一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法：(1)采集氣溶膠樣本；(2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA；(3)檢測：進行PCR擴增；(4)建立標準曲線和溶解曲線：建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線；(5)判斷氣溶膠樣本中是否含有牛傳染性鼻氣管炎病毒。本發(fā)明還公開了特異性引物(如SEQIDNO.3、4所示)以及試劑盒(由特異性引物、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒pEASY-T3-D、SYBRGreenⅠ實時熒光定量PCR試劑和ddH2O組成)。本發(fā)明的方法，既可用于牛傳染性鼻氣管炎病毒氣溶膠樣本的檢測，也可用于臨床血液、奶樣、組織等樣本的檢測，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]牛傳染性鼻氣管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus,IBRV)是一種泛嗜性病毒，侵入牛體后可侵染并潛伏于多個部位，可引起牛多系統(tǒng)感染，使病牛長期帶毒并可在一定時期內排毒，造成牛群的大范圍感染。該病的主要傳染源為病牛以及無癥狀的帶毒牛，其傳播途徑為呼吸道、生殖道，病毒隨鼻、眼以及陰道分泌物、精液等排出體外。該病可通過被污染的空氣飛沫感染牛群，在過分擁擠、封閉式環(huán)境中更易快速傳播，對牛群肥育率、產奶量和繁殖影響極大。因此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將該病列為B類疾病，也是我國進境動物必檢疾病之一。
[0003]IBRV是雙鏈DNA病毒，有囊膜，基因組長約138kb，由一個長獨特區(qū)(UL，106kb)和一個短獨特區(qū)(Us，IOkb)及Us區(qū)兩側的重復序列(IRs和TRs，各llkb，序列相同但方向相反)組成。IBRV基因組至少編碼70個左右基因，其中有11種為糖蛋白。由于IBRV易形成潛伏感染，在臨床上不表現(xiàn)癥狀或表現(xiàn)輕微臨床癥狀，建立針對IBRV基因的PCR檢測方法，為流行病學調查、臨床 診斷、疫苗研制乃至疫病的控制及消除等方面都具有重要的意義。
[0004]PCR在病毒檢測上具有特異、靈敏、高效等特點，用PCR方法檢測病毒核酸，不受中和抗體的影響。而實時熒光定量PCR技術巧妙地利用了 PCR技術的DNA高效擴增、熒光技術高特異性和光譜技術的敏感性及實時定量分析的優(yōu)點，儀器自動分析，效率高、無后續(xù)處理，更有利于對低濃度的樣本進行檢測，極大地提高了檢測的敏感性和特異性，縮短了實驗時間、簡化了實驗操作。
[0005]氣溶膠是由懸浮于氣體介質中的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系，其粒徑一般為0.001-100 μ m。而懸浮在氣體(如空氣)中含有病毒的液態(tài)或固態(tài)微粒稱為病毒氣溶膠。隨著集約化、規(guī)模化畜牧生產的發(fā)展，病毒氣溶膠在病毒性傳染病傳播中所占的重要地位逐漸被人們所認識。牛傳染性鼻氣管炎病毒可通過污染的空氣傳播，阻礙了畜牧業(yè)生產效率的提高和發(fā)展。因此全面了解畜禽舍內外環(huán)境質量，對流行病的預防和監(jiān)控十分重要。
[0006]目前，關于細菌等空氣微生物氣溶膠采集及診斷方法的研究報道較多，由于病毒氣溶膠難以收集、濃度較低，且傳統(tǒng)檢測方法靈敏度低，故研究受限。迄今為止，還沒有應用SYBR Green I實時熒光定量PCR技術檢測氣溶膠載IBRV的研究報道。

【發(fā)明內容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明提供了一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，可以應用于牛場環(huán)境中IBRV的檢測，為牛傳染性鼻氣管炎病毒的流行病學調查及氣溶膠傳播方式的防控提供支撐。[0008]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0009]一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，步驟如下:
[0010](I)采集氣溶膠樣本；
[0011]進一步地，采集氣溶膠樣本的方法為:采用國際標準的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-1mpinger,簡稱AGI),以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集養(yǎng)殖場環(huán)境中的氣溶膠樣本；
