一種嗜熱棲熱菌漆酶及工程菌、重組漆酶和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嗜熱棲熱菌漆酶及工程菌、重組漆酶和應(yīng)用，該嗜熱棲熱菌漆酶的氨基酸序列如Seq?No.2所示。編碼上述漆酶的DNA序列如Seq?No.1所示。該DNA可在構(gòu)建巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用。重組畢赤酵母工程菌是將表達(dá)載體pHKFA1-lacTT線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia?pastoris)獲得。重組漆酶是將上述重組畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵獲得。該重組漆酶具有漆酶活性和耐高溫特性，可在染料脫色中應(yīng)用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脫色作用，脫色率甚至可以達(dá)到100％。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種嗜熱棲熱菌漆酶及工程菌、重組漆酶和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】和環(huán)境生物領(lǐng)域，特別涉及一種嗜熱棲熱菌漆酶基因和該基因工程菌和該基因編碼的漆酶在生物酶法處理紡織廢水中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]漆酶(benzenediol:oxygen oxidoreductases, ECl.10.3.2)是一種含銅的多酌 氧化酶，屬于藍(lán)色多銅氧化酶(MCOs)家族，廣泛分布在植物、真菌、少數(shù)細(xì)菌和昆蟲(chóng)中。漆酶的活性中心一般包含4個(gè)銅離子，漆酶的催化氧化反應(yīng)即通過(guò)銅離子間的協(xié)同傳遞電子，奪取反應(yīng)底物的電子，將底物氧化為自由基形式，同時(shí)將從底物捕獲的電子傳遞給O2，將O2還原為水。漆酶作用的底物相當(dāng)寬泛，典型的底物是各種酚類(lèi)化合物及其衍生物，包括簡(jiǎn)單的二酚、多酚、甲氧基取代酚(如愈創(chuàng)木酚)、氨基酚、氯酚等。在小分子的介體物質(zhì)存在下，漆酶可氧化的底物范圍還將進(jìn)一步擴(kuò)大。由于漆酶具有降解木質(zhì)素與有毒酚類(lèi)物質(zhì)的作用，使得漆酶在工業(yè)上有重要的應(yīng)用價(jià)值，包括工業(yè)染料脫色、土壤和水體的生物除污、紙漿漂白、食品和果汁加工等方面。
[0003]目前研究比較多且深入的漆酶大多是真菌漆酶。但真菌漆酶的工作pH—般在酸性范圍，熱穩(wěn)定性較差，而且對(duì)氯離子比較敏感，在高濃度氯離子環(huán)境下容易失去活性。這些缺點(diǎn)使真菌漆酶在某些工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域受到一定的限制。而細(xì)菌漆酶的工作PH —般在中性到堿性范圍，熱穩(wěn)定性好，且它們中有不少對(duì)氯離子有較高的耐受性。
[0004]印染、紡織工業(yè)的廢水排放量巨大，而且未經(jīng)處理的廢水嚴(yán)重污染環(huán)境。來(lái)自印染、紡織工業(yè)的廢水的pH值一般在中性到堿性，含有高濃度氯化物、金屬離子、表面活性劑和合成染料等復(fù)雜成分。其中高含量的工業(yè)染料可能對(duì)水體生物具有毒性，降低水體能見(jiàn)度，同時(shí)增加水體生物需氧量(BOD)。大部分的工業(yè)染料都難以被微生物降解，使用物理或者化學(xué)方法往往成本高而且效果不佳。生物法，比如利用漆酶、錳過(guò)氧化物酶等，對(duì)一些工業(yè)染料的脫色率高且環(huán)保。
[0005]因此，具有堿性工作pH以及對(duì)高濃度氯化物具有高耐受性的細(xì)菌漆酶在印染、紡織廢水脫色處理中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種來(lái)源于嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus 的漆酶基因。
[0007]本發(fā)明按照畢赤酵母密碼子偏好性對(duì)漆酶基因進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)全基因合成得到該漆酶基因核酸序列，該漆酶基因的核酸序列如Seq N0.1所示，氨基酸序列如Seq N0.2所示。該漆酶基因能夠在畢赤酵母(Pichiapastoris)實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。
