雙羰基還原酶、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雙羰基還原酶、其編碼基因及應(yīng)用。該雙羰基還原酶具有下列之一的氨基酸序列：1)SEQ?NO.1的氨基酸序列；2)將SEQ?NO.1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有將立體選擇性地還原為功能的由SEQ?NO.1衍生的氨基酸序列，且SEQ?NO.1衍生的氨基酸序列與SEQ?NO.1具有80％以上的同源性，其中，R1選自芳香基、烷基、環(huán)烷基、烷基取代的芳香基、鹵素取代的芳香基、芳烷雜環(huán)基、環(huán)狀雜烷基或環(huán)狀雜烷化烷基，R2選自烷基、環(huán)烷基、鹵烷基或鹵環(huán)烷基。采用本發(fā)明的雙羰基還原酶可以一步還原二酮底物，制備得到單一光學(xué)純度的3R，5S-二羥基化合物。
【專利說(shuō)明】雙羰基還原酶、其編碼基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物催化合成【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種雙羰基還原酶、其編碼基因及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]手性醇是一類重要的中間體化合物，廣泛應(yīng)用于手性藥物和其他手性精細(xì)化學(xué)品的合成。3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸叔丁酯是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的抑制劑他汀類降血脂藥物的關(guān)鍵手性中間體，可以通過(guò)化學(xué)合成和生物催化合成的方法制得。然而，通過(guò)化學(xué)合成3R，5S-雙羥基產(chǎn)物存在下列問(wèn)題:一般需用手性金屬催化劑，生產(chǎn)成本高；產(chǎn)物的光學(xué)純度較難達(dá)到要求；大量使用有機(jī)溶劑，造成環(huán)境污染嚴(yán)重。
[0003]采用生物催化合成這類化合物是一種有效的方法，即將含有羰基的底物通過(guò)特定的酶催化還原為相應(yīng)的手性醇。Wolberg等利用細(xì)菌Lactobacllus brevis將一種β,S-雙羰基底物中的δ-羰基還原成δ-羥基，ee為98.1% ;去氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)能夠以乙醛和氯乙醛為底物，通過(guò)兩步醛縮反應(yīng)同時(shí)引入兩個(gè)手性中心得到3R，5S-雙羥基產(chǎn)物，ee>99.9%, de = 96.6%，但去氧核糖-5-磷酸醛縮酶催化反應(yīng)生產(chǎn)成本較高。Guo等利用Acinetobacter species SC13874還原制備得到3R, 5S-二羥基_6_節(jié)氧基-己酸酯，但de = 63.3%。也有報(bào)道腈基水解酶通過(guò)對(duì)3-羥基戊二腈去對(duì)稱化得到單羥基中間體R-4氰基-3-羥基丁酸，再經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)得到3R，5S- 二羥基-6-芐氧基-己酸酯。可見(jiàn)，通過(guò)生物催化方法合成3R，5S-雙羥基產(chǎn)物的現(xiàn)有技術(shù)也仍存在一些技術(shù)問(wèn)題:腈水解酶反應(yīng)路線較長(zhǎng)難度較大，成本較高；Wolberg等利用細(xì)菌Lactobacllus brevis合成方法中需用其他方法引入另一個(gè)手性中心；利用去氧核糖-5-磷酸醛縮酶(DERA)合成方法中需要用酶量較大，底物抑制作用很強(qiáng)并且初始反應(yīng)原料為易燃易爆試劑，工業(yè)化生產(chǎn)難度較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種雙羰基還原酶、其編碼基因及應(yīng)用，以簡(jiǎn)化3R，5S- 二羥基化合物的合成步驟，降低生產(chǎn)污染和生產(chǎn)成本。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種雙羰基還原酶。該雙羰基還原酶具有下列之一的氨基酸序列:1)SEQ N0.1的氨基酸序列:MTATITKVTVLGTGVLGSQIAFQTAYSGFDVVAYDIDDAALDKAKTRFDGLVQTYREEVAGAADGKAEDARSRIRLTADLADAVREADLVIEAIPEVLKIKIDTYTQLGKLAPPSTIFATNSSTLLPSDMKDATGRPDRFLALHFANRVWTFNTAEVMGTADTDPEVFRTVVRFAEDIGMVPIELHKEKAGYVLNSLLVPFLNAAGELVADGYAEPETVDKTWKIATGAPMGPFQIFDIIGLTTPYNISVHGDAAAQRFAAFLKENYIDKGKLGIATGEGFYKYPGK ；2)將 SEQ N0.1 的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加且具有將
【權(quán)利要求】
1.一種雙羰基還原酶，其特征在于，具有下列之一的氨基酸序列: 1)SEQ N0.1的氨基酸序列；2)將SEQN0.1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加且具有將
2.權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，具有下述之一的脫氧核苷酸序列: 1)SEQ N0.2的脫氧核苷酸序列；2)與SEQN0.2的脫氧核苷酸序列具有80%同源性且編碼的蛋白質(zhì)具有將
4.含有權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶的編碼基因的重組表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶的編碼基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶的編碼基因的轉(zhuǎn)基因重組菌。
7.如權(quán)利要求1所述的雙羰基還原酶在將
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述雙羰基還原酶在制備3R，5S-二羥基-6-芐氧基-己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述為
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK103937760SQ201410188169
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月6日
【發(fā)明者】洪浩, 詹姆斯·蓋吉, 陳朝勇, 周炎, 高峰, 呂彤, 郭麗娜 申請(qǐng)人:凱萊英醫(yī)藥集團(tuán)（天津）股份有限公司, 凱萊英生命科學(xué)技術(shù)(天津)有限公司, 天津凱萊英制藥有限公司, 凱萊英醫(yī)藥化學(xué)（阜新）技術(shù)有限公司, 吉林凱萊英醫(yī)藥化學(xué)有限公司