[0012](2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA ；
[0013]進一步地，提取基因組總DNA的方法為:將采集到的IOmL氣溶膠樣本在4°C下12000r/min離心30min，取上清液lmL，應用病毒DNA試劑盒(商業(yè)化產品，現(xiàn)有技術中的常規(guī)試劑盒)提取基因組總DNA ；
[0014](3)檢測:以上述提取的基因組總DNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreen I實時熒光定量PCR，具體如下:
[0015]所述試劑盒由特異性引物、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒PEASY-T3-D、SYBRGreen I實時熒光定量PCR試劑(現(xiàn)有技術中已有的常規(guī)試劑)和ddH20組成；所述的SYBRGreen I 實時熒光定量PCR試劑盒為SYBR* Premix Ex Taq?II (TliRNaseHPlus)試劑盒(購自大連寶生物)。采用SYBRGreen I突光染料的方法,要比Taqman探針方法簡便,價格相對較低。
[0016]所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒pEASY-T3-D是由序列為SEQIDN0.5所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒，連接方法為所屬領域常規(guī)技術。
[0017]所述特異性引物的序列如下:
[0018]上游引物IBRV-F 為 5' -ACGGACGACGAGCTGGGACT-3'，如 SEQIDN0.3 所示；
[0019]下游引物IBRV-R 為 5’ -CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3’，如 SEQIDN0.4 所示。
[0020]擴增反應體系為20 μ L:2XSYBRPremixExTaqII10y L，模板2μ L，上游引物和下游引物各 0.5 μ L (終濃度均為 0.25 μ mol/L)，RNaseFreeddH207 μ L。
[0021]反應條件為:預變性95°C 30s，然后按照95°C變性5s、63°C退火延伸30s進行40個循環(huán)；溶解曲線為95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后50°C 30s結束反應。溫度轉換率為20°C /s，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測。
[0022](4)建立標準曲線和溶解曲線:建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線；
[0023](5)判斷:若溶解曲線為S型曲線，則表明氣溶膠樣本中含有牛傳染性鼻氣管炎病毒；若溶解曲線為一條直線，貝1J表明氣溶膠樣本中不含有牛傳染性鼻氣管炎病毒。
[0024]本發(fā)明應用熒光PCR對收集到的奶牛場不同環(huán)境中空氣樣品進行檢測，操作簡便、快速，特異性強，靈敏度高，結果可靠，可應用于IBRV病毒氣溶膠的實時監(jiān)測，為牛場IBRV的監(jiān)測與評估、病毒來源和傳播擴散的跟蹤以及感染劑量的檢測提供了有力的技術支持。
[0025] 本發(fā)明的檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，既可用于牛傳染性鼻氣管炎病毒氣溶膠樣本的檢測，也可用于臨床血液、奶樣、組織等樣本的檢測。本發(fā)明的方法可以對規(guī)模化奶牛場環(huán)境中的牛傳染性鼻氣管炎病毒氣溶膠進行實時監(jiān)測，也可用于調查牛傳染性鼻氣管炎病毒持續(xù)感染等相關的基礎研究，具有廣泛的應用前景?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1:SYBRGreen I實時定量PCR方法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒氣溶膠樣本的標準曲線，圖中各點的標準陽性質粒拷貝數(shù)分別對應為1:1.7父106拷貝數(shù)/^1^2:1.7X IO5拷貝數(shù) / μ L ;3:1.7 X IO4 拷貝數(shù) / μ L ;4:1.7 X IO3 拷貝數(shù) / μ L ;5:1.7 X IO2 拷貝數(shù) / μ L ;
6:1.7X IO1 拷貝數(shù)/μ L ;7:1.7X 10° 拷貝數(shù)/μ L。
