水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s,所述基因特異性分子標記Pita3N5s是以攜帶水稻抗瘟基因Pita3的抗性品種的總DNA為模板，利用引物對F1、R1進行擴增后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hae?III酶切后獲得的與水稻抗瘟基因Pita3呈特異性帶型的核苷酸片段；所述引物對F1、R1核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明還公開了一種水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s的制備方法和應用。該分子標記可大大提高該基因在分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種以及轉(zhuǎn)基因育種中利用的效率。
【專利說明】水稻抗瘟基因P i ta3基因特異性分子標記P i ta3N5s及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術領域】，特別是涉及一種水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]可持續(xù)發(fā)展是國家的發(fā)展戰(zhàn)略，綠色食品安全生產(chǎn)是保證這一戰(zhàn)略實施的重要組成部分，農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)技術又是發(fā)展綠色食品的前提，利用作物自身的抗性控制病蟲害已成安全生產(chǎn)技術的重要組成部分。水稻作為全球最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由異宗配合子囊菌Magnaporthe gri sea (Couch and Kohn, 2002)引起的稻瘟病是限制水稻穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)的重要因素之一。據(jù)估計，該病害每年在東亞國家或地區(qū)可造成多達5.5億美元以上的經(jīng)濟損失(Robert，1991)。20世紀90年代以來，中國稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬hm2以上，稻谷損失達數(shù)億公斤(陳彥等，2012)。從環(huán)境保護與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的觀點來看，選育與利用抗病品種是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，單一抗性品種的持久性(通常是2-4年)會隨著病原菌的迅速變異而失去功效(鄭釗等，2009)，因此，合理的挖掘和利用廣譜抗性基因或者聚合多個抗病基因，是獲得持久、廣譜抗病品種的重要途徑。傳統(tǒng)的水稻抗性育種依賴于抗性表型的鑒定，不僅依賴于育種者具備的豐富經(jīng)驗和敏銳的觀察力，鑒定結(jié)果也極易受到環(huán)境及人為因素的影響而造成誤差，抗性基因的選育效率低下。隨著分子標記技術的產(chǎn)生及發(fā)展，其便捷、直接、不受環(huán)境影響等優(yōu)點使其應用價值及前景越來越受到關注。通過開發(fā)與目標基因緊密連鎖的分子標記，特別是在基因內(nèi)部開發(fā)其功能特異性的標記物進行分子標記輔助選擇，不僅大大加快了育種步伐，也提高了分子育種選擇的可靠性。
[0003]到目前為止，人們已經(jīng)鑒定出100多個水稻抗瘟基因(Ballini et al., 2008 ；Chen et al.，2014),其中至少23個水稻水稻抗痕基因已被克隆(Wang et al., 1999 ；Quet al.，2006 ；Hayashi et al.，2010 ；Jiang et al.，2012 ；Hua et al.，2012 ；Das et al.，2012 ；Lv et al.，2013)。這些稻瘟病抗病基因多數(shù)具有富亮氨酸重復-核苷酸結(jié)合位點(NBS-LRR)蛋白結(jié)構，NBS中心區(qū)域的功能與ATP結(jié)合/水解相關，C-端LRR區(qū)域參與了蛋白的相互作用(Dangl&Jones，2001 ；Takken&Tameling, 2009 ；Bernoux, 2011)。NBS-LRR基因有成簇排列的傾向，通常簇內(nèi)基因的同源性很高，與相同抗性途徑的基因也維持著共遺傳的規(guī)律(Michelmore&Meyers，1998 ；Leister, 2004)。在第12染色體上，目前至少已定位了20個水稻抗瘟基因，其中17個基因成簇分布于Pita位點附近，包括Pi4，Pi6，Pil2，Pil9，Pi20，Pi21，Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi42，Pi48，Pil57，Pita，Pita2，Pitq6，Pita3 (Yu etal.，1991 ；Naqvi et al.，1996 ；Yu et al.，1996 ；Zheng et al.，1996 ；Ahn et al.，1997 ；Hayashi et al.，1998 ；Ahn et al.，2000 ；Bryan et al.，2000 ；Tabien et al.，2000 ；Zhuang et al.，2002 ；Sallaud et al.，2003 ；Hayashi et al.，2006 ；Liu et al.，2007 ；Liet al.，2008 ；Kumar et al.，2010 ；Huang et al.，2011 ;Chen et al.，2014)。這 17 個水稻抗瘟基因在在著絲粒附近構成了一個大的抗性基因簇，其中只有I個抗病基因Pita被克隆(Bryan et al.