一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用，根據(jù)中國(guó)水仙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)得到的幾丁質(zhì)酶基因序列設(shè)計(jì)引物，從中國(guó)水仙中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因，其序列如SEQ?ID?NO：1所示，并轉(zhuǎn)譯出幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。在對(duì)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證該幾丁質(zhì)酶在水仙鱗莖基腐病、褐斑病和病毒病的誘導(dǎo)下，表達(dá)量均明顯升高，能應(yīng)用于水仙的抗病過(guò)程。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]中國(guó)水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙屬多年生鱗莖植物，其鱗莖頭大，花色豐富，花香馥郁，可室內(nèi)清水培養(yǎng)，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一。中國(guó)水仙具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是深受人們喜愛(ài)的傳統(tǒng)花卉之一。水仙在栽培過(guò)程中會(huì)感染多種病害，導(dǎo)致其觀賞性和商品性普遍退化，嚴(yán)重阻礙了水仙的生產(chǎn)和發(fā)展。因此，提高水仙自身的抗病性尤為重要。
[0003]幾丁質(zhì)酶是一種病程相關(guān)蛋白，廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中，能夠催化植物病原菌細(xì)胞壁的水解，使其原生質(zhì)外滲，從而抑制真菌的生長(zhǎng)與繁殖，提高植物的抗真菌能力。高等植物本身不含幾丁質(zhì)，但當(dāng)其受到細(xì)菌、真菌或病毒感染時(shí)，植物幾丁質(zhì)酶活性迅速提高，使植物對(duì)病原微生物的抗性增強(qiáng)。研究表明幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化黑麥草能夠提高植物對(duì)立枯絲核菌的抗性，轉(zhuǎn)入水稻、蘋(píng)果、葡萄、檸檬中分別提高對(duì)水稻紋枯病的抗性，蘋(píng)果爛黑星病、葡萄灰霉病的抗性和檸檬抗真菌病害能力。但目前尚未見(jiàn)有關(guān)中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因在水仙或植物抗病中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶，其序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因，其序列如SEQ ID N0:1所示。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因在抑制病原真菌侵染水仙中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用，根據(jù)已有的水仙轉(zhuǎn)錄組序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)找到幾丁質(zhì)酶基因序列保守區(qū)，得到的幾丁質(zhì)酶基因盒NBS基因序列，預(yù)測(cè)得到的幾丁質(zhì)酶基因序列設(shè)計(jì)引物，從中國(guó)水仙中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因，其序列如SEQ ID NO:1所示，并轉(zhuǎn)譯出幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。在對(duì)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)技術(shù)驗(yàn)證該幾丁質(zhì)酶在水仙鱗莖基腐病、褐斑病和病毒病的誘導(dǎo)下，表達(dá)量均明顯升高，能應(yīng)用于水仙的抗病過(guò)程。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶基因PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0012]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶疏水性分析圖；
[0013]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)圖；
[0014]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖；
[0015]圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖；
[0016]圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中幾丁質(zhì)酶多序列比對(duì)圖；
[0017]圖7是本發(fā)明實(shí)施例2中幾丁質(zhì)酶進(jìn)化樹(shù)分析圖；
[0018]圖8是本發(fā)明實(shí)施例2中中國(guó)水仙特異性表達(dá)分析圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0020]試驗(yàn)材料為中國(guó)水仙，品種為‘金盞銀臺(tái)’，于福建漳州水仙花產(chǎn)地分別取正常植株、水仙鱗莖基腐病、 褐斑病和病毒病植株的幼嫩葉片，用液氮速凍，置于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0021]實(shí)施例1
[0022](I)水仙葉片總RNA提取和cDNA的合成
[0023]總RNA的提取參考北京百泰克生物技術(shù)有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，取Iug的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA第一鏈合成試劑盒Trans Script IIFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。
[0024](2)目的片段的克隆
[0025]根據(jù)已有的水仙轉(zhuǎn)錄組序列，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)找到幾丁質(zhì)酶基因序列保守區(qū)，得到的幾丁質(zhì)酶基因盒NBS基因序列,用軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)特異引物，引物序列為:
[0026]Chit3-F:5/ -TCCGTGCCGTCGATAATATCGGAAG,
