一種氧化葡萄糖酸桿菌梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種氧化葡萄糖酸桿菌梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子，屬于基因和代謝工程領(lǐng)域。本發(fā)明挑選Gluconobacter?oxydans中組成型表達(dá)基因與上一基因間的序列，運(yùn)用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行初步篩選，然后將獲得的高評(píng)分的潛在強(qiáng)啟動(dòng)子用加強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)作為報(bào)告基因，分別通過(guò)熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀的定性和定量檢測(cè)，最終從G.oxydans?WSH-003中挑選出強(qiáng)度順序?yàn)椋篜tuf-WSH003>Ptuf-621H>Psldh≈Ppsldh≈Psod>Paldh的啟動(dòng)子。本發(fā)明篩選出系列梯度啟動(dòng)子和一種新的強(qiáng)啟動(dòng)子，為工業(yè)生產(chǎn)菌株G.oxydans?WSH-003的基因和代謝工程改造，特別是在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，提供很大的幫助。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種氧化葡萄糖酸桿菌梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種氧化葡萄糖酸桿菌梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子，屬于基因和代謝工程領(lǐng)域?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) WSH-003能以D-山梨醇(D-sorbitol)為底物的L-山梨糖(L-sorbose)高產(chǎn)菌株，且高度耐受D-山梨醇和L-山梨糖，被廣泛用于工業(yè)維生素C的生產(chǎn)。隨著Ketogulonicigenium vulgare WSH-001(以山梨糖為底物的高產(chǎn)2-KLG生產(chǎn)菌株)和G.0xydans WSH-003的基因組測(cè)序的相繼公布，基因工程和生物信息學(xué)等的綜合運(yùn)用使維生素C 一步菌的構(gòu)建得到極大的促進(jìn)。其中，通過(guò)構(gòu)建一步基因工程菌，可在搖瓶發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)從D-山梨醇到2-KLG的直接生產(chǎn)，但產(chǎn)量有待提高。除了從發(fā)酵條件優(yōu)化方面提高一步菌的生產(chǎn)性能之外，還包括從G oxydans WSH-003中篩選比文獻(xiàn)報(bào)道常用的強(qiáng)啟動(dòng)子(G oxydans 621H中的Ptuf)更強(qiáng)的啟動(dòng)子和系列梯度啟動(dòng)子用于代謝工程改造。
[0003]本發(fā)明根據(jù)G oxydans WSH-003的基因組測(cè)序結(jié)果，結(jié)合其基因組測(cè)序注釋和高同源性菌株G oxy dans 621H等的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，查找可能的強(qiáng)組成型基因啟動(dòng)子并用生物信息學(xué)進(jìn)行軟件初步檢測(cè)，然后再運(yùn)用報(bào)告基因在G oxydansWSH-003中進(jìn)行鑒定，繼而最終獲得強(qiáng)啟動(dòng)子和系列梯度啟動(dòng)子。
[0004]目前國(guó)內(nèi)在氧化葡萄糖酸桿菌啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平的研究較少，而大多集中于菌體改良和誘變、重要脫氫酶學(xué)性質(zhì)的研究上。因此，本發(fā)明從mRNA水平研究菌體的基因表達(dá)調(diào)控，篩選調(diào)控元件，進(jìn)而為氧化葡萄糖酸桿菌的代謝調(diào)控提供強(qiáng)力支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一組來(lái)源于氧化葡萄糖酸桿菌的強(qiáng)啟動(dòng)
了:Ptuf-WSH003、Psldh、Ppsldh、Psod、^aldh0
[0006]所述啟動(dòng)子Ptuf-WSHQQ3、Psldh、Ppsldh、PS()d、Paldh 的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.USEQID N0.3, SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6 所示。