[0008]上述漆酶基因在構(gòu)建巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用，將上述漆酶基因及其調(diào)芐基因構(gòu)成的表達(dá)盒整合到畢赤酵母的基因組中，具體包括如下步驟:[0009](I)將權(quán)利要求2所述DNA連入到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pHKFAl，得到表達(dá)載體 pHKFAl-lacTT ；
[0010](2)通過(guò)將表達(dá)載體PHKFAl-1acTT化學(xué)轉(zhuǎn)化E.coli ToplO得到克隆菌株E.coliToplO/pHKFAl-lacTT。
[0011 ] 一種重組畢赤酵母工程菌，將權(quán)利要求5所述表達(dá)載體PHKFAl-1acTT線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)獲得。
[0012]上述重組畢赤酵母工程菌的構(gòu)建方法如下:
[0013]將表達(dá)載體pHKFAl-lacTT經(jīng)Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌(Pichiapastoris)GS115感受態(tài)細(xì)胞，并在MD平板進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選；以MD平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子為模板 ，以TTF和TTR為引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子為重組畢赤酵母工程菌 Pichia pastoris GS115/pHKFAl_lacTT，其中 TTF 和 TTR 的序列如 Seq N0.3、4所示。
[0014]一種重組漆酶，將上述重組畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵獲得。其構(gòu)建方法如下:
[0015]挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養(yǎng)基，30 0C，250rpm培養(yǎng)至OD6tltl接近6.0，于6000rpm，4°C離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始OD6tltl接近1.0，于30°C，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1%甲醇；發(fā)酵六天后在6000rpm，4°C離心5min回收發(fā)酵上清液；用親和層析方法對(duì)發(fā)酵上清液的重組漆酶進(jìn)行純化即可；所述BMMY培養(yǎng)基中含有0.1mM CuSO4。
[0016]上述重組漆酶可在染料脫色中應(yīng)用。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0018](I)本發(fā)明的漆酶具有漆酶活性。同時(shí)還對(duì)獲得的重組漆酶進(jìn)行最適作用pH、pH穩(wěn)定性、最適作用溫度及溫度穩(wěn)定性分析。結(jié)果顯示該重組漆酶的溫度穩(wěn)定性和PH穩(wěn)定性非常好，表明該漆酶具有非常好的耐熱耐堿能力。
[0019](2)本發(fā)明還涉及氯離子對(duì)獲得的重組漆酶的影響分析，結(jié)果顯示該重組漆酶對(duì)氯離子有非常高的耐受性。
[0020](3)本發(fā)明的重組漆酶來(lái)源于嗜熱棲熱菌Thermus thermophilus,在成功地將這個(gè)新發(fā)現(xiàn)的漆酶基因在畢赤酵母中異源表達(dá)的基礎(chǔ)上，對(duì)這個(gè)酶蛋白進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，結(jié)果顯示，該重組漆酶對(duì)堿性環(huán)境和NaCl有較高的耐受性，且具有耐高溫的特點(diǎn)。此外，實(shí)現(xiàn)了該漆酶在生物酶法處理紡織廢水中的應(yīng)用，尤其是偶氮染料和蒽醌染料的脫色作用，脫色率甚至可以達(dá)到100%。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021 ] 圖1為純化漆酶的(a) SDS-PAGE分析及(b)活性染色圖；(a) SDS-PAGE圖譜，其中M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1:加熱變性的純化重組漆酶；2:未經(jīng)加熱變性的純化重組漆酶；(b)活性染色圖，其中M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；1:非變性純化漆酶與底物SGZ發(fā)生顯示反應(yīng)；2:非變性純化漆酶與底物愈創(chuàng)木酚發(fā)生顯示反應(yīng)。
[0022]圖2為純化重組漆酶的(a)最適pH曲線和(b)pH穩(wěn)定性曲線。
[0023]圖3為純化重組漆酶的最適溫度曲線和溫度穩(wěn)定性曲線。