[0027]Chit3-R:5/ -GAAATGAAATAATGGAGGGGGAAAT。
[0028]丁質(zhì)酶基因PCR擴(kuò)增體系及程序:
[0029]PCR 擴(kuò)增總體系(25 μ I):模板 cDNAl μ 1，10XPCR Buffer (1.5mM MgCl2) 2.5 μ 1，1mmoI/L dNTPs0.5 μ 1，10mmol/L 上下游引物各 0.5 μ 1，5U/L Taq DNA 聚合酶 0.15 μ 1，無(wú)菌 ddH2019.85 μ I ο
[0030]PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 7min ;35 個(gè)循環(huán) PCR 擴(kuò)增(94°C, 30s ；56°C, 30s ；72°C, lmin) ;72°C，再延伸 1min0
[0031]擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，其中，M為DL為2000bp的Marker ;N1、N2為幾丁質(zhì)酶基因的保守區(qū)。
[0032]通過(guò)ORF Finder軟件預(yù)測(cè)該序列具有690bp的完整開(kāi)放讀碼框(ORF)，具有起始密碼子和終止密碼子，推測(cè)其為一條全長(zhǎng)cDNA序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，編碼230個(gè)氨基酸，其序列如SEQ ID NO:2所示，其中，IA FKTALWFWM序列部分表示幾丁質(zhì)酶第19家族信號(hào)區(qū)。
[0033](3)生物信息學(xué)分析
[0034]利用相關(guān)軟件分析幾丁質(zhì)酶基因和NBS基因編碼的氨基酸序列:用BLAST軟件(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列搜索；用 ProtParam 軟件(http://web.expasy.0rg/protparam/)預(yù)測(cè)基本的理化性質(zhì)；用 ProScal 軟件(http://web.expasy.0rg/protscale/)默認(rèn)算法(Hphob./Kyte&Doolittle)預(yù)測(cè)該蛋白的疏水性；用 TMHMM 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；用SignalP4.1Server 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)妝；應(yīng)用ProtScale 軟件(http://www.expasy.ch/tools/-protscale/)和 SOP-MA 軟件(http://npsa-pbil.1bcp.fr/cg1-bin/npsa—automat, pi)分別預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域；用 NCBI 的 Conserved Domains 軟件(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/Structure/)對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行保守區(qū)分析；選取部分植物幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行序列比對(duì)；用MEGA5.2構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0035]ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白分子量為25.4KD，理論等電點(diǎn)為9.04，所帶的正電荷總數(shù)(Arg+Lys)為27，負(fù)電荷總數(shù)(Asp+Glu)為20，為堿性蛋白。理論推導(dǎo)半衰期是30h，消光系數(shù)為47900，不穩(wěn)定指數(shù)為40.94，為不穩(wěn)定蛋白。
[0036]ProtScale軟件疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,該蛋白N-端第48位亮氨酸(L)的疏水性最強(qiáng)，第167位絲氨酸(S)的親水性最強(qiáng)，親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中，且多于疏水性氨基酸，可認(rèn)為該基因編碼蛋白為親水性蛋白，如圖2所示。根據(jù)NetPhos2.0Server推測(cè)，幾丁質(zhì)酶有7處絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，4處蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3處酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，如圖3所示。但該蛋白不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽。
[0037]PSOT Predict1n在線網(wǎng)站對(duì)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，該基因定位于細(xì)胞核的可能性為0.76，定位于微體的可能性為0.618，定位于線粒體基質(zhì)的可能性為
0.1。由此可見(jiàn)，幾丁質(zhì)酶定位在細(xì)胞核或微體(過(guò)氧物酶體)的可能性較大。
[0038]應(yīng)用SOPMA預(yù)測(cè)其編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖4所示，表明該蛋白以α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，分別為24.78%和59.13%，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角較少，分別為12.61 %和
3.48%。
[0039]結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明該基因編碼鏈具有典型的幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，如圖5所示，其中第57~70位氨基酸部分為富含甘氨酸和脯氨酸的交連區(qū)，第137~147位氨基酸部分為幾丁質(zhì)酶19家族信號(hào)區(qū)，隸屬于糖苷水解酶19家族，同時(shí)又與溶菌酶相似超家族基因的保守結(jié)構(gòu)域類(lèi)似，推測(cè)該基因兼具溶菌酶活性。
[0040](4)幾丁質(zhì)酶基因編碼氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析
[0041]利用NCBI網(wǎng)站經(jīng)Blast找到15條同源性較高的幾丁質(zhì)酶序列，多序列比對(duì)結(jié)果表明幾丁質(zhì)酶在幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)較為保守，如圖6所示。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，水仙同荷蘭芹親緣關(guān)系最近，說(shuō)明它們具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和功能，如圖7所示。
