錄并用于分析。
[0149]如表1A中所示，在兩個獨立組的檢測中發(fā)現(xiàn)因子H基因多態(tài)位點與AMD的高度顯著的關(guān)聯(lián)，所述兩個獨立組一共包括約900個AMD病例和400個匹配的對照。表1A-1B中列出十六(16)個因子H基因中的多態(tài)性。其中有十二(12)個在SNP數(shù)據(jù)庫(dbSNP)中發(fā)現(xiàn)，所述數(shù)據(jù)庫可在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)找到。dbSNP是人因子H基因中SNP的集合，所述SNP分散于因子H基因的22個編碼外顯子中，分散于因子H基因的啟動子、5’未翻譯區(qū)、內(nèi)含子和3’未翻譯區(qū)中。以下列出在dbSNP數(shù)據(jù)庫中找到的人因子H基因中379個SNP的登錄號。這些SNP可用于實施本發(fā)明的方法。
[0150]表A
【權(quán)利要求】
1.分離的補體因子H多肽在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應(yīng)位點的酪氨酸。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO:2第62位殘基對應(yīng)位點的異亮氨酸。
3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述補體因子H多肽用于通過眼內(nèi)注射施用。
4.表達補體因子H多肽的分離的細胞在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應(yīng)位點的酪氨酸。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對應(yīng)位點的異亮氨酸。
6.分離的多核苷酸在制備預(yù)防或治療年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，所述多核苷酸包含編碼補體因子H多肽的序列，所述序列與啟動子有效連接，其中所述補體因子H多肽包含SEQ ID NO:2第402位殘基對應(yīng)位點的酪氨酸。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 2第62位殘基對應(yīng)位點的異亮氨酸。
8.權(quán)利要求6或7的用途，其中所述啟動子對視網(wǎng)膜色素上皮具有特異性。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中所述補體因子H多肽的氨基酸序列是SEQIDNO:2，或是由SEQ ID NO:2經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸衍生的序列，且該序列具有與補體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對應(yīng)的殘基是酪氨酸。
10.權(quán)利要求1-8中任一項的用途，其中所述補體因子H多肽包含SEQID NO: 5或SEQID NO:6的殘基19之前的氨基酸序列。
11.與補體因子H多肽的至少一部分核苷酸序列互補的分離的反義RNA、核酶或短干擾RNA在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途。
12.單克隆抗體在制備治療或預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的藥物中的用途，所述單克隆抗體與第402位為組氨酸的補體因子H多肽結(jié)合，但不與第402位為酪氨酸的補體因子H多肽結(jié)合。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的用途，其中所述藥物給予診斷患有年齡相關(guān)性黃斑變性的患者，或給予鑒定具有與年齡相關(guān)性黃斑變性危險相關(guān)的補體因子H基因單元型的患者。
14.藥物組合物，其包含重組補體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中重組補體因子H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸，并且其中所述組合物不含病原體，并且適于對人類患者施用。
15.藥物組合物，其包含重組補體因子H多肽和可藥用賦形劑，其中所述補體因子H多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO:2，或是由SEQ ID NO:2經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸衍生的序列，且該序列具有與補體因子H多肽相同的功能，前提是第402位對應(yīng)的殘基是酪氨酸且第62位對應(yīng)的殘基是異亮氨酸，并且其中所述組合物不含病原體，并且適于對人類患者施用。
16.包含抗體的藥物組合物，所述抗體與第402位為組氨酸的補體因子H蛋白質(zhì)結(jié)合，但不與第402位為酪氨酸的補體因子H蛋白質(zhì)結(jié)合。
17.藥物組合物，其包含編碼補體因子H多肽的基因治療載體和可藥用賦形劑，其中所述補體因子 H多肽包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
18.表達重組人補體因子H的分離的哺乳動物宿主細胞，其中所述重組人補體因子H包含第62位的異亮氨酸和第402位的酪氨酸。
【文檔編號】C12N5/10GK103920142SQ201410180974
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2005年2月14日
【發(fā)明者】G·S·哈格曼, R·J·史密斯 申請人:愛荷華大學研究基金會