[0024]圖4為不同濃度的NaCl對(duì)純化重組漆酶的影響。[0025]圖5為純化重組漆酶在磷酸鈉緩沖液pH7.5 (剛果紅脫色pH環(huán)境是pH8.0)對(duì)3種偶氮類(lèi)和一種蒽醌類(lèi)染料的脫色作用。
[0026]圖6為漆酶脫色處理前后四個(gè)合成染料的全波長(zhǎng)掃描分析:(a)RB5 ； (b) RBffNN ；(c)RBBR ； (d) CR。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0028]實(shí)施例1
[0029]新型漆酶基因的合成
[0030]以美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上公布的GenBand:YP_005641270.1氨基酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)該序列按照畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，得到新型漆酶基因，其序列如SEQ ID N0.1所示，通過(guò)生物技術(shù)公司(南京金斯瑞生物科技有限公司)全基因合成，合成的基因克隆在PUC57質(zhì)粒(購(gòu)自金斯瑞生物科技公司)上，得到質(zhì)粒pUC57-lacTT。
[0031]實(shí)施例2
[0032]含新型漆酶基因的重組質(zhì)粒pHKFAl-lacTT及攜帶該質(zhì)粒的菌株E.coli ToplO/pHKFAl-lacTT 的構(gòu)建 [0033]根據(jù)新型漆酶基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)PCR引物:正向引物TTF:5’ -GGAATTCAATACCGATAGAAGAACCCT-3’ (下劃線為 EcoRI 酶切位點(diǎn))和反向引物 TTR:5’ -ATTTGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTG TCCGACTTCCAAAACTCC-3’(下劃線為 NotI 酶切位點(diǎn)，同時(shí)含有8 X His標(biāo)簽和終止密碼子)。
[0034]以實(shí)施例1中的質(zhì)粒pUC57_lacTT為模板，TTF和TTR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將膠回收純化后的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，與同樣經(jīng)過(guò)EcoRI和NotI雙酶切的質(zhì)粒pHKFAl用T4連接酶16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化E.coli ToplO (購(gòu)自美國(guó)Invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)，經(jīng)卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切鑒定正確后，得到重組質(zhì)粒pHKFAl-lacTT。含有正確重組質(zhì)粒pHKFAl-lacTT的克隆菌株E.coli ToplO/pHKFAl-lacTT加15%甘油于_80°C保存。
[0035]實(shí)施例3
[0036]新型漆酶生產(chǎn)菌株P(guān)ichia pastoris GS115/pHKFAl_lacTT的構(gòu)建及重組漆酶表達(dá)
[0037]將重組質(zhì)粒pHKFAl-lacTT經(jīng)Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化Pichiapastoris GS115(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen英杰生命技術(shù)有限公司)感受態(tài)細(xì)胞,并在MD平板進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選。以MD平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子為模板，以TTF和TTR為引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子初步鑒定為新型漆酶生產(chǎn)菌株P(guān)ichia pastoris GS115/pHKFAl-lacTT。
[0038]挑取3個(gè)PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子接種到BMGY培養(yǎng)基，30°C，250rpm培養(yǎng)至OD6tltl接近6.0，于6000rpm，4°C離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到BMMY培養(yǎng)基(含有