，2000)。另外3個水稻抗瘟基因Pi39，Ρ?51和Pi⑶-3被定位在第12染色體的長臂上(Liu et al., 2004 ；Yang et al., 2009 ；ffang et al.，2012)。但該基因族中，還有更多的NBS-LRR成員等待人們進一步的挖掘和利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 申請人:通過圖位克隆方法(Map-based cloning),從華南稻區(qū)的一個優(yōu)異抗源品種黃華占(HHZ)中分離、鑒定到了一個具有廣譜、持久抗性的水稻抗瘟基因Pita3。通過長片段 PCR 擴增(Long RangementPCR Amplification)以及染色體步移(ChromosomeWorking)的方法,獲得了 Pita3位點區(qū)域的候選基因組序列。通過FGenesh預測,該區(qū)域包括了 5 個編碼 NBS-LRR 類蛋白的基因:Pita3-Nbsl ~5 (Chen et al.，2014)。Pita3 位于Pita基因區(qū)域，Pita/ta3區(qū)域基因位點的整合圖譜如圖1所示(Chen et al.，2014)。
[0005]值得注意的是，同樣位于Pita基因區(qū)域的Pita3，其對應的?；孕》N的抗譜卻與Pita的抗譜明顯不同，如表1所示。針對各等位基因的結(jié)構域測序分析表明，抗病Pita3與感病Pita3-NIP的結(jié)構域存在多個氨基酸差異。多年實踐證明，Pita3具有廣譜、持久的稻瘟病抗性，且遺傳力較高，使之更適合廣泛應用于稻瘟病抗性育種計劃中。因而，為了加快Pita3在抗性育種工作中的應用，開發(fā)出Pita3基因特異性分子標記，對于準確有效的分子標記輔助育種(MAS)、基因的聚合育種，顯得尤其重要。
[0006]表l.Pita3和Pita基因的抗譜比較
【權利要求】
1.一種水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s，其特征在于，所述基因特異性分子標記Pita3N5s是以攜帶水稻抗瘟基因Pita3的抗性品種的總DNA為模板，利用引物對F1、Rl進行擴增后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hae III酶切后獲得的與水稻抗瘟基因Pita3呈特異性帶型的核苷酸片段；所述引物對F1、R1核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2 所示。
2.如權利要求1所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s，其特征在于，所述攜帶水稻抗瘟基因Pita3的抗性品種為抗源品種黃華占。
3.如權利要求2所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s，其特征在于，所述擴增產(chǎn)物核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
4.如權利要求3所述 的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s，其特征在于，所述水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
5.權利要求1所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s的制備方法，其特征在于，包括步驟: 1)利用多序列比對軟件工具，對Pita3基因及其等位基因進行核苷酸比對，篩查Pita3中特異的、能區(qū)別于其感病等位基因以及該位點其他稻瘟病等位抗性基因的特異性單堿基差異位點； 2)利用步驟I)獲得的SNP信息，在SNP上游100-200bp處設計基因特異性上游引物F1，在該SNP下游100-200bp處設計帶有錯配堿基的基因特異性下游引物R1，所述引物對FURl核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2所示； 3)利用步驟2)中引物對F1、R1，以攜帶水稻抗瘟基因Pita3的抗性品種的總DNA為模板，進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hae III酶切后獲得的與水稻抗瘟基因Pita3呈特異性帶型的核苷酸片段，即為所述水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s0
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，還包括步驟4)，利用步驟2)所述的引物對，對不同水稻品種的總DNA進行PCR擴增，獲得Pita3基因簇抗源品種對應于Pita3特異SNP位點的片段，與步驟2)獲得的DNA片段進行比較，從而確定Pita3基因特異性的分子標記Pita3N5s。
7.權利要求1-6任一項所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s在檢測水稻抗瘟基因Pita3及其等位基因的應用。
8.權利要求1-6任一項所述的水稻抗瘟基因Pita3基因特異性分子標記Pita3N5s在檢測普栽水稻品種中水稻抗瘟基因的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK103937789SQ201410183099
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月30日 優(yōu)先權日:2014年4月30日
【發(fā)明者】陳深, 華麗霞, 朱小源, 蘇菁, 汪聰穎, 汪文娟, 曾列先, 楊健源 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所