[0042]經(jīng)Blast 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列與油掠(Elaeis guineensis)、荷蘭芳:(Petroselinumcrispurn)的同源性分別為76%、73%,推測(cè)其為中國(guó)水仙的幾丁質(zhì)酶基因。
[0043]實(shí)施例2水仙幾丁質(zhì)酶在中國(guó)水仙中的特異性表達(dá)
[0044]為研究水仙幾丁質(zhì)酶基因?qū)λ苫?、病毒病及褐斑病的?yīng)答，本申請(qǐng)用qRT-PCR檢測(cè)了水仙幾丁質(zhì)酶基因在正常株、感病初期、重病期根、葉中的表達(dá)特性。其中，qRT-PCR檢測(cè)檢測(cè)具體步驟包括:
[0045]將η個(gè)反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物分別稀釋10倍做為模板，反應(yīng)體系為10 μ L:SYBR PremixEx 丁&9了]?(2\)5 4 1^1(^]\1上下游引物各0.2 4 1^ cDNA 模板 lyL，加 ddH20 至 10yL，每個(gè)樣品重復(fù)2次，其中對(duì)不同的引物還設(shè)有不加模板的陰性對(duì)照，以中國(guó)水仙看家基因Actin作為內(nèi)參。qPCR所用儀器為羅氏Light Cycler480，采用96聯(lián)板，反應(yīng)程序采用兩步法:95°C預(yù)變性30s，l個(gè)循環(huán)；95°C 5s,60°C 30s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)曲線和融解曲線(60~95°C )分析。采用IBM SPSS Statisics20和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0046]研究發(fā)現(xiàn)在褐斑病發(fā)病過(guò)程中，該基因在兩種中國(guó)水仙葉中的表達(dá)豐度均顯著提高，且該基因在金盞中葉的表達(dá)豐度顯著高于百葉。在基腐病發(fā)病過(guò)程中，該基因在兩種中國(guó)水仙根、葉中的表達(dá)豐度也均顯著提高，且根中的表達(dá)豐度顯著高于葉；金盞根中的表達(dá)豐度顯著高于百葉，但葉中的表達(dá)豐度卻顯著低于百葉。在病毒病發(fā)病過(guò)程中，該基因在百葉葉中的表達(dá)豐度均顯著提高，但在金盞葉中，在感病初期其的表達(dá)豐度與正常差異不顯著，在感病后期其表達(dá)風(fēng)度顯著提高，如圖8所示，其中，A基腐病植株；B褐斑病植株；(:病毒病植株。
[0047]幾丁質(zhì)酶存在于植物和微生物中，為單基因編碼，具有降解真菌細(xì)胞壁的作用，并且能夠與β_1，3-葡聚糖酶協(xié)同抑制真菌的生長(zhǎng)。根據(jù)植物幾丁質(zhì)酶前體蛋白氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征，將植物幾丁質(zhì)酶分為6類(lèi):1類(lèi)幾丁質(zhì)酶包含富含半胱氨酸的N-端幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)、富含脯氨酸的可變鉸鏈區(qū)和高度保守C-端催化區(qū)。幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)是高度保守區(qū)，能特異地與幾丁質(zhì)結(jié)合；11類(lèi)只具有催化區(qū)，缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)及絞鏈區(qū)；ΙΠ類(lèi)同樣缺少幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)，與I類(lèi)和II類(lèi)幾丁質(zhì)酶無(wú)序列同源性；IV類(lèi)與I類(lèi)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，同源性為41 %~45%，在血清學(xué)上可將兩者分開(kāi)；V類(lèi)結(jié)構(gòu)上與I類(lèi)的類(lèi)似，但N端含有2個(gè)重復(fù)排列的幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)類(lèi)包括煙草幾丁質(zhì)酶，這類(lèi)酶在氨基酸序列上與環(huán)狀芽孢桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌及褶皺鏈霉菌的幾丁質(zhì)酶相類(lèi)似，卻與I~V無(wú)同源性。通過(guò)對(duì)本發(fā)明獲得的水仙幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分析可知其屬于I類(lèi)幾丁質(zhì)酶。
[0048]本發(fā)明中水仙幾丁質(zhì)酶在水仙鱗莖基腐病、褐斑病和病毒病的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量均明顯升高，說(shuō)明其可能參與水仙的抗病過(guò)程。
[0049]相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明從中國(guó)水仙中克隆得到幾丁質(zhì)酶基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為提高中國(guó)水仙的抗病育種及相關(guān)研究提供基礎(chǔ)，填補(bǔ)了有關(guān)中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的研究空白。該幾丁質(zhì)酶基因能夠催化植物病原菌細(xì)胞壁的水解，使其原生質(zhì)外滲，從而抑制真菌的生長(zhǎng)與繁殖，提高植物的抗真菌能力。高等植物本身不含幾丁質(zhì)，但當(dāng)其受到細(xì)菌、真菌或病毒感染時(shí)，植物幾丁質(zhì)酶活性迅速提高，使植物對(duì)病原微生物的抗性增強(qiáng)。
[0050]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶，其特征在于，其序列如SEQ ID N0:2所示。
2.權(quán)利要求1所述的中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因，其特征在于，其序列如SEQIDNO:1所示。
3.權(quán)利要求2所述的中國(guó)水仙幾丁質(zhì)酶的編碼基因在抑制病原真菌侵染水仙中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK104130991SQ201410187036
【公開(kāi)日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】林曉紅, 潘東明 申請(qǐng)人:林曉紅