0.1mM CuSO4)至起始0D_接近1.0，于30°C，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1%甲醇。發(fā)酵六天后在6000rpm,4°C離心5min回收發(fā)酵上清液。用親和層析方法對(duì)發(fā)酵上清液的重組漆酶進(jìn)行純化。純化方法參照HisTrap? FF crudelmL (GE Healthcare, Sweden)操作指南。經(jīng)純化的重組漆酶在4°C保存。
[0039]實(shí)施例4
[0040]純化的重組漆酶LacTT的酶學(xué)性質(zhì)
[0041]漆酶酶活的測(cè)定方法:
[0042]以愈創(chuàng)木酚(ε 465 = UOOOM' cnT1)為底物，ImL反應(yīng)混合液中，含100 μ L愈創(chuàng)木酚(終濃度 2mmol/L)，100 μ L 酶液，10 μ L CuSO4 (終濃度 10 μ mol/L)，790 μ L0.lmol/L 磷酸鈉緩沖液(PH7.5)，90°C水浴保溫反應(yīng)5min后，冰浴60s終止反應(yīng)，465nm處測(cè)定吸光度。其他用于漆酶活力分析的底物還有ImMABTS ( ε 420 = 36000M^.cm^1) > 100 μ M SGZ ( ε 525 =65000ΜΛ cnT1)和 2mM2, 6-DMP ( ε 468 = 49600Μ' cnT1)。
[0043]漆酶酶活力定義:以Imin內(nèi)催化氧化I μ mo I底物的量為I個(gè)酶活單位(U)。
[0044]漆酶活力計(jì)算公式:酶活(U/L) = nXVtXA/( ε X5XVe/106) ；n:酶液稀釋倍數(shù)；A:吸光度的變化值；Vt:酶反應(yīng)液的總體積?酶反應(yīng)液中酶液體積；ε:摩爾吸光系數(shù)。
[0045]最適pH和pH穩(wěn)定性:以ABTS、SGZ、愈創(chuàng)木酚為底物，在90°C下測(cè)定LacTT在ρΗ3.0-10.0 (Britton - Robinson 緩沖液)之間酶活的變化。將 LacTT 置于 ρΗ3.0-11.0 的Britton - Robinson緩沖液中，4°C下處理14h后取出，在pH7.5, 90°C條件下測(cè)定被處理后的LacTT的酶活力，同時(shí)以等量未經(jīng)處理的酶液作為正對(duì)照，活力設(shè)為100%。以ABTS、SGZ、愈創(chuàng)木酚和2，6-DMP為底物，測(cè)定LacTT在pH3.0-10.0范圍下的酶活力，結(jié)果顯示LacTT作用于ABTS、SGZ、愈創(chuàng)木酚和2，6-DMP的最適pH分別是4.5,6.0、7.5和8.0(圖2a)，而且，LacTT在pH3.0-11.0環(huán)境下非常穩(wěn)定，在經(jīng)過(guò)14h處理后酶活力仍然可以保持90%以上(圖2b)，顯示出LacTT對(duì)堿性環(huán)境有較高的耐受性。
[0046]最適溫度和溫度穩(wěn)定性:將LacTT在pH7.5條件下，以2mM愈創(chuàng)木酚為底物，測(cè)定其在40°C -100°C范圍內(nèi)的酶活力變化。將LacTT分別在40°C _95°C處理Ih后取出后冰浴，并在pH7.5，90°C條件下測(cè)定被處理后的LacTT的酶活力，同時(shí)以等量未經(jīng)處理的酶液作為正對(duì)照，活力設(shè)為100%。結(jié)果顯示，以愈創(chuàng)木酚為底物時(shí)LacTT的最適溫度高達(dá)90°C，而且在高溫范圍70-100°C可以保持70%以上的酶活力(圖3)。而且LacTT有較高的熱穩(wěn)定性，即使在95°C處理lh，仍然可以保持90%以上的酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分表明重組漆酶具有耐聞溫的優(yōu)點(diǎn)。
[0047]不同濃度的NaCl對(duì)純化漆酶的影響:在不同濃度的NaCl (0-2000mM)存在的條件下，以2mM愈創(chuàng)木酚為底物，測(cè)定LacTT在pH7.5，90°C條件下酶活力變化。結(jié)果顯示，在0-500mM的范圍內(nèi)，NaCl對(duì)LacTT不同程度的激活作用，而隨著NaCl濃度繼續(xù)升高，LacTT酶活力漸漸受到抑制，在L 5MNaCl存在下，LacTT的剩余酶活力仍有70% (圖4)。相對(duì)于其他已發(fā)現(xiàn)的漆酶，LacTT顯示出非常高的對(duì)NaCl的耐受性。
[0048]實(shí)施例5
[0049]純化的重組漆酶LacTT對(duì)3種偶氮染料和I種蒽醌染料的脫色效率測(cè)定
