豬肌肉組織特異性誘導表達系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及一種肌肉組織特異性表達系統(tǒng)的構建，該系統(tǒng)是由豬的骨骼肌特異性表達基因α-actin的核心啟動子與蛻皮素誘導表達系統(tǒng)構成，達到既可以在肌肉中特異性表達目的基因又可對目的基因的表達進行精確表達。其特征是：將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)中的調節(jié)質粒替換為豬骨骼肌特異性表達基因的核心啟動子區(qū)域，將β-半乳糖苷酶報告基因插入到蛻皮素誘導系統(tǒng)反應質的多克隆位點，以兩個重組載體作為組織特異性誘導表達系統(tǒng)共轉染到小鼠C2C12細胞以及肌管。本發(fā)明構建的系統(tǒng)統(tǒng)具有獨立啟動活性兼肌肉組織特異性，可在誘導時間和誘導劑量的作用下調控目的基因的表達。
【專利說明】豬肌肉組織特異性誘導表達系統(tǒng)
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物基因工程【技術領域】，具體涉及到豬骨骼肌特異性啟動子a -actin與蛻皮素誘導表達系統(tǒng)結合構造為肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)，并對該系統(tǒng)是否同時兼?zhèn)浣M織特異性與可誘導性進行功能驗證。
【背景技術】
[0002]啟動子作為真核生物基因表達調控的順式作用元件，其含有基因表達調控網絡的重要信息，決定了基因表達的強度及特異性(Kim等，2005)。外源基因在機體中能否高效穩(wěn)定地表達是基因工程研究的關鍵。在真核細胞中利用基因工程技術構建多種真核表達系統(tǒng)進行外源基因的表達已經是一項常用的技術，但是經常面臨的問題是外源基因的表達量較低，且表達往往存在于機體的幾乎所有組織中。目前，外源基因在肌肉中表達主要是應用了巨細胞病毒(CMV)啟動子，雖然CMV啟動子高效，但其表達外源基因幾乎沒有細胞特異性(JeiOme等，2004 ;謝娜等，2006)，因此，在轉基因豬的應用中受到很大限制。考慮到轉基因豬后期應用的生物安全性，更適合選取自然界存在的肌肉特異性啟動子。
[0003]為了驅動外源基因在組織中表達，目前的研究中應用得最多的是巨細胞病毒(CMV)啟動子。CMV啟動子具有作用高效的特點，但缺點是在啟動外源基因表達的時候具有廣譜特性(Jerome et al2004 ;謝娜等2006)，這種非特異性的特點使得它在制備轉基因動物的應用中受到了很大限制。要想將轉基因動物應用于生產實踐，必須要具有嚴格的生物安全性，構建質粒的啟動子最好是動物體中本身就存在的特異性啟動子。因此，在研究相關的基因在肌肉發(fā)育過程中的作用以及對肌肉所形成的影響，這在人類疾病的治療方面以及在轉基因豬的研究和應用中的前景尤其可觀。鑒于組織特異性啟動具備這樣的特質，在基因工程中越來越獲得研究者的青睞(MetZger2001)。
[0004]外源基因在細胞或生物體中的表達需要進行嚴格控制，在保證具有生物有效性的同時，一方面需要保證對生物體沒有毒副作用以及基因的穩(wěn)定表達，另一方面需要解決的問題是要定時定量的調控外源基因的表達，即具備嚴格的時間和空間的特異性。因此，分離和構建較高活性組織特異性啟動子和能夠在特定時間調控外源基因進行表達的誘導系統(tǒng)成為研究的熱點。
[0005]通過真核表達系統(tǒng)進行外源基因的表達，在基因工程中是一項常用的技術手段。目前我們的研究重點是如何使轉入的目的基因在特定組織中或在發(fā)育階段能夠特異表達，同時在表達時還能受表達時間和表達量的控制。一般效果較顯著的方式就是進行轉錄水平的調控，也就是通過在外源基因的上游建立一個有效的“基因開關”，這可使該調控系統(tǒng)準確地控制基因定量、定時和定位轉錄表達。
[0006]因此獲得既能高效率特異性表達目的基因又能在今后的轉基因動物中有效地降低生物安全性隱患的表達質粒成為目前亟待解決的問題。
[0007]利用肌肉特異性啟動子，通過構建相應的表達質粒，能夠開啟基因固定于肌肉中表達。通過外源基因的蛋白或RNAs在骨骼肌中的表達可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的質量。例如可利用肌肉特異性的啟動子攜帶目的MicroRNA特異性的靜默其靶基因在肌肉中的表達而不影響其他組織此基因的正常表達，有效的獲得目的基因對于肌肉組織的作用；同時可以利用肌肉組織特異性的啟動子來研究那些通過QTL圖譜定位及表達分析獲得的可用于提高肌肉量的候選基因。但其肌肉的缺點是表達效率較低，個體間差異較大，所以，提高外源基因在肌肉組織中的表達具有重要的意義。