[0007]所述強(qiáng)啟動(dòng)子Ptuf-ws_，是比以往文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的最強(qiáng)的Gluconobacteroxydans 621H 中的 Ptuf-62iH 還強(qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子(Merfort, M.，et al., High-yield5-keto-D-gluconic acid formation is mediated by soluble and membrane-boundgluconate-5-dehydrogenases of Gluconobacter oxydans, in Appl MicrobiolBiotechnol2006.p.443-51)。通過(guò)啟動(dòng)子截短方法，確定了其核心序列，是SEQ ID N0.1所示序列的450_599bp。
[0008]本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種來(lái)源于氧化葡萄糖酸桿菌的強(qiáng)度梯度強(qiáng)啟動(dòng)子，由 Ptuf-WSH003、Ptuf-621H、PsldhΛ PpsldhΛ Psod、Paldh 中兩種或兩種以上強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子構(gòu)成。所述啟動(dòng)子Ptuf?Q3、Ptuf-621H、Psldh、Ppsldh、Psml、Paldh 的核苷酸序列分別如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2, SEQ ID N0.3, SEQ ID N0.4, SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.6 所示。[0009]所述6 種啟動(dòng)子構(gòu)成了強(qiáng)度梯度是 Ptuf-ws_>Ptuf-621H>Psldh ^ Ppsldh ^ Psod>Paidh 的強(qiáng)度梯度啟動(dòng)子。
[0010]所述強(qiáng)度梯度啟動(dòng)子可用于氧化葡萄糖酸桿菌的基因或代謝工程改造。
[0011]本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種在G oxydans中篩選梯度啟動(dòng)子和強(qiáng)啟動(dòng)子的方法。
[0012]所述方法包括以下步驟:
[0013](I)根據(jù)G.0xydans基因組序列,挑選G.0xydans中央代謝途徑酶基因與上一個(gè)基因的ORF之間的所有核苷酸片段；
[0014](2)采用啟動(dòng)子在線評(píng)測(cè)軟件，對(duì)可能的啟動(dòng)子序列進(jìn)行評(píng)分；
[0015](3)將獲得的高評(píng)分值的潛在強(qiáng)啟動(dòng)子，通過(guò)融合PCR與EGFP進(jìn)行連接，然后連接到廣宿主型載體PBBR1MCS2，構(gòu)建成重組載pBBRlMCS2-promoter-egfp ；
[0016](4)將重組載體通過(guò)三親本雜交的方法導(dǎo)入G.0xydans細(xì)胞，利用熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，獲得不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。 [0017]本發(fā)明篩選出一系列梯度啟動(dòng)子，通過(guò)不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子之間的組合，可以調(diào)控不同酶的表達(dá)強(qiáng)度。為氧化葡萄糖酸感覺(jué)的基因和代謝工程改造，特別是在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，提供了新的思路。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為G oxydans WSH-003中的強(qiáng)啟動(dòng)子的篩選過(guò)程。
[0019]圖2為4個(gè)不同梯度類(lèi)型強(qiáng)弱的啟動(dòng)子的熒光檢測(cè)菌株在各自熒光最大值時(shí)的熒光鏡檢圖。
[0020]圖3為圖2中4個(gè)不同梯度類(lèi)型的啟動(dòng)子熒光檢測(cè)菌株的熒光酶標(biāo)儀的定量檢測(cè)。
[0021]圖4為利用啟動(dòng)子序列截短方法構(gòu)建的各檢測(cè)菌株的熒光強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1啟動(dòng)子的挑選
[0023]G oxydans中含有與葡萄糖、甘油、山梨醇等代謝有關(guān)的多種重要脫氫酶，這些酶可能具有潛在的強(qiáng)組成型表達(dá)啟動(dòng)子，如山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase)、膜結(jié)合的醒脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)、膜結(jié)合的葡萄糖脫氫酶(membrane-boundglucose dehydrogenase)等的啟動(dòng)子。此外，選取文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的最強(qiáng)的Gluconobacteroxydans 62IH中的Ptuf_621H作為對(duì)照。根據(jù)G.0xydans WSH-003基因組序列信息(GenBankaccession N0.ΑΗΚΙ00000000)，選取目的基因與上一個(gè)基因的ORF (開(kāi)放閱讀框)之間的所有核苷酸片段，然后根據(jù)啟動(dòng)子軟件(http://www.softberry.com)評(píng)測(cè)出的啟動(dòng)子區(qū)域的得分，挑選分值較高的啟動(dòng)子，運(yùn)用EGFP作為報(bào)告基因進(jìn)行鑒定。