[0027]圖2 =SYBRGreen I實時定量PCR方法檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒氣溶膠樣本的溶解曲線，其中，空白對照以等量RNaseFreeddH2O代替模板，其他模板為標準陽性質粒分別為1.7X IO6-L 7X10° 拷貝數(shù) /μ L。
[0028]圖3 =SYBRGreen I實時定量PCR方法檢測氣載牛傳染性鼻氣管炎病毒的特異性曲線，其中，1:牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV) ；2:牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) ；3:牛副流感3型病毒(BPIV-3) ；4:牛冠狀病毒(BcoV) ；5:牛輪狀病毒(BRV) ；6:ddH20。
[0029]圖4:SYBRGreen I實時定量PCR方法檢測氣載牛傳染性鼻氣管炎病毒病毒的靈敏度及重復性檢測結果，其中，1:1.7 X IO6拷貝數(shù)/μ L ;2:1.7 X IO5拷貝數(shù)/μ L ;3:1.7 X IO4拷貝數(shù)/uL;4:1.7父103拷貝數(shù)/^1^5:1.7Χ102 拷貝數(shù)/yL;6:1.7 X 10 拷貝數(shù) / μ L ;
7:1.7X10°拷貝數(shù)/ μ L ；8:空白對照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。
[0030]圖5:氣溶膠臨床樣本檢測曲線，其中，1:陽性對照(模板質粒1.7X10拷貝數(shù)/μ L) ；2:氣溶膠樣本I ;3:氣溶膠樣本2 ；4:氣溶膠樣本3 ；5:氣溶膠樣本4 ；6:空白對照(以等量RNaseFreeddH2O代替模板)。 【具體實施方式】
[0031]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0033]下述實施例中所用一些材料和試劑如下:
[0034]MS-1型多功能微生物采樣器(青島眾瑞智能儀器有限公司)；LightCyClers480 II熒光定量PCR儀(羅氏公司);瓊脂糖凝膠回收試劑盒(目錄號:DP209)和高純度質粒小提中量試劑盒(目錄號:DP107)購自天跟生化科技(北京)有限公司；RevertAid?FirstStrandcDNA SynthesisKit (目錄號:K1622)購自 Fermentas 公司；PEASY-T3載體試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(CodeN0.:9766)、SYBRs PremixEx Taq?II (TIiRNaseHPlus)試劑盒(CodeN0.:RR820A)、LATaq (CodeN0.: RR52AG)、TaKaRa Taq (CodeN0.: R001A)、DNAMarker, IPTG、X-gal 均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0035]實施例1引物的設計與合成
[0036]根據(jù)GeneBank中牛傳染性鼻氣管炎病毒gD基因(GenBank:NCOO1847)保守序列，應用PrimerPremier5.0設計全長擴增引物gD_F、gD_R(表1,序列I和序列2,如SEQIDN0.1、2所示)，用于陽性標準質粒的構建；采用PrimerExpress3.0軟件,設計一對特異性引物IBRV-F、IBRV-R(表1，序列3和序列4，SEQIDN0.3、4所示)，用于牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測。
[0037]表1引物寡核苷酸序列引物序列擴增大小
gD-F 5' - GGGCGACTAGAGATACACTCGCC -Y (序列 I)
-- 654bp
[0038]gD-R 5' - GTTTCGAGMCCAGCAGTCC -3'(序列 2)
IBRV-F 5' - ACGGACGACGAGCTGGGACT -3r (序列 3)
--120bp
IBRV-R 5’- CGGCAGCGAAACCATGAAAT -3’(序列 4)
[0039]實施例2建立SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測方法
[0040]( 一 ) SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測方法的建立
[0041]1、待測樣本的制備