[0050]反應(yīng)體系為2mL，染料濃度為50mg/L，漆酶濃度為40U/L，CuSO4濃度為100 μ M，反應(yīng)溫度為70°C，50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.5，剛果紅脫色環(huán)境為pH8.0)。作用24h后，在不存在任何介體的條件下，該漆酶對(duì)偶氮染料Reactive Black5(RB5)、Reactive BlackWNN(RBffNN) ,Congo Red (CR)和蒽醌染料 Remazol Brilliant Blue R(RBBR)的脫色率分別為94%、93%、100%和73% (圖5)，而對(duì)脫色過(guò)程中脫色樣品的全波長(zhǎng)掃描分析發(fā)現(xiàn)，隨著漆酶處理時(shí)間增加，RB5和RBWNN在其最高吸收峰595nm附件的吸收值逐漸降低，但在516nm處重新形成新的峰，可能是由于RB5和RBWNN的某些發(fā)色基團(tuán)沒(méi)有被漆酶氧化去除(圖6a，圖6b)。RBBR的最高吸收峰為594nm，隨著漆酶處理時(shí)間增加，其594nm處的吸收值降低，反應(yīng)24h后594nm的吸收峰仍然存在，LacTT對(duì)RBBR的脫色并不完全(圖6c)。CR的最高吸收峰為488nm，隨著漆酶處理時(shí)間增加，其在488nm處的吸收值降低，在反應(yīng)24h后CR基本被LacTT完全降解，脫色率達(dá)到100% (圖6d)。
[0051]上 述結(jié)果表明該漆酶對(duì)某些偶氮染料和蒽醌染料具有良好的脫色效果。
【權(quán)利要求】
1.一種嗜熱棲熱菌漆酶，其特征在于，其氨基酸序列如Seq N0.2所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述漆酶的DNA，其特征在于，序列如SeqN0.1所示。
3.權(quán)利要求2所述DNA在構(gòu)建巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求2所述DNA及其調(diào)芐基因構(gòu)成的表達(dá)盒整合到畢赤酵母的基因組中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: (1)將權(quán)利要求2所述DNA連入到巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pHKFAl，得到表達(dá)載體pHKFAl-lacTT ； (2)通過(guò)將表達(dá)載體pHKFAl-lacTT化學(xué)轉(zhuǎn)化Ε.coli ToplO得到克隆菌株E.coliToplO/pHKFAl-lacTT。
6.一種 重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，將權(quán)利要求5所述表達(dá)載體pHKFAl-lacTT線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris)獲得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，其構(gòu)建方法如下: 將表達(dá)載體pHKFAl-lacTT經(jīng)Kpn2I單酶切線性化并純化后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母工程菌(Pichiapastoris) GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，并在MD平板進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選；以MD平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子為模板，以TTF和TTR為引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定正確的轉(zhuǎn)化子為重組畢赤酵母工程菌 Pichia pastoris GS115/pHKFAl_lacTT，其中 TTF 和 TTR 的序列如 Seq N0.3、4所示。
8.—種重組漆酶，其特征在于，將權(quán)利要求6或7所述重組畢赤酵母工程菌進(jìn)行發(fā)酵獲得。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組漆酶，其特征在于，其構(gòu)建方法如下: 挑取重組畢赤酵母工程菌接種到BMGY培養(yǎng)基，300C，250rpm培養(yǎng)至0D_接近6.0，于6000rpm, 4°C離心5min收集細(xì)胞，然后將收集的細(xì)胞重懸到BMMY培養(yǎng)基至起始OD6tltl接近1.0，于30°C，250rpm震蕩培養(yǎng)，每天補(bǔ)加終濃度1%甲醇；發(fā)酵六天后在6000rpm，4°C離心5min回收發(fā)酵上清液；用親和層析方法對(duì)發(fā)酵上清液的重組漆酶進(jìn)行純化即可；所述BMMY培養(yǎng)基中含有0.1mM CuSO4。
10.權(quán)利要求8或9所述重組漆酶在染料脫色中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/53GK104004721SQ201410188145
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】林影, 劉慧平, 梁書(shū)利, 韓雙艷, 鄭穗平 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)