[0024]實(shí)施例2表達(dá)載體pBBRlMCS2-promter_egfp的構(gòu)建
[0025]根據(jù)G.0xydans WSH-003 基因組序列信息(GenBank accessionN0.ΑΗΚΙ00000000)，設(shè)計(jì)融合PCR引物，分別擴(kuò)增獲得高評(píng)分的啟動(dòng)子核苷酸序列和加強(qiáng)綠色熒光蛋白egfp的基因序列(egfp基因序列包括終止子，序列見(jiàn)SEQ ID N0.7)，然后通過(guò)融合PCR進(jìn)行連接,得到兩端帶有酶切位點(diǎn)的promoter-egfp,進(jìn)行T-A克隆并測(cè)序,將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆連接帶有相同酶切位點(diǎn)的廣宿主型載體PBBR1MCS2，構(gòu)建成表達(dá)載體pBBRlMCS2-promter-egfp (圖1)。
[0026]實(shí)施例3熒光蛋白重組檢測(cè)菌株的構(gòu)建
[0027]用三親本雜交的方法將測(cè)序驗(yàn)證正確的各克隆表達(dá)載體pBBRlMCS2-promoter-egfp導(dǎo)入G.0xydans WSH-003 (保藏于江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源和信息中心，編號(hào)為CICM-CU B7004)中。含有重組表達(dá)載體的E.coli JM109作為供體菌，含有接合輔助質(zhì)粒PRK2013的E.coli HBlOl作為輔助菌。G.0xydans WSH-003生長(zhǎng)到 OD600 = 0.9，E.coli 生長(zhǎng)到 OD600 = 0.8。取 E.coli JM109 和 E.coli HBlOl 各 Iml 混合，離心，用2ml LB重懸菌體與4ml G.0xydans WSH-003混合、離心,用0.8ml Y-S培養(yǎng)基(酵母浸膏20g/L，山梨醇80g/L)重懸菌體，將菌液涂布在含有濾紙但不含抗生素的Y-S固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)24h。將濾紙上長(zhǎng)出的菌用無(wú)菌水洗脫后涂布在含氨芐西林和頭孢西汀霉素的平板上 ，30°C培養(yǎng)2-4天，挑取抗性菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證。
[0028]實(shí)施例4重組菌株的熒光檢測(cè)
[0029]將驗(yàn)證正確的各陽(yáng)性菌株G.0xydans WSH-003 pBBRlMCS2-promoter_egfp 接種于Y-S培養(yǎng)基，取各熒光檢測(cè)菌株1.25ml種子液于含有25ml山梨醇培養(yǎng)基的250ml搖瓶(kana, 20ug/ml 頭孢 50ug/ml) 30°C培養(yǎng)。在 4h、16h、24h、32h 分別取 2ml 菌液，運(yùn)用 PBS 洗滌3次，去除培養(yǎng)基雜質(zhì)和死細(xì)胞。用NUNC96孔黑色酶標(biāo)板進(jìn)行熒光檢測(cè)，運(yùn)用96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行0D_檢測(cè)(熒光和0D_檢測(cè)均做4個(gè)復(fù)孔，每孔加入200ul檢測(cè)液)，所用儀器為BioTek Synergy4多功能酶標(biāo)儀，操作軟件為Gen5。熒光強(qiáng)度參數(shù)設(shè)置為，激發(fā):488/9nm發(fā)射:509/9nm，頂端發(fā)光，氚氣燈，增益為自動(dòng)調(diào)整增益。0D_參數(shù)設(shè)置為，吸收光波長(zhǎng)600nm，并選擇調(diào)整光程。最后，運(yùn)用熒光顯微鏡進(jìn)行熒光鏡檢(圖2)。
[0030]根據(jù)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)的熒光值(圖3)，并結(jié)合熒光鏡檢圖進(jìn)而篩選G.0xydansWSH-003中的強(qiáng)啟動(dòng)子和系列強(qiáng)度不同的梯度啟動(dòng)子。
[0031]最終獲得轉(zhuǎn)錄延伸因子Tu (elongation factor Tu)的啟動(dòng)子Ptuf,山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase)的啟動(dòng)子 Psldh,山梨醇脫氫酶前體(sorbitol dehydrogenaseprecursor)的啟動(dòng)子Ppsldh,膜結(jié)合的醒脫氫酶(aldehyde dehydrogenase)的啟動(dòng)子Paidh,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)的啟動(dòng)子PS()d，和文獻(xiàn)中常用的強(qiáng)啟動(dòng)子Gluconobacter oxydans 621H 中的 Ptuf_621H。上述啟動(dòng)子的強(qiáng)度順序?yàn)?Ptuf_WSH(l(l3>Ptuf_621H>P
sldh ^ Ppsldh ^ Psod〉Paldh。