[0042]取牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛副流感3型病毒、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒的細胞培養(yǎng)毒200 μ L，參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取病毒DNA/RNA,獲得的病毒 RNA 按照 Fermentas RevertAid?First Strand cDNA SynthesisKit 說明書進行反轉錄。
[0043]2、標準質粒陽性模板的制備
[0044]以步驟I得到的牛傳染性鼻氣管炎病毒的DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為50 μ L:2 XGCBufferI (Mg2+Plus) 25 μ L、2.5mMdNTPMixture8 μ L、LATaq0.5 μ L (5U/ μ L)、模板2 μ L, 10 μ mol/L的gD_F和gD_R基因全長上下游引物各2 μ L,滅菌超純水加至50 μ L。反應程序為94°C預變性3min，然后進入94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，共進行31個循環(huán)；72°C延伸lOmin，最后停止于4°C。
[0045]PCR產物經I %瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至PEAST-T3載體，藍白斑篩選重組質粒，送華大基因進行測序，將測序結果與序列表中的SEQIDN0.5所示的序列進行比對，正確的重組質粒為陽性，將其命名為pEAST-T3-D。
[0046]將pEAST-T3-D質粒作為陽性標準品，用核酸蛋白分析儀(NanoPhotometer?P300)測定質粒濃度，按照下述公式計算出每μ L質粒中的DNA拷貝數(shù)，結果拷貝數(shù)為1.7Χ10-拷貝數(shù)/ μ L。
[0047]質?？截悢?shù)(拷貝/ μ L)=計算方法:(6.02X IO23拷貝數(shù)/摩爾)X (質粒濃度g/ml) / (MWg/mol)，其中:[平均分子量(MWg/mol):dsDNA =(堿基數(shù))X (660道爾頓/堿基)；ssDNA =(堿基數(shù))X (330道爾頓/堿基)；ssRNA =(堿基數(shù))X (340道爾頓/堿基)]°
[0048]3、SYBRGreen I實時熒光定量PCR的擴增條件的確立
[0049]設立引物終濃度梯度為0.2-1.0moI/L,以確定反應的最佳引物濃度；設立溫度梯度為59-68°C，根據(jù)PCR擴增結果，選取最佳退火溫度。以Ct最小值、熒光最高值、溶解曲線顯示只有單特異峰為標準，分別對退火溫度、引物濃度、循環(huán)條件進行優(yōu)化(接下來的步驟4中的各項參數(shù)即為優(yōu)化結果)。
[0050]4、標準曲線的建立
[0051 ] 將質粒PEAST-T3-D按10倍進行倍比稀釋至10°_109拷貝數(shù)/ μ L，將稀釋的拷貝數(shù)作為模板進行SYBRGreen I實時熒光定量PCR擴增，建立標準曲線。擴增反應體系為20 μ L:2X SYBRPremixExTaqII 10 μ L，質粒 pEAST-T3-D2 μ L，濃度為 10 μ mol/L 的上游引物和下游引物(表1中的引物對IBRV-F和IBRV-R)各0.25 μ L, RNaseFreeddH2O補足20 μ L。同時設置空白對照(以等量RNase Free ddH20代替模板)。然后進行標準曲線的擴增，反應程序如下:
[0052]預變性950C 30秒鐘(升溫速率4.4°C /秒)Icycle。
[0053]PCR分析模式:定量分析。
[0054]95 V 5秒鐘(升溫速率4.4 °C /秒)；63 V 30秒鐘(升溫速率2.2 °C /秒，Acquisition Mode:Single)40cycleso
[0055]融解分析模式:溶解曲線。
[0056]95 °C 5秒鐘(升溫速率4.4°C /秒)；65 °C I分鐘(升溫速率2.2 °C /秒)；95 °C (升溫速率 0.11°C / 秒，AcquisitionMode:Continuous, Acquisitions: 5per°C ) lcycle。
[0057]降溫50°C 30秒鐘(升溫速率2.2°C /秒)lcycle。
[0058]標準曲線如圖1所示，各點在一直 線上，表明標準曲線好。
[0059]使用LightCycler* 480 II GeneScanningSoftwareVersion1.5 的 AbsQuant/2ndDerivativeMax分析模式分析，結果各點在一直線上，各參數(shù)值為
[0060]溶解曲線如圖2所示，從圖中可以看出，溶解曲線只有單一的峰出現(xiàn)，沒有引物二聚體或其它非陽性峰出現(xiàn)，為特異性擴增。
[0061]( 二)SYBRGreen I實時熒光定量PCR的特異性試驗