[0008]激活基因表達或者使基因表達失活，是化學誘導表達系統(tǒng)在確定基因功能及生物技術中常被利用的工具。基因表達的精確調控是化學誘導系統(tǒng)的重要方面。較早開始研究的四環(huán)素調控系統(tǒng)，以四環(huán)素類藥物作為調節(jié)物，有效地調控外源基因在特定組織的表達。目前，人們已開始嘗試將該系統(tǒng)用于基因治療。其缺點在于，殘留于動物骨骼上的四環(huán)素難于清除，以及四環(huán)素自身的藥代動力學性質也會影響系統(tǒng)對基因表達快速、精確、高效的控制。有學者用蛻皮類固醇(ecdysteroid)作誘導物構建的轉錄激活系統(tǒng)-蛻皮素類固醇誘導系統(tǒng)(ecdysteroid-1nducible system),克服了上述缺陷,在誘導物的清除和藥代動力學方面都有了較大的進展。該系統(tǒng)的作用原理是:經過修飾的蛻皮素受體因子VpEcR(包含DNA結合區(qū)和VP16激活 區(qū))以及其天然配體USP (ultraspiral protein,超螺旋蛋白)在哺乳動物中的同源物RXRCretinoic X receptor,維A酸X線受體)，在脫皮素或者其類似物幕黎留酮(muristerone)等誘導劑存在時,會迅速結合成異源二聚體VpEcR-RXR。該二聚體的產生可激活反應質粒中包含有其反應元件EcRE的啟動子,進一步開啟由該啟動子引導的目的基因的轉錄。(Wakita2001)。
[0009]隨著轉基因技術的發(fā)展，特別是其在基因治療的應用中，要求對外源基因的表達水平進行嚴格控制，在保證其生物有效性的同時，又要保證不產生毒副作用。因此獲得既能特異性較強，表達效率較高又能在今后的轉基因動物有效的降低生物安全性隱患的啟動子成為許多研究者亟待解決的問題。
[0010]到目前為止，除 申請人:之外，仍沒見到組織特異性表達目的基因并且可在時間和空間上定時定量的調控目的基因表達且對無生物安全隱患的表達質粒的報道。所以 申請人:針對該問題通過將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)中具有可廣譜啟動目的基因表達的CMV啟動子替換為豬骨骼肌特異性a -actin啟動子，并對構建的豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)進行細胞水平的功能驗證，以期能夠更好地利用該肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)，并為今后的基因治療提供一種研究手段。

【發(fā)明內容】

[0011]本發(fā)明的目的在于構建一種豬肌肉組織特異性誘導表達系統(tǒng)，即a -actin啟動子介導的肌肉-蛻皮素誘導表達系統(tǒng)，將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)中具有可廣譜啟動目的基因表達的CMV啟動子替換為豬骨骼肌特異性a-actin啟動子的核心片段( 申請人:將該片段命名為Q8片段)，并對構建的豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)進行細胞水平的功能驗證，以期能夠更好地利用該肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)，并可將其它基因在體內的表達水平定量的在體外進行模擬，為基因的功能研究提供了一種新的研究手段。
[0012]本發(fā)明將 申請人:已驗證的具有肌肉組織特異性的大白豬的a-actin基因啟動子為目的啟動子，將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)中具有可廣譜啟動目的基因表達的CMV啟動子替換為豬骨骼肌特異性a -actin啟動子( 申請人:將該啟動子命名為pVg_8)，同時構建以β -半乳糖苷酶為報告基因的反應質粒PlND-LacZ的表達質粒，將兩個質粒pVg-8/pIND-LacZ共轉染C2C12細胞及分化后的C2C12細胞，通過在不同誘導劑濃度和誘導時間下檢測兩種細胞表達β_半乳糖苷酶的相對活性，從而驗證該表達系統(tǒng)同時具備組織特異性和基因表達的可調控性。
[0013]本發(fā)明通過以下技術實現(xiàn):
[0014]本發(fā)明的總體技術路線見圖1所示。