[0032]實(shí)施例5強(qiáng)啟動(dòng)子Ptuf_WSI_3的核心序列鑒定
[0033]Ptuf-wsHoos的啟動(dòng)子所在核苷酸序列總長(zhǎng)度為599bp,利用啟動(dòng)子分段截短策略,分別PCR得到起始密碼子上游100bp、150bp、200bp、250bp、300bp和400bp的核苷酸片段，并用全長(zhǎng)599bp的核苷酸片段作為陽(yáng)性對(duì)照。將以上各片段連接egfp基因，并構(gòu)建表達(dá)載體pBBRlMCS2-pr0mter-egfp和熒光蛋白重組檢測(cè)菌株，構(gòu)建方法分別與實(shí)施例2和實(shí)施例3相同。然后，運(yùn)用實(shí)施例4的方法檢測(cè)重組菌的熒光強(qiáng)度，檢測(cè)時(shí)間都統(tǒng)一在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期(第16小時(shí))，并以G.0xydans WSH-003為陰性對(duì)照菌株。鑒定結(jié)果顯示(參見(jiàn)圖4)，Ptuf_ffSH003啟動(dòng)子在其起始密碼子上游150bp處就具有啟動(dòng)egfp基因轉(zhuǎn)錄的活性，而這與先前的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件(softberry軟件為常用的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件，其對(duì)細(xì)菌的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度和特異性可以達(dá)到80% )所得結(jié)果非常接近(-35區(qū)存在于起始密碼子上游147bp處，序列為CTGAAG，-10區(qū)存在于上游127bp處，序列為AGTCACTAT)。因此，結(jié)合啟動(dòng)子截短的結(jié)果和軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，該啟動(dòng)子的核心區(qū)域在其起始密碼子150bp處(Seql中450-599bp)。
[0034]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如 上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種來(lái)源于氧化葡萄糖酸桿菌的強(qiáng)啟動(dòng)子，其特征在于，是核苷酸序列如SEQ IDN0.1 的 Ptuf_ws_、SEQ ID N0.3所示的Psldh、SEQ ID N0.4 所示的 Ppsldh、SEQ ID N0.5 所示的Psod 或 SEQ ID N0.6 所示的 Paldh。
2.一種來(lái)源于氧化葡萄糖酸桿菌的梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子，其特征在于，由Ρω?ο3、Ρω-621Η、Psldh、Ppsldh、^sodΛ Paldh
中兩種或兩種以上強(qiáng)度不同的啟動(dòng)子構(gòu)成；所述啟動(dòng)子 Ptuf—WSH003、Ρω-621Η、Ρ—、Ρρ—、Ρ^、Ρ—的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2,SEQ ID N0.3,SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的梯度強(qiáng)度啟動(dòng)子，其特征在于，由所述6種啟動(dòng)子構(gòu)成，啟動(dòng) 子強(qiáng)度梯度是 Ptuf-WSH003〉Ptuf-621H〉Psldh ^ Ppsldh ^ P sod〉Paldh。
4.一種篩選梯度啟動(dòng)子和強(qiáng)啟動(dòng)子的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)根據(jù)氧化葡萄糖酸桿菌的基因組序列，挑選中央代謝途徑酶基因與上一個(gè)基因的ORF之間的所有核苷酸片段； (2)采用啟動(dòng)子在線評(píng)測(cè)軟件，篩選潛在的啟動(dòng)子序列； (3)將獲得的潛在的啟動(dòng)子序列，通過(guò)融合PCR與EGFP進(jìn)行連接，然后連接到廣宿主型載體 pBBRlMCS2，構(gòu)建成重組載 pBBRlMCS2-promoter-egfp ； (4)將重組載體通過(guò)三親本雜交的方法導(dǎo)入G.0xydans細(xì)胞，利用熒光顯微鏡和熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，獲得不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的強(qiáng)啟動(dòng)子在氧化葡萄糖酸桿菌基因或代謝工程改造中的應(yīng)用。
6.攜帶權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子的載體或基因工程菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103966217SQ201410184839
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】陳堅(jiān), 周景文, 胡于東, 堵國(guó)成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)