[0062]按照上述步驟建立的SYBRGreen I實時熒光定量PCR方法進行特異性試驗，分別以牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA、牛病毒性腹瀉病毒cDNA、牛副流感3型病毒cDNA、牛冠狀病毒cDNA、牛輪狀病毒cDNA作為模板，以ddH20為陰性對照。
[0063]在530nm激發(fā)光下檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的特異性的結果如圖3所示，從圖中可以看出，I有相應病毒的特異性熒光曲線，而2~6均沒有特異性熒光曲線，證實所設計的引物擴增牛傳染性鼻氣管炎病毒特異性好，與其它檢測毒株無交叉反應。因此以針對gD基因的引物對所建立的SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測方法可用于檢測未知樣本是否有牛傳染性鼻氣管炎病毒核酸的存在。
[0064](三)SYBRGreenI實時熒光定量PCR的靈敏度及重復性試驗
[0065]以10倍系列稀釋液上述制備的pEASY-T3-D質粒，得到拷貝數(shù)為1.7 X IO8-L 7 X 10°拷貝/ μ L的系列稀釋液，將含有不同的質粒拷貝數(shù)的稀釋液作為模板，同時設置一等量RNaseFree ddH20代替模板的空白對照進行SYBRGreen I熒光定量PCR擴增，每個模板濃度做3個重復。其中，SYBRGreen I熒光定量PCR采用上述優(yōu)化后的反應體系和反應條件；
[0066]SYBRGreen I熒光定量PCR檢測，在530nm激發(fā)光下的結果，如圖4所示，牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測1.7 X 10°拷貝仍有較好的熒光曲線，SYBRGreen I熒光定量PCR檢測方法對牛傳染性鼻氣管炎病毒具有較高的靈敏度。
[0067]通過計算Ct值的標準差(S)和變異系數(shù)(CV)來驗證熒光定量PCR的批內重復性，結果顯示,所建立的SYBRGreen I熒光定量PCR方法重復性好。
[0068]另選取一個濃度的pEASY-T3-D質粒DNA作為模板，進行熒光PCR擴增，間隔7d重復一次，共進行3次重復，然后計算Ct值的變異系數(shù)(CV)，驗證熒光定量PCR的批間重復性，結果顯示該方法具有較好的批間重復性。[0069]實施例3、氣溶膠樣本的檢測
[0070](一 )氣溶膠樣品采集
[0071]選擇奶牛場的不同區(qū)域(奶牛舍、運動場、擠奶廳等)，應用MS-1型空氣微生物采樣箱，通過國際標準的全玻璃液體沖擊式采樣器(all-glass-1mpinger,簡稱AGI), Porton采樣器采集空氣樣品。首先安裝三腳架，采樣器放置高度為距地面1.5m，然后將IOmL無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)注入Proton采樣器，同時滴加一滴橄欖油，放入三腳固定支架內固定。將Porton沖擊式穩(wěn)流器的一端接到主機入氣口上，另一端用橡膠管連接到Proton采樣器的出氣口上。采樣流量為12.5L/min，采樣時間為20min。采樣結束后將采樣器內的采集液收集到15mL離心管保存用于檢測。
[0072]( 二)模板DNA制備
[0073]氣溶膠吸收液4°C，12000r/min離心30min，取ImL上清，參照病毒DNA提取試劑盒說明書，提取氣溶膠樣本中的DNA，將所有DNA溶于50 μ L水中，-20 V存儲備用。
[0074](三)臨床氣溶膠樣本的檢測
[0075]待測樣本為山東省不同地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場不同地點收集的氣溶膠樣本，分別制備這些氣溶膠樣本的病毒DNA。以制備的氣溶膠樣本的基因組DNA分別作為模板，按照實施例2中步驟4中建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法進行檢測。若在530nm激發(fā)光下的反應結果為S型曲線，則待測樣本中含有牛傳染性鼻氣管炎病毒；若反應結果為一條直線，則待測樣本中沒有牛傳染性鼻氣管炎病毒。
[0076]檢測結果如下:經測定，在530nm激發(fā)光下，I號陽性對照和4號待檢樣本中出現(xiàn)S型曲線，其余樣本出現(xiàn)直線擴增，表明僅有I號對照和4號樣本中含有牛傳染性鼻氣管炎病毒，如圖5所示。
【權利要求】