[0015]根據已報道豬骨骼肌特異性基因a -actin核心區(qū)設計本發(fā)明的啟動子，利用PCR法從大白豬的基因組中分離獲得肌肉組織特異性啟動子a-actin核心片段( 申請人:將其命名為啟動子Q8)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。蛻皮素誘導系統(tǒng)由兩部分組成:一個是調節(jié)質粒PVgRXR(見圖2)，另一個是反應質粒pIND(圖3)，將a-actin基因的核心啟動子替換為蛻皮素誘導系統(tǒng)中調節(jié)質粒pVgRXR中的CMV啟動子， 申請人:將該重組質粒命名為調節(jié)質粒pVg-8，將LacZ報告基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)連接到蛻皮素誘導系統(tǒng)中的反應質粒PlND的多克隆位區(qū)， 申請人:將其命名為反應質粒PlND-LacZ ;將質粒pVg-8和pIND-LacZ穩(wěn)定轉染C2C12細胞，并對篩選出的陽性克隆細胞擴大培養(yǎng)后進行誘導分化為肌管，β-半乳糖苷酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)該誘導表達系統(tǒng)在誘導劑Ponasterone A濃度相同的情況下,分化的C2C12細胞中β -半乳糖苷酶活性顯著高于同等條件下C2C12細胞。并且在分化后的C2C12細胞中β -半乳糖苷酶活性隨誘導時間的增加活性增強；
[0016]綜上實驗結果顯示，構建的肌肉-蛻皮素誘導表達系統(tǒng)不僅保持著a-actin啟動子肌肉組織特異性的功能，還可在外源基因的表達上進行可誘導性的調控。
[0017]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0018]首先是肌肉-蛻皮素誘導表達系統(tǒng)中調節(jié)質粒pV-8的構建:在前人研究的基礎上選擇具備骨骼肌特異性的表達基因a-actin (GenBank登錄號:100154254)。利用Primer5設計帶有相應限制性內切酶位點的引物，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增啟動子區(qū)域(a -actin基因調控序列上游1089bp~826bp的核心序列為目的啟動子， 申請人:將其命名為Q8啟動子)，將Q8啟動子片段裝載到pMD18-T質粒多克隆位點(pMD 18-T質粒圖及多克隆位點等信息見圖4)處， 申請人:將改造后的質粒命名為T-Q8 ^fpVgRXR質粒中CMV片段(位于pVgRXR質粒中2265bp-2883bp)上游1620bp序列(命名為ZP片段，其核苷酸序列如SEQID NO:3所示)PCR克隆并連接到pMD18-T質粒上，裝配成中間質粒(命名為T-ZP)，再通過酶切、DNA連接等技術將ZP片段連接到Q8啟動子的上游，構建得到中間質粒T-ZP-Q8，最終將ZP-Q8片段連接到用同樣內切酶酶切的pVgRXR質粒中，裝配成最終調節(jié)質粒pVg-8 (見圖5)；
[0019]其次，在反應質粒pIND的改造上，利用酶切手段和PCR技術從pORF_LacZ質粒中(原始質粒信息見圖6)獲取LacZ基因，并裝配成pIND-LacZ質粒。通過脂質體介導的轉染法將pVg-8/pIND-LacZ表達系統(tǒng)穩(wěn)定轉染C2C12細胞，并在得到穩(wěn)定細胞系時將C2C12細胞進行分化為肌管。 具體步驟為:首先在誘導劑Ponasterone A (購于云南西力生物技術有限公司)濃度為10 μ M，誘導時間分別設定為8h、12h、16h、24h、36h、48h、72h時，檢測該誘導系統(tǒng)在C2C12細胞與分化后的肌管中β_半乳糖苷酶的表達活性，見圖12 ;接著進行了在誘導劑Ponasterone A濃度分別在O μ Μ、8 μ Μ、16 μ Μ、24 μ Μ、36 μ M時該系統(tǒng)轉染C2C12細胞和肌管48h后檢測β_半乳糖苷酶活性(見圖13)，進而考察該肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)在不同細胞中的調節(jié)報告基因的表達能力以及誘導劑濃度對報告基因的可調控能力。為了再次驗證構建的肌肉特異性系統(tǒng)是否在肌管中特異表達，以分化第4天和分化第7天的C2C12細胞(同為肌管)為實驗對象，分別檢測當誘導劑Ponasterone A的濃度分別為8μΜ、16μΜ、24μΜ、36μΜ時的β-半乳糖苷酶活性(見圖14)，以誘導劑濃度為Ομ M時為對照組，以上實驗均每個時期測3個平行樣品，每個樣品檢測三次，結果取平均值。
[0020]檢測結果表明本發(fā)明構建的肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)具備基因表達的可調控性，并且該系統(tǒng)同時保持著肌肉組織的表達特異性。
[0021]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0022](I)本發(fā)明構建的豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)pVg-8/pIND-LacZ經實驗驗證同時具備肌肉特異性和基因表達時間和空間的可調控性，為其它基因的功能研究提供了有利的試驗基礎。
[0023](2)本發(fā)明構建的肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)中的誘導劑Ponasterone A是一種無毒無致畸性的藥物，可在生物體24h內清除干凈，為下一步轉基因動物制備的生物安全性提供了保障。
[0024]更詳細的技術方案參見《【具體實施方式】》的內容。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]序列表SEQ ID N O:1是豬骨骼肌特異表達基因a -actin的上游調控核苷酸序列克隆得到的核心啟動子( 申請人:將其命名為Q8啟動子)的核苷酸序列，序列長度為263bp。
[0026]序列表SEQ ID NO:2是從蛻皮素誘導表達系統(tǒng)的調節(jié)質粒pVgRXR中克隆得到的CMV啟動子上游的核苷酸序列，序列長度為1620bp。
[0027]序列表SEQ ID NO:3是從pORF-LacZ質粒中獲得的報告基因LacZ的核苷酸序列，序列長度為3171bp。
[0028]圖1:本發(fā)明的技術路線圖(顯示各質粒的具體構建和改造過程)。
[0029]第一，以pVgRXR質粒為模板，PCR擴增ZP片段，并將ZP片段克隆到pMD18_T上構建成T-ZP質粒；
[0030]第二，將pVgRXR質粒用Pst I進行酶切，回收6000bp左右的較大片段；
[0031]第三，PCR擴增Q8啟動子，將其克隆到PMD18-T上構建成T-Q8質粒；用Sph I /Not I酶切T-Q8質粒和T-ZP質粒，并將ZP片段回收后連接到同樣酶切后的T-Q8質粒中，構建成T-ZP-Q8質粒。
[0032]第四，用Pst I酶切T-ZP-Q8質粒后，回收ZP-Q8片段(片段長為1883bp)，并將其連接到第二步中酶切回收后的PVgRXR大片段中(6000bp左右的大片段)。
[0033]圖2:質粒pVgRXR圖譜。
[0034]圖3:質粒pIND圖譜。
[0035]圖4:商購質粒pMD18-T圖譜。
[0036]圖5:重組質粒pVg-8的圖譜。
[0037]圖6:是本發(fā)明應用的商購的原始質粒PORF-LacZ的圖譜，該質粒含有標記基因LbcZ 0[0038]圖7:骨骼肌特異性啟動子a -actin核心區(qū)域Q8的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:1、2、3均為Q8片段
[0039]圖8:pVgRXR質粒中CMV啟動子上游片段ZP的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:1、2均為ZP片段
[0040]圖9:質粒T-ZP-Q8的Pst I單酶切鑒定檢測瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:I為酶切后的T-ZP-Q8質粒。
[0041]圖10:質粒pVg-8經Pst I單酶切鑒定檢測瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:I未酶切的pVg-8質粒；2為酶切后的pVg-8質粒。
[0042]圖11:是原始質?？?1^-]^102經!1;[11(1111和1^1]1!1 I酶切回收檢測得到的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:I為酶切后的PORF-LacZ質粒。
[0043]圖12:質粒pIND-LacZ經Hind III和BamH I酶切鑒定檢測瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中各泳道為:1為酶切后的pIND-LacZ質粒，2為未酶切的pIND-LacZ質粒。
[0044]圖13:誘導劑Ponasterone A在不同誘導時間內對C2C12細胞和肌管內的β-GaL的活性檢測。
[0045]圖14:誘導劑Ponasterone A不同誘導濃度對C2C12細胞和肌管內的β -GaL的表達量檢測。
[0046]圖15:誘導劑Ponasterone A不同誘導濃度對分化4天和7天的肌管中β -GaL的表達量檢測。
[0047]圖16:是β -半乳糖苷酶標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0048]實施例1:豬的骨骼肌特異性表達基因a -actin的啟動子核心片段的獲得