1.一種檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，其特征在于:步驟如下: (1)采集氣溶膠樣本； (2)提取氣溶膠樣本的基因組總DNA； (3)檢測:以上述提取的基因組總DNA為模板，采用試劑盒進行SYBRGreenI實時熒光定量PCR，具體如下: 所述試劑盒由特異性引物、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒PEASY-T3-D、SYBRGreen I實時熒光定量PCR試劑和ddH20組成； 所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒PEASY-T3-D是由序列為SEQIDN0.5所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述特異性引物的序列如下:
上游弓 I 物 IBRV-F 為 5' -ACGGACGACGAGCTGGGACT-3'；
下游引物 IBRV-R 為 5’ -CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3’ ； (4)建立標準曲線和溶解曲線:建立陽性標準質粒的標準曲線，以及擴增體系的溶解曲線； (5)判斷:若溶解曲線為S型曲線，貝U表明氣溶膠樣本中含有牛傳染性鼻氣管炎病毒；若溶解曲線為一條直線，則表明氣溶膠樣本中不含有牛傳染性鼻氣管炎病毒。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，采集氣溶膠樣本的方法為:采用全玻璃液體沖擊式采樣器，以IOmLpH值7.0的磷酸鹽緩沖液為采樣介質，按照12.5L/min的采樣流量采集20min，收集氣溶膠樣本。
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，提取基因組總DNA的方法為:將采集到的IOmL氣溶膠樣本在4°C下12000r/min離心30min，取上清液lmL，應用病毒DNA試劑盒提取基因組總DNA。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，PCR的擴增反應體系為20 μ L:2XSYBRPremixExTaqII 10 μ L，模板2 μ L，上游引物和下游引物各0.5 μ L，RNaseFreeddH207 μ L。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測氣溶膠中牛傳染性鼻氣管炎病毒的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，PCR的反應條件為:預變性95 °C 30s，然后按照95°C變性5s、63°C退火延伸 30s 進行 40 個循環(huán)；溶解曲線為 95°C 5s,65°C 60s,95°C Continuous ;最后 50°C 30s 結束反應。溫度轉換率為20°C /s，在每個循環(huán)的延伸結束時進行熒光信號檢測。
6.用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的特異性引物，其特征在于:所述特異性引物的序列如下:
上游弓 I 物 IBRV-F 為 5' -ACGGACGACGAGCTGGGACT-3'；
下游引物 IBRV-R 為 5’ -CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3’。
7.權利要求6所述的特異性引物在制備檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試劑盒中的應用。
8.權利要求6所述的特異性引物在檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒中的應用。
9.一種用于檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒由特異性引物、牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒pEASY-T3-D、SYBRGreen I實時熒光定量PCR試劑和ddH20組成；所述牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質粒PEASY-T3-D是由序列為SEQIDN0.5所示的DNA片段與pEASY-T3載體相連接后得到的重組質粒； 所述特異 性引物的序列如下: 上游弓 I 物 IBRV-F 為 5' -ACGGACGACGAGCTGGGACT-3'； 下游引物 IBRV-R 為 5’ -CGGCAGCGAAACCATGAAAT-3’。
10.權利要求9所述的試劑盒在檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK103981283SQ201410188120
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月6日 優(yōu)先權日:2014年5月6日
【發(fā)明者】何洪彬, 宋玲玲 申請人:山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心