[0049]利用報道的豬的a -actin基因啟動子的核心序列在基因調控序列-1089bp~_821bp區(qū)域(GenBank登錄號:100154254),利用Primer5通過設計特異件引物(actinF:ATAAGAATGCGGCCGCCCAGCCCGGGAGACACTC ；actinR:AACTGCAGGCTGCGGTGGCCGCTGGT，下劃線為酶切位點)，以大白豬的血液基因組DNA為模板，PCR擴增此段序列，其結果見圖 7。擴增條件為:94°C 5min，35*(94°C，40sec ；72°C，40sec ；72°C,30sec) ；72°C, IOmin ；25°C，2min。擴增產物用1.5%瓊脂糖電泳檢測，利用北京博大泰克生物基因技術有限責任公司生產的UNIQ-1O柱式DNA膠回收試劑盒(按該試劑盒的說明書操作)回收純化目的片段，進行TA克隆。連接體系為:PCR產物5 μ L ；Ligation溶液IL 5 μ L ;質粒pMD18_TVector (購自寶生物工程大連有限公司)0.3 μ L，挑選陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序。將測序正確的陽性克隆擴大培養(yǎng)，抽提質粒(用TIANGEN公司的TIANpreMini Plasmid Kit操作)，將該質粒命名為T-Q8，置于_20°C備用。
[0050]對pVgRXR質粒(購自購自invitrogen公司)中CMV啟動子上游1620bp(命名為ZP片段)添加合適的酶切位點設計引物(引物序列如表1所示；PCR反應參數設置如表2所示)。其中actin-F/actin-R、ZP-F/ZP-R依次代表構建的包含Q8啟動子(見圖7)、ZP片段(見圖8)的上、下游引物，添加酶切位點(以下劃線表示)，同時攜帶保護性堿基(以陰影表示)；PCR擴增模板為測序正確的T-ZP質粒。得到擴增產物Q8、ZP之后，連接到PMD18-T (購自寶生物工程(大連)有限公司)，將所得質粒分別命名為T-Q8、T-ZP。LacZ序列片段直接由質粒PORF-LacZ上的Hind III和EcoR I進行酶切(見圖11)，然后連接到Hind III和EcoR I酶切后的pIND質粒(圖3)中。
[0051]表1重組質粒PVg-8各片段引物設計
[0052]
【權利要求】
1.一種豬肌肉-蛻皮素特異性誘導表達的啟動子Q8，其特征在于該啟動子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.—種構建豬肌肉-蛻皮素特異性誘導表達系統(tǒng)的方法，其特征在于下列步驟: A、調節(jié)質粒pV-8的構建: 根據骨骼肌特異性的表達基因a-actin序列，利用Primerf設計帶有相應限制性內切酶位點的引物，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增啟動子區(qū)域，即α-actin基因調控序列上游1089bp~826bp的核心序列為目的啟動子Q8，將啟動子Q8片段裝載到質粒pMD18_T多克隆位點處，得到中間質粒T-Q8 ;將位于pVgRXR質粒中2265bp-2883bp的上游1620bp的序列命名為ZP片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，利用PCR克隆并連接到pMD18_T質粒上，裝配成中間質粒T-ZP，通過酶切、DNA連接將ZP片段連接到Q8啟動子的上游，構建得到中間質粒T-ZP-Q8，將ZP-Q8片段連接到用同樣內切酶酶切的pVgRXR質粒中，裝配得到含有豬肌肉特異性啟動子的調節(jié)質粒pVg-8，并將其作為豬肌肉-蛻皮素特異性誘導表達系統(tǒng)的調節(jié)質粒； B、反應質粒pIND-LacZ的構建:從pORF_LacZ質粒中用限制性內切酶HindIII /BamHI獲取LacZ基因，并與Hind III /BamH I酶切后的pIND質粒裝配成pIND-LacZ質粒，并將其作為豬肌肉-蛻皮素特異性誘導表達系統(tǒng)的反應質粒； C、將質粒pVg-8和pIND-LacZ共轉染C2C12細胞及分化后的C2C12細胞，并對篩選出的陽性克隆細胞擴大培養(yǎng)后進行誘導分化為肌管，利用β_半乳糖苷酶報告系統(tǒng)檢測該誘導表達系統(tǒng)中C2C12細胞中β -半乳糖苷酶的活性，構建得到包含調節(jié)質粒pVg-8和反應質粒pIND-LacZ的豬肌肉-蛻皮素特異性誘導表達系統(tǒng)； 其中: 啟動子Q8的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
3.權利要求1所述的啟動子Q8在構建的蛻皮素-肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK103923924SQ201410185208
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權日:2013年9月19日
【發(fā)明者】蔣思文, 楊永蘭 申請人:華中農業(yè)大學